Введение к работе
'.
. 1. Актуальность темы
В 1984 году в Китае была обнаружена новая болезнь кроликов, которая по своим арактерисгикам может быть отнесена к категории особо опасных инфекциотгых болез-:ей, т.е. к болезням того типа, которые, если не применят!, эффективные метода борьбы с ими, могут вызвать тотальное уничтожение поголовья чувствительных животных.
Впервые болезнь выявил и описал Liu с коллегами в 1984 году, когда она возникла реди импортировагагых из Германии ангорских кроликов. В последующие годы вспышки іолезіш с подобными клиническими признаками и патоморфологисй были описаны в ряде трап Европы и Северной Америки. Эта болезнь давала огромные потери во всех странах, де она имела место. В нашей стране первая вспышка болезім была зарегистрирована в 986 году в пограничном с Китаем районе Хабаровского края. Диагноз поставлен не был, роликов из заболевшего стада убили, а шкурки отправили на фетровую фабрику Московкой области. В результате этого в центре страны возник вторичішй очаг болезни. Из него іолезіш распространилась к 1987 году по 20 областям и краям России, а затем практически ся территория СССР стала неблагополучной.
Даже в начале изучения болезни и характеристик ее возбудителя данные, ка-аюпщеся клинических признаков, иатоморфологии и других деталей болезни, как и дан-ше по ультраструктуре внеклеточных- вирионов, не имели какігх-либо серьезных противо-іечий. Это приводит к заключению о том, что во всех странах, упомянутых выше, болезнь мзывалась одним и тем же вирусом. В противоположность этому, дагапле, касающиеся іиохимии вируса, первоначально были очень противоречивы. Так, Deng с коллегами оста-ювились на выводе, что этиологический агент этой болезни принадлежит к калицивиру-ам. С другой стороны, немецкие ученые Gregg & House заключили, что он является пар-ювирусом.
В связи с возникновением нового патогена стало необходимым проведеіше его ком-глексного изучения клиническими, патологоанатомическими, вирусологическими, имму-юхимическими, биохимическими и другими методами. Необходимо было изучить патоге-іез и иммуногенез болезни, установить физико-химические характеристики и биохимиче-кий состав вируса, решить ряд других вопросов, в том числе о таксономическом положе-ши и происхождении вируса. Этим обусловлен выбор цели работы.
\.2. Цель и задачи исследований
Целью работы было изучить физико-химические, антигенные свойства и морфоло-ию вируса ГБК, патогенез вызываемой им болезни. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.
.. Определить константу седиментации, плавучую плотность, нолипептидньгй состав, массу вирионов. !. Изучить чувствительность вируса к физическим и химическим воздействии!. !. Изучить гемагглютинирутощую активності, вируса. \. Изучить ультраструктуру вирионов и степень гетерогенное вирусных популяций по
этому параметру, их физико-химический полиморфизм. >. Изучить полипептидш.ш состав вирионов, ангигешюсть структурных белков. ). Изучить параметры репродукции вируса в зараженных клетках и вирусное цитонатиче-
_2 Общая характеристика работы
скос действие (ЦПД).
-
Изучить клиническую и патологоанатомическую картину болезни, основные патогенетические факторы и возможности модификации течения болезни с использованием химиотерапевтических препаратов и других лекарственных средств.
-
Выявить и охарактеризовать вирусный протективный антиген, обладающие про-тективным потенциалом эффекторы иммунитета, действующие при этой болезни.
-
Изучить шггигенную структуру вирусного протсктивного антигена и па этой основе разработать улучшенные диагностические тест-системы на основе моноклональ-ных антител.
13. Научная новизна работы
Научная новизна работы заключается в получении следующего ряда новых (выделены курсивом) или уточненных в приложении к изучавшемуся штамму В-87 данных о вирусе ГБК, его циркуляции среди животных и вызываемым им патологическом процессе, иммунологическом ответе на данный патоген.
Изучены физико-химические свойства вируса. Определены констаїгга седиментации, плавучая плотность вирионов, стоксов радиус вириона, параметры растворимости в растворах солей и полимеров.
