Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Морфология, жизненный цикл и патогенез ВИЧ-1 13
1.1.1 .Структура вириона 13
1.1.2 .Жизненный цикл вируса и патогенез ВИЧ-инфекции 14
1.2 Структурно-функциональная организация генома ВИЧ-1 18
1.2.1 .Нетранслируемая область 18
1.2.2 Гены и функции дополнительных белков 19
1.2.3 Гены и функции структурных белков 21
1.2.3.1 Ген pol: протеаза и обратная транскриптаза 21
1.2.3.2 Ген env: поверхностный гликопротеин gp120 24
1.3 Факторы эволюции ВИЧ-1 27
1.3.1 Ошибки репликации, рекомбинация и динамика репродукции ВИЧ-1 28
1.3.2 Естественный отбор, направляемый факторами иммунного ответа 30
1.3.3 Передача ВИЧ-1 и группы риска 36
1.4 Фармакорезистентность и тропизм ВИЧ-1 39
1.4.1 Мутации лекарственной устойчивости 40
1.4.2 Тропизм и смена используемых вирусом корецепторов 44
1.5 Филогеография ВИЧ-1 49
1.5.1 Происхождение, классификация и генетическое разнообразие вируса 49
1.5.2 География субтипов, суб-субтипов и рекомбинантных форм вируса 51
1.5.3 Эпидемия суб-субтипа А6 (IDU-A) в России 53
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1 Объект исследования 57
2.2 Материал исследования 57
2.3 Методы исследования 58
2.3.1 Экстракция тотальной ДНК из клеток 58
2.3.2 Амплификация фрагментов генов pol и env ВИЧ-1 58
2.3.3 Электрофорез и визуализация 61
2.3.4 Очистка амплифицированных ДНК-фрагментов 61
2.3.5 Определение первичной структуры полученных ДНК-фрагментов 63
2.3.6 Биоинформатические методы 63
2.3.6.1.Редактирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей 63
2.3.6.2 Выбор оптимальной модели замещения нуклеотидов и филогенетический анализ 63
2.3.6.3 Оценка генетического разнообразия 67
2.3.6.4/Рекомбинационный анализ и определение APOBEC-3-гипермутаций 68
2.3.6.5 Тесты на селекцию и поиск адаптивно эволюционирующих участков генов 68
2.3.6.6 Определение потенциальных сайтов гликозилирования 69
2.3.6.7 Выявление мутаций лекарственной устойчивости и предсказание тропизма 70
2.4. Статистическая обработка данных 70
Глава 3. Результаты исследования 72
3.1 Характеристика исследуемой популяции 72
3.1.1..Клинико-эпидемиологическая характеристика включенных в исследование ВИЧ-инфицированных лиц 72
3.1.2 Последовательности расшифрованных участков генома ВИЧ-1 75
3.1.3.Субтиповая принадлежность используемых образцов ВИЧ-1 и APOBEC3G-индуцированные гипермутации 76
3.2 Молекулярно-генетическая история популяций ВИЧ-1 суб-субтипа А6 в Пермском крае и Иркутской области 81
3.2.1 Время существования общего предка и демографическая история популяции ВИЧ-1 суб-субтипа А6 вируса в исследуемых регионах 81
3.2.2 Генетическое разнообразие популяций ВИЧ-1 суб-субтипа А6 в разные периоды эпидемии 86
3.3 Генетическое разнообразие и скорость эволюции суб субтипа А6 ВИЧ-1 среди инъекционных наркопотребителей и гетеросексуальных лиц в исследуемых регионах 90
3.3.1 Генетическая дифференциация и скорость эволюции 90
3.3.2 Вариация адаптивно эволюционирующих сайтов 96
3.3.3.Распространенность и локализация N-связанных сайтов гликозилирования 101
3.4 Лекарственная устойчивость и тропизм 104
3.4.1 Мутации резистентности ВИЧ-1 суб-субтипа А6 в Пермском крае и Иркутской области 104
3.4.2 Тропизм используемых в работе штаммов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и связь тропизма с клинико-лабораторными показателями пациентов 104
Глава 4. Обсуждение результатов 109
Заключение 122
Выводы 122
Список сокращений 125
Глоссарий 126
Список литературы 127
Приложение А 162
1. Регистрационные номера использованных в работе нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 162
2. Эволюционная модель замещения нуклеотидов, используемая в тестах на селекцию и для поиска адаптивно эволюционирующих участков генов 164
3. Алаймент аминокислотных последовательностей ВИЧ-1 от пациентов разных групп риска инфицирования 164
4. Графики корреляции между тропизмом ВИЧ и основными клинико лабораторными показателями пациентов 171
- Естественный отбор, направляемый факторами иммунного ответа
- Выбор оптимальной модели замещения нуклеотидов и филогенетический анализ
- Время существования общего предка и демографическая история популяции ВИЧ-1 суб-субтипа А6 вируса в исследуемых регионах
- Тропизм используемых в работе штаммов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и связь тропизма с клинико-лабораторными показателями пациентов
Естественный отбор, направляемый факторами иммунного ответа
Движущей силой диверсификации ВИЧ-1 в инфицированном организме служит отбор наиболее жизнеспособных вариантов вируса в условиях селективного давления факторов хозяина. Одним из таких факторов является иммунологическое давление организма хозяина, проявляющееся в первую очередь посредством цитотоксического Т-клеточного (ЦТЛ) [Allen T.M. et al., 2005] и гуморального (антительного) ответа [Richman D.D. et al., 2003].
