Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Фрагментация ДНК в естественных условиях 13
1.2. Искусственная фрагментация ДНК
1.2.1. Фрагментация ДНК под действием ферментов или химических реагентов 18
1.2.2. Физические способы фрагментации ДНК
1.2.1.1. Механическая фрагментация ДНК 21
1.2.1.2. Прочие физические способы фрагментации ДНК 24
1.2.3. Свойства молекул ДНК, влияющие на характер ее фрагментации под действием физических факторов 26
1.3. Выделение короткоцепочечных ДНК 29
1.4. Методы анализа короткоцепочечных ДНК
1.4.1. Сложности при работе с короткоцепочечными ДНК 34
1.4.2. Амплификация короткоцепочечных ДНК
1.4.2.1. Дизайн праймерных систем 39
1.4.2.2. Амплификация, опосредованная лигированием 42
1.4.3. Секвенирование короткоцепочечных ДНК 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 47
2.1. Реактивы и материалы, использованные в работе 47
2.2. Олигонуклеотиды, использованные в работе 50
2.3. Выделение ДНК 59
2.4. Подготовка ДНК-матриц 62
2.5. Амплификация ДНК 64
2.6. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот 66
2.7. Секвенирование нуклеотидных последовательностей
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Ультразвуковая фрагментация ДНК 72
3.1.1. Влияние длины молекул и динуклеотидов 5 -CG-3 на скорость ультразвуковой фрагментации ДНК 77
3.1.2. Оценка сиквенс-специфичности ультразвуковой фрагментации ДНК с помощью ПНР 81
3.2. Полимеразная цепная реакция со сближенными праймерами 90
3.2.1. Дизайн праймерных систем и оценка специфичности ПНР со сближенными праймерами 90
3.2.2. Димеризация сближенных праймеров в ПЦР 96
3.2.3. Преимущества ПЦР со сближенными праймерами 102
3.2.4. Оценка чувствительности ПНР с праймерами "встык" 108
3.2.5. Демонстрация преимуществ ПЦР с праймерами встык для амплификации разрушенной ДНК 112
Заключение 118
Выводы 122
Список цитированной литературы
- Фрагментация ДНК под действием ферментов или химических реагентов
- Олигонуклеотиды, использованные в работе
- Влияние длины молекул и динуклеотидов 5 -CG-3 на скорость ультразвуковой фрагментации ДНК
- Преимущества ПЦР со сближенными праймерами
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы исследования. В живой клетке постоянно протекают процессы изменения и разрушения молекул ДНК, однако система репарации в норме исправляет возникающие повреждения. После гибели клетки процесс деградации ДНК становится необратимым: с течением времени она постепенно разрушается сначала до крупных фрагментов под действием нуклеаз и микроорганизмов, а затем и до мелких (длиной до нескольких десятков пар оснований) обломков за счет уже не только биологических факторов, но и физических (высокая температура, излучения) и химических (кислый pH, соли, высокая влажность, кислород воздуха) воздействий (Dabney et al., 2013a).
В последние годы появились данные, что расщепление цепей ДНК до мелких обломков происходит не случайным образом, а преимущественно по определенным нуклеотидным сайтам. В некотором приближении деградацию ДНК в естественных условиях моделирует ее фрагментация ультразвуком, которая ввиду простоты и удобства находит достаточно широкое применение в современных методах исследования генома как важнейший этап пробоподготовки. Ранее считалось, что ультразвуковое разрушение ДНК носит случайный характер (Elsner, Lindblad, 1989), однако по мере накопления новых данных пришло понимание неверности этого убеждения (Гроховский, 2006, Poptsova et al., 2014). Несмотря на достаточно активное использование ультразвуковой фрагментации в научных исследованиях, слабо изученным остается ряд вопросов, связанных с применимостью механически фрагментированной ДНК при проведении ряда молекулярно-биологических исследований. Кроме того, значительный интерес представляет изучение биологических объектов, подвергнувшихся воздействию факторов окружающей среды и содержащих ДНК, мало пригодную для амплификационного анализа из-за фрагментации и модификаций азотистых оснований. ДНК из подобных биопрепаратов часто характеризуется также низкой копийностью целевой мишени и наличием фоновой ДНК, поэтому обнаружение специфичных нуклеотидных последовательностей становится нетривиальной задачей, требующей методических отклонений от традиционных подходов.