Изучена устойчивость к денатурирующим агентам и физическим факторам. Нативные вирионы не чувствительны к действию растворителей липидов, жесткой протеолитической обработке, стабильно сохраняют инфекционность и ге-магглютижрующую активность в диапазоне рН от 3 до 9. Вирус ГБК обладает высокой термостабильностыо {сохраняет инфекционность, гемагглютинирующую активность, форму вириона и его полипептидный состав в ходе инкубации при 5бС в течение не менее чем 30 минут), термостабильиость возрастает в средах, обогащенных белками и полисахаридами, и падает в средах, обогащенных одновалентными ионами. При прогревании до 5б"С и выше происходит изменение конфор-мации поверхностного белка вирионов, в результате чего он становится чувствителен к трипсиновому протеолизу. Вирус ГБК чувствителен к щелочам и хлорсо-держащим дезинфектантам, новому дезипфектанту для ветеринарных целей - Тео-тропипу. Вирус в процессе длительного храпения при низких температурах в жидкой среде или лиофильно высушенном состоянии может утратить гемагглютинирующую активность, сохранив при этом инфекционность.
Изучена морфология вирионов и их морфологический полиморфизм. Установлено, что внеклеточные частицы вируса ГБК могут представлять собой б морфологических форм. Первая - «стандартный» вирион - икосаэдрическая частица диаметром 36 им с электрошюпрозрачпой сердцевиной, имеющая палочкообразные выросты на поверхности, содержащая полный вирусный геном. Вторая - частица с неполным геномам, отличающаяся от «стандартного» вириона наличием элек-тронноплотного ободка, окружающего сердцевину. Трегья - «пустая» частица - вирусный капсид, не содержащий генетического материала, отличающаяся от «стандартного» вириона электрошюгглотной сердцевиной. Четвертая - «голая» частица, отличающаяся от стандартной отсутствием выростов па поверхности. Пятая - «вирусный кор» - обособившийся в результате «разламывания» капсида -сердцевина «стандартного» вирионаШестая - «малая форма» - фрагменты капсида - агрегат-
Общая характеристика работы
сапсамеров - частица диаметром около 20 им с характерными выростами па поверхности, но без сердцевины.
Изучена степень полиморфизма еирионов но плавучей плотности, константе сегментации, поведению в фазовых системах. Седимептируя в средах с низкой плотно-;тью, вириошл разделяются на 2 фракции - «стандартных» вирионов и «пустых» частиц, іастично перекрывающихся ппфокой зоной частиц с неполным геномом; при изопикниче-:ком центрифугировании вирионы разделяются подобным образом, при распределении в разовых системах частицы первых трех морфологических типов пе разделяются, что 'оворит об идентичности свойств их поверхностного белка.
Изучены параметры репродукции вируса в различных органах и тканях зара-кенных животных. Вирус репродуцируется в клетках печени, легких, тимуса, головного лозга и проникает в клетки многих других органов. При репродукции в клетках этих че-пырех органов вирус образует цитоплазматические скопления, в том числе - паракри-таишческие, и не обнаруживается в клеточных ядрах. Максимальный выход вирионов ш одну зараженную кістку составляет более 10 000. Вирус не имеет иеспецифического іеханизма экзоцитоза и покидает клетки после их распада. Наиболее высокие абсолютное уровни накопления вируса отмечают и печеш и легких, причем раннее и относитель-\о высокое накопление вируса в этих органах имеет место у животных, гибнущих в ранте сроки после заражения.
Изучение клинических и патологоанатомнческих признако» ВГБК показачо, \то основным патогенетическим механизмом ВГБК является тромбогеморрагический ипдро.м, приводящий к повышению фибринолитической активности сыворотки, что вляется причиной фибринолиза микрослоя фибрина на стенках кровеносных сосудов. Последний приводит к увеличению их проницаемости, выражающейся в образовании ровоизчияний различных типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной мерти при острой форме болезни являются субдуральпые кровоизлияния в головном юзге, которые представляют собой патогномопический признак данной формы ВГБК.
Изучен полипептидный состав и аитигепность белков вирионов, которые ключают 5 полипептидов с молекулярными массами 60, 54, 42, 37, 16 кДа, в том числе -існовной капсиднмй белок Vp60, на долю которого в составе вирионов приходится более '0% по массе.