В числе ранних селективных сил, действующих на эволюцию вируса, находятся ВИЧ-специфические ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (Рисунок 7). Самые ранние ответы ЦТЛ часто специфичны для сильно вариабельных белков, таких как Env и Nef [Jones N.A. et al., 2004; Turnbull E.L. et al., 2009]. Положительному отбору сначала подвергаются варианты вируса, несущие escape-мутации в эпитопах, распознаваемых CD8+ цитотоксическими Т-клетками. Происходит это, как правило, еще до сероконверсии и связано с резким увеличением частоты ЦТЛ-иммуноадаптивных мутаций в этих белках [Goonetilleke N. et al., 2009; Han C. et al., 2014]. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что эффективные ответы ЦТЛ необходимы для разрешения острой фазы виремии [Streeck H. et al., 2009]. Иммунные ответы на другие вирусные белки, включая Gag и Pol, как правило, возникают во время поздних волн ответов Т-клеток и могут быть более важными для поддержания вирусной нагрузки в заданной точке, чем для контроля ранней виремии [Goonetilleke n. et al., 2009; Turnbull E.L. et al., 2009]. Среди продуктов гена pol ВИЧ-1 наиболее сильной способностью активировать ЦТЛ обладают эпитопы, расположенные в срединной части обратной транскриптазы и области с активностью РНК-азы Н [Masemola A. et al., 2004].
В отличие от ранних стадий заражения ВИЧ-1, когда диапазон эпитопов, распознаваемых Т-клеточным ответом достаточно узок, более поздний ответ является широким, часто направленным против более чем 10 эпитопов [Addo M.M. et al., 2003].
Неясно, какие признаки определяют, какие ЦТЛ эпитопы впоследствии станут иммунодоминантными, однако понятно, что важную роль в этом процессе играет тип HLA хозяина [Altfeld M. et al., 2006]. К примеру, индивидуумы, экспрессирующие аллель HLA-B57, демонстрируют сильный ЦТЛ-ответ на высококонсервативный эпитоп TW10 в Gag, что приводит к уменьшению вирусной нагрузки на стадии острой ВИЧ-инфекции более чем в 1000 раз [Altfeld M. et al., 2003]. По мере прогрессии заболевания вирус в конечном итоге избегает TW10-специфического ответа ЦТЛ путем селекции escape-мутаций внутри этого эпитопа [Brockman M.A. et al., 2007; Crawford H. et al., 2007], но, несмотря на иммунный побег, репликация вируса остается хорошо контролируемой у этих людей. Основополагающий механизм, ответственный за эффективное управление репликацией вируса, в данном случае связан, по-видимому, с пониженным фитнессом вируса, содержащего escape-мутации избегания в TW10-эпитопе [Crawford H. et al., 2007; Miura T. et al., 2009]. Более того, хотя определенные мутации ухода вируса от активности ЦТЛ могут распространяться в популяции восприимчивых лиц [Goulder P.J. et al., 2001], не исключено, что в условиях иммуногенетической среды нового индивидуума они окажутся вредными и будут отсеяны естественным отбором, по причине «неправильного» распределения HLA.