Как правило, обнаружение специфичных фрагментов ДНК осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая является основой современных методов молекулярной диагностики различных заболеваний (Burtis et al., 2013), анализа объектов окружающей среды (Saito et al., 2014) и продуктов
питания (Chaouachi et al., 2013), вносит важный вклад при проведении
расследований в экспертно-криминалистической деятельности (Brettell et al., 2011,
Johnson et al., 2014). Однако использование классической ПЦР для амплификации
разрушенной ДНК не всегда приводит к желаемому результату. Учитывая
предпочтительность амплификации коротких фрагментов при работе с
разрушенной ДНК, наиболее очевидным решением является использование в ПЦР
максимально сближенных праймеров. Однако имеются лишь единичные
методические работы, посвященные изучению особенностей амплификации ДНК с
помощью сближенных праймеров (Ahmad, Ghasemi, 2007); детальных
исследований ранее не проводилось. Кроме того, предпочтительность
расщепления ДНК по определенным нуклеотидным сайтам диктует
необходимость выявления нуклеотидных последовательностей, которые в меньшей степени подвержены разрушению под действием различных факторов и, тем самым, лучше сохраняются в биоматериалах и обеспечивают более эффективную их амплификацию.
Цель исследования - определение размера и состава нуклеотидных последовательностей, оптимальных для эффективной амплификации разрушенной ДНК, и выявление особенностей ПЦР-амплификации ДНК с использованием сближенных праймеров.
Основные задачи исследования:
-
оценить влияние длины молекул и нуклеотидной последовательности на характер фрагментации ДНК под действием ультразвука;
-
изучить зависимость скорости ультразвуковой фрагментации ДНК от природы нуклеотидной последовательности;
-
оценить специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции со сближенными праймерами и устойчивость ПЦР-системы к ингибиторам;
-
провести оптимизацию протокола ПЦР-эксперимента со сближенными праймерами и продемонстрировать преимущества использования сближенных праймеров при ПЦР-амплификации разрушенной ДНК.
Научная новизна исследования. Впервые исследована фрагментация ДНК под действием ультразвука на ДНК-ампликонах. Для изучения влияния природы нуклеотидной последовательности на ультразвуковое расщепление ДНК впервые предложено использовать количественный метод – полимеразную цепную
реакцию в режиме реального времени. Показано, что молекулы ДНК менее 160 п.о. практически не разрушаются ультразвуком, а в тотальной ДНК лучше всего фрагментируются участки, содержащие в среднем один динуклеотид 5'-CG-3' на 14-15 нуклеотидов цепи. Впервые изучены методические аспекты полимеразной цепной реакции со сближенными праймерами. Показано, что такое расположение праймеров обеспечивает бльшую чувствительность ПЦР, успешное протекание амплификации в присутствии ингибиторов и позволяет уменьшить время реакции в 2-3 раза. ПЦР со сближенными праймерами, особенно с праймерами "встык", характеризуется полным отсутствием неспецифических продуктов амплификации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные о
предпочтительности разрушения ДНК под действием ультразвука могут учитываться при использовании методов исследования генома, в которых в качестве этапа пробоподготовки применяется ультразвуковое облучение. Преимущества использования в ПЦР систем сближенных праймеров могут быть приняты во внимание при планировании работ с фрагментированными нуклеиновыми кислотами, например, при анализе древней ДНК или генетического материала, выделенного из криминалистических образцов.
Методология и методы исследования. Методология исследования основывается на использовании системного подхода с применением методов молекулярной биологии, статистики, а также на анализе данных отечественной и зарубежной литературы. Основные методы исследования включали: выделение тотальной ДНК, подбор нуклеотидных последовательностей и химический синтез праймеров, подготовку ДНК-матриц, полимеразную цепную реакцию, в том числе в режиме реального времени, электрофоретическое разделение продуктов ПЦР в гелях, молекулярное клонирование и секвенирование по Сэнгеру, выполненных с использованием современного оборудования.
Положения, выносимые на защиту
1. Молекулы ДНК размером менее одной персистентной длины (около 50 нм) не
подвергаются фрагментации ультразвуком с частотой до 60 кГц.