Показано, что эти полипептиды взаимодействуют с антителами из сывороток рекон-іалесцентньїх кроликов. Установлено, что основным протективпым антигеном вируса вляется УрбО, иммунизация которым (даже в денатурированном виде) индуцирует Ьормирование невосприимчивости к болезни. Формирование иммунитета низкой папря-кенности также вызывает Vp37. Установлено, что в составе УрбО имеется минимум 3 нтигенных района, а его антигенная структура стабильна у изолятов, циркулирующих природе и при длительном пассировании таких изолятов в лабораторных условиях, ^становлено, что в формировании иммунитета к вирусу ГБК играют роль как антитело-ависимые, так и антителонезависимые механизмы, которым принадлежит основная юль в защите от инфекірш в поздние сроки после вакцтшции.
'А. Практическая значимость результатов
В практике проведеіп/ія НИР могут быть использованы разработанные или адапти-
юванные в отношении вируса ГБК методические приемы: экстракция вируса из заражен
их тканей с использованием трипсинового протсолиза, очистка вируса, вирусных поли-
[ептидов. ^^^^^^^^^^^^^
4 Общая характеристика работы
В ходе работы охарактеризован по физико-химическим свойствам, антигенно-сти и ряду других параметров штамм В-87 вируса ГБК, принятый реферснс-ипвммом данного вируса для России (авторское свидетельство на изобретите № 294945 с приоритетом от 09.03.88 ).
Получен и охарактеризован клон гибридных клеток, продуцирующих монокло-пальпые антитела к Vp60 вируса ГБК (линия клеток депонирована и запатентована, патент № 2007452 с приоритетом от 16.01.92. ).
На основе этих моноклональных антител разработаны и испытаны усовершенствованные диагностические наборы для вьіявлеїшя вирусішх антигенов и противовирусных антител (составлены методические указания по диагностике вирусной геморрагической болезіш кроликов иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, утвержденные 30.10.1992 г.).
Разработан новый химиотерапевтический препарат для профилактики и лечения бактериозов и бактериальных осложнений после вирусных заболеваний Абактан (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ, проводится патентование); бактериозов и болезней, вызываемых РИК-содержащими вирусами Лбактап Р (положительное решите о выдаче патента № 97104338/13 с приоритетом от 20.03.97, комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ); новый химиотерапевтический препарат для лечения бактериозов и болезней, вызываемых ДНК - содержащими вирусами, Абактан Д (положительное рсшеїше о выдаче патента на изобретите № 97104650/13 (004921) от 19.01.1998 г. с приоритетом от 25.03.1997 г., комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ), новый дезипфектапт для ветеринарии Теотрогшн (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ, производится патентование), а так же методы их примснеїшя для ветеринарных целей.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту
-
Результаты изучения патогенеза ВГБК, показавпше, что основным мехашз-мом патогенеза острой формы болезіш является следующий. Репродукция вируса в клетках вызываег выброс в кровоток прокоагулшггов. Это приводит к повышению фибринолитической активности сыворотки, что является причиной фибринолиза микрослоя фибрина їй стенках кровеносных сосудов. Фибринолиз приводит к увеличению проницаемости сосудистой стенки, выражающейся в образовании кровоизлия-ішй различшлх типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной смерти при острой форме болезіш являются субдуральпые кровоизлияния в стволовой части головного мозга. Терапевтические воздействия, предотвращающие образование тромбоза при ВГБК, противодействуют развитию геморрагии, что приводит к добро-качетвешому течеїшю инфекциошюго процесса.
-
Основным протективным антигеном вируса ГБК является Vp60 - мажорный капсидиый белок вириона, имеющий в своем составе не менее 3 аіггигеншлх регионов. Структура данного полипептида стабильна, имеющиеся вирусные изоляты антигенно не различимы. Система иммунологической защиты при ГБК включает антите-лозависимые и антителонсзависимые иммунологические механизмы. Последние играют основную роль в отдалешпле сроки после иммунизации.
-
Вирус ГБК обладает структурным полиморфизмом, заключающимся в суще-
Общая характеристика работы
;твовашти нескольких форм вириопов, различающихся между собой содержанием нуклеиновой кислоты, размером частиц. Наличие различных форм вириопов отражается в полиморфизме вирусной популяции но физико-химическим свойствам -плавучей плотности, сонстанте седиментации. Формирование вириопов той или иной структуры зависит от :войств организма животного, в котором происходит их репродукция, и некоторых пара-миров инфекционного процесса. На морфологическом уровне это выражается в возможности формирования вирусных популяїшй, основная часта которых представлена вирио-іами, не содержащими нуклеиновой кислоты или содержащими ее в меньшем, чем в стандартных вирионах, количестве.