Помимо селективного давления клеточного звена иммунного ответа на ВИЧ-1, значительным фактором отбора служит гуморальный ответ, представленный антителами против различных вирусоспецифических белков. Нейтрализующие антитела обычно играют ключевую роль в борьбе с вирусными инфекциями, но в случае ВИЧ-1 их роль в контроле за установленной инфекцией в значительной степени ограничена по причине быстрой эволюции вируса и недостаточной эффективности для подавления репликации патогена.
Наиболее изученным и важным в функциональном отношении является ответ нейтрализующих антител (NAbs) против Env-гликопротеинов ВИЧ-1, приводящий к связыванию внеклеточного вируса и частично предотвращающий последующее заражение вирионом новых клеток-мишеней [Burton D.R. et al., 2015].
Гуморальный ответ на Env-гликопротеины ВИЧ-1 развивается, как правило, уже в течение первых двух-четырех недель после обнаруживаемой виремии и первоначально регистрируется как комплексы антиген-антитело (Рис.7). Впоследствии сначала обнаруживаются антитела против gp41, затем, спустя еще несколько недель, появляются антитела против gp120, нацеленные в первую очередь на V3-петлю молекулы [Tomaras G.D. et al., 2008]. Несмотря на наличие специфичной иммуностимулирующему антигену последовательности, такие антитела, по-видимому, не оказывают селективного иммунного давления на вирус и не влияют на вирусную нагрузку [Keele B.F. et al., 2008; Overbaugh J. et al., 2012]. Поскольку функциональные гликопротеиновые Env-компексы подвержены диссоциации, вполне вероятно, что большая часть анти-Env антител направлена на дизассамблированные мономеры gp120 и gp41 [Burton D.R. et al., 2002]. Это может частично объяснить очевидное отсутствие эффективности in vivo этих ранних ответов против конформационно интактных тримеров [Burton D.R. et al., 2002].
Иммунный ответ в форме нейтрализующих антител (NAbs) с высокой степенью специфичности против исходного инфекционного штамма ВИЧ-1 развивается после разрешения острой инфекции, примерно через две-пять недель после передачи вируса [Tomaras G.D. et al., 2008]. Большая часть основных эпитопов аутологичных NAbs сконцентрирована в вариабельных доменах (V1-V5), среди которых наибольшую роль в модуляции таких антител играют V1/V2 и V3 домены gp120 [Щелканов М.Ю. и др., 1998; Rong R. et al., 2007; Keele B.F. et al., 2008; Burton D.R. et al., 2015]. Кроме того, некоторые данные показывают, что эпитопы в области C3-V4 являются основными мишенями раннего аутологичного ответа NAbs на инфекцию ВИЧ-1 подтипа C [Moore P.L. et al., 2008].
Уход вируса от действия таких антител является легко достижимой целью, поскольку мутации в вариабельных доменах в большинстве своем не влияют на вирусный фитнес. Каждый раз при достижении эффективного ответа нейтрализующего антитела в вирусной популяции будет происходить отбор вариантов, несущих escape-мутации. Как только будет установлен иммунный ответ, специфичный по отношению к этому варианту, появится новый вариант побега и так далее.
Помимо мутаций, приводящих к замене аминокислоты в специфичной антителу последовательности белка, важным способов избегания ВИЧ-1 аутологических NAbs является изменение длины V1-V2 и V4 доменов gp120, влияющих на конформацию молекулы гликопротеина. Такое изменение может приводить к ограничению доступности детерминант нейтрализации посредством стерического препятствия [Kwong P.D. et al., 2002]. Другой способ, с помощью которого ВИЧ-1 уклоняется от нейтрализации антител без четко определенных мутаций избегания – это изменение структуры «гликанового щита» молекулы, участвующего в маскировке эпитопов NAbs [Wei X. et al., 2003; Moore P.L. et al., 2009]. Так, например, эпитоп 2G12 gp120 является конформационно чувствительным, распознавание которого Nabs сильно зависит от профиля гликозилирования C2-C4-доменов и V3-V4 петель [Scanlan C.N. et al., 2002]. В частности, появление в основании V3 петли дополнительного сайта гликозилирования (N-гликана), вносит негативный вклад в распознавание этого эпитопа, опосредуя побег вируса от аутологических Nabs [Tang H. et al., 2011].