Определяющим фактором при ультразвуковой фрагментации
короткоцепочечных ДНК являются конформационно-динамические свойства молекул; влияние динуклеотидов 5’-CG-3’ второстепенно.
-
Расположение динуклеотидов 5’-CG-3’ существенно влияет на характер ультразвуковой фрагментации длинноцепочечной ДНК. Лучше всего разрушаются последовательности с равномерным распределением и средней плотностью 5'-CG-3' (в среднем один 5'-CG-3' на 14-15 нуклеотидов цепи), поэтому для амплификации механически деградированной ДНК наиболее оптимальным является выбор нуклеотидных последовательностей длиной около 100 п.о. из областей, не содержащих динуклеотиды 5'-CG-3' или из областей с высокой их плотностью.
-
При качественном подборе нуклеотидных последовательностей сближенных праймеров, обеспечивающем отсутствие их гомо- и гетеродимеров, достигается абсолютная специфичность и высокая (обнаружение единичных копий) чувствительность ПЦР-амплификации ДНК.
-
Сближенное расположение праймеров позволяет сократить продолжительность ПЦР-амплификации в несколько раз за счет уменьшения температурного диапазона и длительности этапов реакции и обеспечивает более низкую чувствительность реакционной системы к ингибиторам ПЦР.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов подтверждается использованием современных методов молекулярной
биологии и статистических подходов. Для интерпретации и анализа полученных
результатов привлечено достаточное количество данных литературы (218
источников). Выводы объективно и полноценно отражают результаты
проведенных исследований. Материалы диссертации были представлены на
Всероссийской конференции с международным участием "Биотехнология – от
науки к практике" (Уфа, 2014), XXVII и XXIX зимней молодежной научной школе
"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии"
(Москва, 2015, 2017), 19-ой и 20-ой Международной Пущинской Школе-
конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2015, 2016), II
Всероссийской молодежной научной конференции "Фундаментальные и
прикладные аспекты современной биологии " (Томск, 2015), Всероссийской
научной конференции "Актуальные вопросы фундаментальной и
экспериментальной биологии" (Уфа, 2016).
Личный вклад автора в проведенные исследования. Направление диссертационной работы, цель и задачи исследования определены автором совместно с научным руководителем, к.б.н. Гарафутдиновым Р.Р. Соискатель
самостоятельно изучил зарубежную и отечественную литературу по теме диссертации, написал рукопись данной работы. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с научным руководителем и соавторами. Автор принимал участие в планировании и осуществил экспериментальную и аналитическую часть работы. Выделение ДНК, полимеразная цепная реакция, фрагментация ДНК, анализ результатов ПЦР в реальном времени, клонирование, статистическая обработка результатов выполнены автором лично.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Диссертационная работа "Фрагментация ДНК ультразвуком и ее ПЦР-амплификация с помощью сближенных праймеров" соответствует паспорту специальности 03.01.03 – Молекулярная биология. В работе исследовано влияние природы нуклеотидной последовательности на эффективность фрагментации ДНК под действием ультразвука и показано влияние удаления праймеров на протекание ПЦР-амплификации ДНК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 218 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 147 страницах, содержит 32 рисунка и 7 таблиц.
Автор выражает благодарность и признательность научному руководителю, зав. лабораторией физико-химических методов анализа биополимеров ИБГ УНЦ РАН, к.б.н. Гарафутдинову Р.Р. за выбор направления и помощь в проведении исследований, обсуждении и интерпретации результатов. Автор благодарен сотрудникам лаборатории физико-химических методов анализа биополимеров за помощь при выполнении исследовательской работы. Исследования были выполнены при частичной поддержке Программы поддержки ведущих научных школ РФ – НШ-5923.2014.4. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП "Биомика" и УНУ "КОДИНК" (ИБГ УНЦ РАН).
Фрагментация ДНК под действием ферментов или химических реагентов
На сегодняшний день описано несколько способов механической фрагментации ДНК, отличающихся принципом действия. Каждый из них может быть использован в зависимости от особенностей проводимого исследования. Главной причиной механического разрушения молекул ДНК в водном растворе является гидродинамический удар, который в свою очередь может возникнуть вследствие различных процессов, ведущих к локальным перепадам давления в жидкости из-за изменений скоростей ее потока.