4. Сумма свойств морфологических (структура вириопов), физико-химических 'константа седиментации, плавучая плотность, «молекулярная» масса, стелешь устойчиво-;ти к факторам внешней среди), биохимических (количество полипептидов, тип и струк-гура нуклеиновой кислоты), биологических (трудность адаптации к репродукции в культурах клеток, гемагглютгагарующая активность) показывают, что вирус ГБК обладает чергами сходства с калини- и пикорнавирусами, но существенно отличается от прототигашх представителей обоих семейств.
1.6. Апробация результатов
Материалы исследований были заслушаны и обсуждены на трех тучных конференциях (г. Покров 1988,1990, 1992 it.) и заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (1988-1995 г.), международной конфсреіщии (г. Харьков 1995 г.), международной конференции 'г. Москва, 1998 г.), лабораторном совещании научных сотрудников (г. Покров 1998 г.), межлабораторной апробации диссертации (г. Покров 1998 г.).
7.7. Публикация результатов исследований
По результатам экспериментальных работ, выполненных по теме диссертации, имеется 19 публикаций, в том числе авторское свидетельство, патент, три положительных решения о выдаче патеїггов, обзорный доклад.
1.8. Внедрение результатов исследований
Охарактеризовашшш штамм вируса ГБК В-87 используется в качестве рефереис -итамма и производственного штамма при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. Внедрены в ветеринарную практику Наборы для диагностики ГБК с применившем ионоклональных антител, химиотерапевтические препараты Абактан, Абактан Р, Абактан Ц, Теотропин.
1.9. Благодарности
.Ітаїшрованис экспериментальной части работ, теоретический анализ и обобщение полу-іеїшьіх результатов экспериментальных исследовашй, анализ литературных дашплх, ос-ювная часть экспериментальных исследований проведешл автором самостоятельно. Ко-ииссиошпые и производственные исішташія разработанных биопрепаратов, химиотера-"іевтических средств и методов дезинфекции нроведегал при участии специалистов Ураль-жого политехнического института. Института органичес кой химии РАН, Октябрьской тгицефабрики, ряда сельскохозяйствашых предприятий Смоленской и Владимирской )бластей, за что автор выражает им глубокую признательность.
Отдельные фрагменты экспериментальных работ выполнены совместно со следую-цими сотрудшжами ВНИИВВиМ, за что автор выражает им сердечную благодарность.
_6 Общая характеристика работы
Кандидат ветеринарных наук, старший научішш сотрудник Зубаиров М.М. (разработка и испыташе химиатерапевтичсских препаратов), каидіодат ветеринарных наук, старший научный сотрудішк Малоголовкин С.А., заведующий лабораторией (патологоанатомичсские исследования и гибридомная технология), кандидат биологических наук, научный сотрудішк, Малахова М.С. (элсктрошюмикроскопичсскис исследоваїшя), кандидат биологических наук, научный сотрудник. Черных А.А. (гибридомная технология).
При выполнении экспериментальных работ проведение целого ряда аппаратурных исследований было бы невозможно без превосходного технического содействия, оказываемого автору па протяжении ряда лет Смирновым A.D., Гусевым Н.Г.
В ходе оформлешга диссертации автор получил значительную помощь, заключавшуюся в конструктивной критике материалов от старшего научного сотрудника, специалиста в области эпизоотологии Книзе СВ., старшего научного сотрудника, специалиста в области патоморфологии Малоголовкина С.А, старшего научного сотрудника, специалиста в области иммунологии Новикова Б.В, старшего научного сотрудника, специалиста D области иммунологии и биотехнологии Дмигренко ВВ., научного сотрудника, специалиста в области цитологии Черішгх Н.В., за что выражает им глубокую признательность.
Автор выражает глубокую признательность профессору Макарову Владимиру Владимировичу - под руководством которого работал над данной темой в течение первых 7 лет ее выполнения и своему научному консультанту Шевченко Александру Алексеевичу.
1.10. Объем и структура работы