Как упоминалось выше, мишенью нейтрализующих антител высокой специфичности служат вариабельные области гликопротеинов оболочки ВИЧ 1. По мере появления вариантов вируса, несущих escape-мутации, NAbs-ответ у некоторых ВИЧ-инфицированных лиц может быть переориентирован на более консервативные области Env-белков, результатом чего является индукция широко нейтрализующих антител (bNAbs), способных нейтрализовать гетерологичный вирус (штаммы разных субтипов) [Moore P.L. et al., 2009]. Относительно широкий спектр активности bNAbs, вероятно, является результатом формирования множественных специфических антител, каждый из которых нацелен на несколько вирусных вариантов [Scheid J.F. et al., 2009].
Выбор оптимальной модели замещения нуклеотидов и филогенетический анализ
Подбор оптимальной эволюционной модели проводили в приложении jModeltest v2.0 [Darriba D. et al., 2012] путем оценки значения правдоподобия (likelihood) в соответствии с информационным критерием Акайке (Akaike information criterion, AIC). Модель с наименьшим значением AIC была определена как наиболее подходящая для анализируемой нуклеотидной матрицы [Aho K. et al., 2014]. В качестве оптимальной для всех матриц была выбрана обобщенная реверсивная модель (General Time Reversible, GTR) с пропорцией инвариабельных сайтов (+I) и вариацией скорости замен между оставшимися сайтами, описываемой гамма-распределением (+G). Установленное число гамма-категорий было равно четырем (G4). Субтиповую принадлежность последовательностей устанавливали методом присоединения соседей (neighbor joining, NJ) с использованием приложения REGA HIV-1 Subtyping Tool v3.0 [Pena-Pineda A.C. et al., 2013].
Дальнейший филогенетический анализ проводили двумя способами: методом максимального правдоподобия (Maximum likelihood, ML) и с применением Байесовского подхода (Bayesian Inference, BI), использующего методы Монте-Карло с цепями Маркова (Markov Сhain Monte Carlo, MCMC).
В первом случае использовали пакет программ MEGA v6.0. Построение ML-деревьев проводили без игнорирования сайтов, включающих пробелы (gap) с использованием стартового NJ-дерева и ранее выбранной модели (GTR+I+G4). Достоверность топологии ML-деревьев (надежность ветвей) оценивали методом бутстрэп-ресэмплинга (bootstrap) с генерацией 1103 рандомизированных выборок. Статистически высокоподдержанными считали узлы с величиной доверительной вероятности бутстрэпа (бутстрэп-поддержки) более 0.9. Эвристический поиск лучших деревьев осуществляли методом обмена ближайшими соседями (nearest-neighbor-interchange, NNI).
Во втором случае, анализ проводили с применением пакета программ BEAST [Drummond A.J. et al., 2007]. При реконструкции BI-деревьев использовали вышеуказанную модель замещения нуклеотидов и расслабленные молекулярные часы с некоррелированным логнормальным распределением скорости замен вдоль ветвей деревьев (lognormal (uncorrelated) relaxed clock model, UCLN). Выбор в пользу UCLN был сделан по результатам тестирования различных моделей молекулярных часов в приложении Tracer v.1.6 на основании критерия Акайке-MCMC (AICM) [Baele G. et al., 2012]. Филодинамический анализ проводили с использованием Байесовской скайрид модели (GRMF Bayesian Skyrid) в пакете программ BEAST. По данным [Heled J. et al., 2008], выбор модели GRMF Bayesian Skyrid предпочтителен при определении времени самого последнего общего предка (time of the most recent common ancestor, TMRCA) и реконструкции демографической истории (определении эффективного размера популяции (Ne) во времени (), или эффективного числа инфекций) популяции непосредственно по выборке мультилокусных нуклеотидных последовательностей с использованием молекулярных часов.
Выровненные нуклеотидные матрицы разных генов (блоков) анализировали с использованием опции дробления генов (gene partitioning) и разлинковкой (unlink) моделей нуклеотидных замен (GTR+I+G4) и молекулярных часов (UCLN). Во всех случаях параметры моделей для анализа того или иного гена подбирались индивидуально.
Во избежание смещения выборки из-за превышения количества последовательностей образцов определенных лет анализ был повторен три раза с отбрасыванием таких последовательностей в случайном порядке. В результате совершенной манипуляции размер выборки, используемой при анализе эпидемий, был уменьшен адекватно имеющемуся в распоряжении числу образцов.