В 1962 году был опубликован метод фрагментации ДНК с использованием медицинского шприца, где возникающие гидродинамические процессы при продавливании раствора через иглу способствовали ее дроблению (Freifelder, Davison, 1962). Данный принцип фрагментации стал основой для "гидроножниц" (Hydroshear), с помощью которых экспериментатор за короткий промежуток времени может получить фрагменты необходимой длины (1.5-8 Кб) с минимальной потерей образца (Oefher et al., 1996, Thorstenson et al, 1998). Еще один способ фрагментации описан Adam и Zimm, в котором механическое дробление ДНК происходит в растворе, заключенном между внешним стационарным и внутренним вращающимся цилиндрами ДНК (Adam, Zimm, 1977).
Относительно недавно предложен микрофлюидный чип для фрагментации ДНК, так же основанный на принципе гидродинамического удара. С помощью устройства возможно получение фрагментов различной длины путем применения гидросистемы низкого давления ( 1 бар). Раствор ДНК пропускается через относительно крупные микрожидкостные каналы, в которых расположены более узкие перетяжки. В местах перетяжек создаются потоки с большими градиентами скоростей у входа сужения. Длинные перетяжки (100 мкм) дают более короткие фрагменты по сравнению с более короткими перетяжками (10 мкм) (Shui et al., 2011). Позже были описаны способы фрагментации ДНК в малых объемах (менее 10 мкл) в микрофлюидных чипах (Tseng et al., 2012, Okabe, Lee, 2014).
Способ фрагментации посредством небулизации (от лат. nebula — туман, облако) также использует принцип гидродинамического удара (Lentz et al, 2005), возникающего за счет продавливания раствора ДНК через узкий канал под высоким давлением. Попадание раствора ДНК в узкий канал приводит к резкому увеличению скорости движения жидкости, и при выходе во внутреннее пространство устройства раствор ДНК превращается в аэрозоль. Небулайзеры Life Tech (Grand Island) фрагментируют ДНК до размеров в 100-3000 п.о. за секунды. Преимущества метода в том, что он не требует больших количеств материала и объемов растворов, дешев, прост и быстр в исполнении (Surzycki, 2003, Sambrook, Russell, 2006). К недостаткам можно отнести довольно большие потери ДНК (до 30%) во время образования ДНК-тумана, поэтому использование небулайзеров не рекомендуется при ограниченном количестве стартового материала. Небулизация впервые была использована геномными секвенаторами Roche 454 и Illumina. Данный метод стал менее популярен с появлением приборов Covaris с адаптивной сфокусированной акустической системой, которая давала возможность получения фрагментов в задаваемом диапазоне размеров (100-3000 п.о.) посредством акустических кавитаций.
В настоящее время для фрагментации ДНК наиболее часто используется метод ультразвукового облучения. В данном подходе гидродинамический удар возникает вследствие акустической кавитации (от лат. cavita — пустота) (Suslick, Price, 1999, Lee et al., 2005). Пузырьки газа образуются при локальных перепадах давления в жидкости из-за изменений скорости ее движения, т.е. при прохождении звуковых волн большой интенсивности (Fuciarelli et al, 1995, Miller, Thomas, 1996). Кавитационные пузырьки образуются в основном около микропримесей, имеющихся в растворе, в качестве которых могут выступать и молекулы ДНК (Lentz et al., 2006). Таким образом, молекулы ДНК оказываются в непосредственной близости возникновения гидродинамического удара. В момент схлопывания внутри кавитационных пузырьков развиваются высокие температура и давление (Маргулис, 1984, Didenko et al, 1999, McNamara et al., 1999), скорости микропотоков воды могут достигать 700 м/с (Suslick, Price, 1999). Воздействие на молекулу ДНК микропотока воды с такой скоростью даже в течение около десяти пикосекунд окажется достаточным для локальных конформационных движений сахарофосфатного остова молекулы ДНК (Pan, MacKerell 2003, Kalodimos et al., 2004). К тому же, энергия, освободившаяся в результате удара превышает энергию связи смежных нуклеотидов и приводит к расщеплению фосфодиэфирных связей с образованием выступающих или же тупых концов. В целях фрагментации ДНК под воздействием ультразвука были созданы специальные устройства. Например, инструмент Covaris (США) - акустическое устройство для разрушения ДНК на фрагменты размером от 100 до 5000 п.о.; Bioruptor (Бельгия) - устройство, в котором ультразвуковой соникатор используется для разрушения хроматина, ДНК, а также тканей. ДНК можно фрагментировать в нем в малых объемах до размеров 150-1000 п.о.
В дополнение к перечисленным выше методам для фрагментации ДНК используется также ряд других физических воздействий. Одними из них являются электромагнитные волны различной длины и, соответственно, разной энергии. Чем короче длина волны, тем больше ее энергия и тем разрушительнее воздействие.
Показана успешность применения микроволновых технологий для преодоления некоторых ограничений существующих методов фрагментации ДНК (Yang, Hang, 2013). Возможность применения фрагментации под действием микроволнового излучения продемонстрирована на геномной ДНК различных размеров (ДНК плазмиды pUC19, бактериофага X, Е. coli, человека). Оказалось, что использование микроволнового излучения разной интенсивности приводит к образованию фрагментов разных размеров, а воздействие микроволновой энергии на ДНК коррелирует с температурой. Так, повышение температуры привело к уменьшению размеров образуемых фрагментов, тогда как увеличение времени воздействия от нескольких минут до нескольких часов при температуре 95С показало отсутствие или незначительное усиление фрагментации ДНК (Yang, Hang, 2013).
Олигонуклеотиды, использованные в работе
Современный прогресс в области исследования ДНК обусловлен в том числе усовершенствованием методологической базы, и значимым явилась возможность секвенирования короткоцепочечных ДНК. Получение пула фрагментов ДНК с близкими размерами стало приоритетом при разработке способов секвенирования нового и новейшего поколений (Margulies et al., 2005, Shendure, Ji, 2008). Однако проведение высококачественного секвенирования последовательностей древней ДНК остается проблематичным из-за неудовлетворительного состояния такого генетического материала (Briggs, Неуп, 2012).
Технологии, которые в настоящее время доступны на рынке и наиболее часто встречаются, основаны на методах, называемых секвенированием путем синтеза (Illumina, пиросеквенирование 454 и Ion Torrent), секвенирование путем лигирования (ABI SOLiD), и секвенирование единичных молекул (Pacific Biosciences и Nanopore). Продолжительность чтения для разных методов существенно различаются: способами, позволяющими считывать короткие последовательности, являются технологии SOLiD и Illumina, производящие чтения продолжительностью от 75 до 300 п.о. Технологии же пиросеквенирования 454 и Pacific Biosciences осуществляют самые "длинные чтения" (1000-20000 п.о.) (Boulund, 2015).
Так, успешно был просеквенирован геном древнего человека, останки которого были найдены в Западной Сибири (Fu et al, 2014). Девять образцов были взяты из дистальной части бедренной кости 45000-летней давности. Из экстракта, содержавшего самое большое количество ДНК, были построены восемь библиотек, каждую из которых обрабатывали урацил-ДНК-гликозилазой и эндонуклеазой VIII для удаления дезаминированных остатков цитозина. Молекулы ДНК оказались короче 35 п.о., тем не менее они были просеквенированы на платформе Illumina Hi Seq с 42-кратным охватом последовательности 1.86 ГБ аутосомного генома.
Другим исследователям удалось просеквенировать целые митохондриальные геномы для идентификации людей посредством гибридизации с ДНК-зондами. Применение этого подхода помогло определить нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов неопознанных жертв Второй мировой войны (около 70-летней давности) и археологических останков 2500-летней давности (Templeton et al, 2013).
Описан усовершенствованный вариант широко используемой методики экстракции ДНК на основе диоксида кремния (Rohland, Hofreiter, 2007b), которая в сочетании с методом подготовки библиотек одноцепочечных ДНК позволяет секвенировать короткие, до 30 п.о., молекулы ДНК. Возможности данной методики продемонстрированы с использованием ДНК, выделенной из кости пещерного медведя среднего плестоцена (Dabney et al, 2013b). Несмотря на то, что большая часть ДНК пещерных медведей была представлена фрагментами длиной всего лишь 30-50 п.о., авторы данной работы считают, что еще не найден нижний предел размеров фрагментов ДНК, который в будущем может быть доступным для секвенирования с использованием библиотеки на основе разработанной ими методики (Orlando et al, 2011, Orlando et al, 2013, Dabney et al, 2013b).
Анализ имеющейся литературы показывает рост интереса к проблеме изучения разрушенной ДНК. Например, при выполнении запроса "ancient DNA" в базе научной литературы PubMed появляется статистическая диаграмма, отражающая публикационную активность в этой области. Согласно ей, наблюдается неуклонный рост числа публикаций с упоминанием "ancient DNA" с 22 ссылок в 1990-м до 531 ссылки в 2015 году. В связи с этим логичным является исследование фундаментальных основ разрушения ДНК как в естественных условиях, так и в условиях лабораторного эксперимента. И здесь очень важными представляются данные о предпочтительности фрагментации ДНК по определенным нуклеотидным сайтам. Данный аспект имеет огромную практическую ценность, поскольку подобные сведения лучше ориентируют исследователей на этапе выбора нуклеотидных последовательностей для дальнейшей работы, обеспечивая тем самым успешность и большую точность анализа. Однако на сегодняшний день недостаточно данных о специфичном к последовательности расщеплении ДНК под действием некоторых факторов, поэтому эта задача остается актуальной.
Помимо расширения перечня исследуемых объектов, содержащих разрушенную ДНК, продолжается разработка новых методов и технологий ее выделения и анализа, а также проводится поиск способов и приемов подготовки ДНК-материала для изучения имеющимися методами. Очевидно, что при работе с разрушенной ДНК неизбежен этап ее амплификации, который, как правило, лимитирует процесс изучения в силу сложности данного объекта исследования. Предлагаются различные модификации существующих способов амплификации, однако в этой части до сих пор остаются нерешенные вопросы. Таким образом, представляется необходимым изучение как процессов разрушения, фрагментации ДНК под действием различных факторов, так и поиск эффективных способов ее анализа.
Влияние длины молекул и динуклеотидов 5 -CG-3 на скорость ультразвуковой фрагментации ДНК
Ультразвуковая фрагментация является наиболее оптимальным способом искусственного разрушения цепей ДНК, не требующим использования дополнительных реагентов и позволяющим получить "чистый" препарат для дальнейшего непосредственного использования. На наш взгляд, фрагментация ДНК ультразвуком в условиях лаборатории в некотором приближении моделирует процессы механической деградации нуклеиновых кислот, происходящие в естественных условиях, следовательно, закономерности ее протекания могут быть приняты во внимание при работе, например, с древней ДНК.
Первая часть данной работы была направлена на поиск параметров, обеспечивающих выбор оптимальных нуклеотидных последовательностей в ДНК, разрушенной ультразвуком, для их дальнейшей амплификации. При планировании экспериментов отталкивались от следующих данных: 1) ультразвук вызывает одно- и двунитевые разрывы цепей нуклеиновых кислот, при этом размер образующихся фрагментов зависит от интенсивности и продолжительности его воздействия (Eisner, Lindblad, 1989, Larguinho et al, 2010), 2) разрывы в ДНК под действием ультразвука чаще всего происходят в местах, содержащих динуклеотиды 5 -CG-3 (Гроховский, 2006).
Ультразвуковой фрагментации подвергали тотальную ДНК и ДНК-ампликоны разной длины и разного нуклеотидного состава (с разным содержанием динуклеотидов 5 -CG-3 ), а анализ фрагментации проводили с помощью гель-электрофореза с денситометрией и количественной ПНР. Фрагментацию ДНК осуществляли в приборе BioRuptor компании Diagenode, предназначенном для приготовления ДНК-библиотек для секвенирования методами NGS. Разрушение ДНК в нем осуществляется непосредственно в пробирках типа eppendorf при трех возможных режимах воздействия: слабого ("low", частота ультразвука 20 кГц), среднего ("medium", 40 кГц) и сильного воздействия ("high", 60 КГц).
Сначала были проведены эксперименты, в которых оптимизировали технические параметры ультразвуковой обработки ДНК. Для подбора условий фрагментации тотальной ДНК в качестве модельного объекта брали ДНК фага Лямбда (далее X), геном которого характеризуется небольшим размером (48502 п.о.). Использование ДНК X оказывается удобным из-за возможности электрофоретического анализа результатов фрагментации. Ультразвуковая обработка ДНК X в режиме "high" в 50 мкл раствора показала закономерное повышение степени фрагментации с увеличением длительности воздействия. Так, при двухминутном облучении ДНК практически не разрушалась, а с увеличением продолжительности воздействия до 38 минут диапазон фрагментов на агарозном геле сужался примерно до 250 п.о. с максимумом в области 200 п.о. (рисунок 1), что согласуется с литературными данными (Eisner, Lindblad, 1989).
Для подбора условий фрагментации короткоцепочечных ДНК в качестве модельного объекта использовали ДНК-ампликоны, которые получали в ходе ПЦР-амплификации участка гена 28S рРНК богомола обыкновенного с помощью видоспецифичных праймеров (рисунок 2). Для ряда экспериментов амплификации подвергали иные ДНК-мишени, соответствующие описания приводятся в других разделах данной работы.
Размер самого длинного амплифицируемого участка, приведенного на рисунке 2, составил 1029 п.о. Обратные праймеры R166, R 349, R621 и R1029 дают в ходе ПНР с прямым праймером F1 продукты длиной 166 (ампликон А166), 349 (А349), 621 (А621) и 1029 (А1029) п.о. соответственно. Обратный праймер R352 подобран к прямому праймеру F2 и образует с ним продукт длиной 352 п.о. (А352). Полученные пять ампликонов были предварительно очищены от компонентов ПНР-реакционной смеси и затем подвергнуты воздействию ультразвука, после чего препараты анализировали с помощью электрофореза в агарозных или полиакриламидных гелях с последующей денситометрией полос исходных ампликонов и шмера, состоящего из продуктов фрагментации. Оцифровку результатов фрагментации осуществляли с использованием программы TotalLab 1.10, предназначенной для количественной оценки и сравнения содержания ДНК в разных участках геля. Для этого в зонах геля, соответствующих каждой из ячеек, были выделены по две области: область с цельными ампликонами - четко выраженная полоса, соответствующая длине ампликона, и область с фрагментированной ДНК - шмер ниже полосы ампликона. Денситометрия зон геля показывала соотношение цельных и разрушенных ампликонов для каждой ячейки, при этом за 100%-ное количество принимали сумму оптических плотностей соответствующих зон геля.
Сначала подбирали рабочие параметры ультразвуковой обработки ДНК-ампликонов, которые обеспечивали бы возможность изучения рарушения ДНК в выбранном диапазоне длин ДНК, условий среды и их нуклеотидного состава. В качестве реперного был взят ампликон средней длины - А621. Для определения минимально необходимого для разрушения объема водного раствора ампликона ультразвуковую обработку проводили в 5, 15 и 25 мкл в течение 20 минут. За это время практически полному разрушению подверглась ДНК только в растворе объемом 25 мкл (рисунок ЗА). При меньшем объеме скорость фрагментации падала, что объясняется, скорее всего, тем, что в малых объемах образование кавитационных пузырьков, вызывающих дробление ДНК, затруднено. Варьированием продолжительности ультразвукового воздействия было определено наименьшее время воздействия, при котором происходит полная фрагментация А621; оно составило около 10 минут (объем раствора - 25 мкл) (рисунок ЗБ). Указанные параметры были найдены для режима "high"; в режимах "low" и "medium" ампликон А621 не разрушался. В связи с этим дальнейшие эксперименты по ультразвуковой фрагментации ампликонов вели только для режима "high".
Преимущества ПЦР со сближенными праймерами
При работе с разрушенной ДНК неизбежен этап ее амплификации, которую осуществляют, как правило, с помощью полимеразной цепной реакции, но использование классической ПЦР в этом случае не всегда приводит к желаемому результату. Учитывая предпочтительность амплификации коротких фрагментов при работе с разрушенной ДНК, наиболее очевидным решением является использование в ПНР максимально сближенных праймеров. Однако имеются лишь единичные методические работы, посвященные изучению особенностей амплификации ДНК с помощью сближенных праймеров; детальных исследований ранее не проводилось.
Таким образом, предпочтительность расщепления ДНК по определенным нуклеотидным сайтам диктует необходимость выявления нуклеотидных последовательностей, которые в меньшей степени подвержены разрушению под действием различных факторов и, тем самым, лучше сохраняются в биоматериалах и обеспечивают более эффективную их амплификацию. В связи с этим целью работы стало определение размера и состава нуклеотидных последовательностей, оптимальных для эффективной амплификации разрушенной ДНК, и выявление особенностей ПЦР-амплификации ДНК с использованием сближенных праймеров.
Объектом исследования являлась ДНК, выделенная из тканей растений и животных, из объектов биологического происхождения, коммерческая (ДНК фага Лямбда), синтетическая, с искусственно сконструированными нуклеотидными последовательностями, и полученная в ходе ПЦР-амплификации (ДНК-ампликоны). Для выполнения работы использовались современные молекулярно-биологические методы: выделение тотальной ДНК, подбор нуклеотидных последовательностей и химический синтез праймеров, подготовка ДНК-матриц, полимеразная цепная реакция, гель-электрофорез, молекулярное клонирование и секвенирование.
При выполнении работы с помощью методов гель-электрофореза с денситометрией и количественной полимеразной цепной реакции было изучено влияние размера молекул и плотности расположения динуклеотидов 5 -CG-3 на эффективность ультразвуковой фрагментации ДНК на примере длинноцепочечных и короткоцепочечных молекул. Ультразвуковому воздействию подвергали тотальную ДНК и ДНК-ампликоны разной длины и с разным содержанием динуклеотидов 5 -CG-3 . Оказалось, что короткие ДНК (менее одной персистентной длины, около 160 п.о.) практически не подвергаются ультразвуковой фрагментации. Динуклеотиды 5 -CG-3 оказывают влияние на эффективность фрагментации ДНК под действием ультразвука: на уровне относительно коротких молекул (ДНК-ампликоны) это влияние не совсем очевидно, а в случае тотальной ДНК наиболее подвержены расщеплению участки со средней плотностью расположения динуклеотидов 5 -CG-3 .
В работе были изучены также различные аспекты протекания полимеразной цепной реакции со сближенными праймерами в сравнении с ее вариантом с использованием классических праймеров. Обнаружено, что ПНР-амплификация со сближенными праймерами характеризуется более высокой чувствительностью, специфичностью и стойкостью к ингибиторам. Качественно подобранные праймеры "встык" не димеризуются в ходе ПЦР и обладают абсолютной специфичностью. Сближенное расположение праймеров позволяет сократить продолжительность ПНР за счет сокращения длительности этапов денатурации, отжига и элонгации и снижения температуры денатурации. Предпочтительность использования в ПНР праймеров "встык" была продемонстрирована на нескольких примерах: на искусственно разрушенной ДНК, на ДНК, выделенной из древесной трухи, почвы и меда. Во всех перечисленных случаях только праймеры "встык" позволили достичь желаемого результата.
Однако ПЦР с праймерами встык имеет ряд ограничений. Так, она не позволяет осуществлять SNP-типирование, и для его успешного проведения необходимо удаление праймеров на 20 и более нуклеотидов друг от друга. Поскольку ПЦР с праймерами "встык" характеризуется более высокой чувствительностью и предел обнаружения может достигать единичных копий ДНК-мишени, данную особенность нужно принимать во внимание в тех случаях, когда предполагается возможная контаминация рабочего пространства или реактивов исследуемой ДНК, например, ДНК человека. Для ДНК, фрагментированной ультразвуком, показано аномальное снижение количества мишеней, выявляемых с помощью праймеров "встык", поэтому справедливой является рекомендация об использовании при амплификации разрушенной ДНК праймеров, расположенных не максимально близко, а в пределах 100-150 нуклеотидов из областей, не содержащих динуклеотиды 5 -CG-3 или из областей с высокой их плотностью.
Таким образом, при выполнении работы получены новые данные о разрушении ДНК под действием ультразвука и показаны преимущества использования в ПНР сближенных праймеров. Практическая значимость работы заключается в возможности использования полученных данных непосредственно при планировании ПНР-экспериментов с разрушенной ДНК, начиная с подбора нуклеотидных последовательностей, наиболее подходящих для амплификации, и заканчивая интерпретацией результатов. Это может найти применение не только в научных исследованиях, но и в практике лабораторий экспертизы в криминалистических центрах, учреждениях Роспотребнадзора, медицинской диагностики.