Реконструкцию последовательности MRCA во всех случаях осуществляли с применением возраст-зависимой модели (age-depended) и учетом всех типов нуклеотидных замен (транзиций и трансверсий).
Пробеги MCMC осуществляли в приложении Beast v1.8.2 [Drummond A.J. et al., 2012], используя в каждом случае 4 цепи протяженностью от 1107 до 15 10 поколений, в зависимости от нуклеотидной матрицы. Число поколений подбиралось индивидуально, с целью обеспечения величины эффективного размера выборки (Effective Sample Size, ESS) для каждого параметра более 500. Датировку последовательностей осуществляли по дате забора крови в годовом исчислении. Параметры моделей и опции МСМС задавались в приложении Beauti v1.8.2. Оценку сходимости параметров цепей МСМС и анализ сгенерированных данных проводили в приложении Tracer v1.5, исключая во всех случаях первые 10% послестартовых симуляций (burn-in). Результаты, полученные в ходе двух независимых запусков, были совмещены с помощью программы LogCombiner v1.8.2. Построение результирующего (консенсусного) дерева проводили в приложении TreeAnnotator v1.4.7, исключая 25% послестартовых деревьев, считая их недостоверными, а оставшиеся суммировали в виде единственного дерева максимально надежных ветвей (Maximum clade credibility, MCC). Достоверность топологии BI-деревьев оценивали по рассчитанной величине апостериорной вероятности (Posterior Probability, PP); узлы с величиной PP более 0.9 считали достоверно установленными.
Графическую обработку филогенетических деревьев осуществляли с применением программ FigTree v 1.4.3 (http://influenza.bio.ed.ac.uk/software/) и iTOL (http://itol.embl.de/).
Уровень временного сигнала (clock-like структуры) в наборах данных, оценивали с помощью регрессионного анализа rootoip дистанций (длин ветвей) образцов с разными датами сбора в приложении TempEst [Rambaut A. et al., 2016].Идентификацию кластеров в филогенетических деревьях проводили с использованием приложения Cluster Picker v1.2 [Ragonnet-Cronin M. et al., 2013]. При проведении анализа нижняя граница значений бутстрэп-поддержки (или апостериорной вероятности) была установлена на уровне 0,9; верхний порог дистанции между последовательностями в группе составлял 5,0 нуклеотидных замен на сайт.
Набор данных для филогенетического анализа включал последовательности референсных штаммов, образцов внешней (аут-) группы и группы сравнения. В качестве референс-штаммов суб-субтипа А6 ВИЧ-1 были использованы последовательности изолятов вирусов от пациентов из Украины – 98UA0116 (GenBank Accession No.: AF413987), России – 03RU20 (GenBank Accession No.: AY500393) [Thomson M.M. et al., 2007] и Италии – 60000 (прибыл из Республики Гвинея; GenBank Accession No.: EU861977) [Riva C. et al., 2008]. Группа сравнения, используемая при уточнении филогенетического положения исследуемых штаммов, включала последовательности ВИЧ-1 суб-субтипов А1, А2, А3 и А4. Используемая при филодинамическом анализе аутгруппа была представлена последовательностями 56 изолятов суб-субтипа А1 ВИЧ-1 из Африки (GenBank-номера представлены в Приложении А). Источником последовательностей являлась база данных Лос-Аламосской национальной лаборатории (https://www.hiv.lanl.gov).
Время существования общего предка и демографическая история популяции ВИЧ-1 суб-субтипа А6 вируса в исследуемых регионах
Демографическая история суб-субтипа А6 ВИЧ-1 и время интродукции вируса в регион были определены с использованием молекулярных часов на ограниченной выборке образцов, полученных в разное время. Для расчета TMRCA и оценки численности популяции суб-субтипа А6 ВИЧ-1 в Пермском крае были отобраны 37 последовательностей вируса, полученных от пациентов между 1996 и 2011 гг.
Результаты проверки наличия молекулярных часов в эволюции вируса и достаточности временной структуры выборки были положительными. Значения корреляции между датами сбора и длинами ветвей (rootoip-расстоянием) пермских образцов вируса составили по фрагменту PR-RTpol и С2-С4 участку gp120env (r=0,62; P 110-4) и (r=0,58; P 110-4), соответственно. Средняя скорость нуклеотидных замен ([95% ДИ]) во фрагменте PR-RTpol составила 2,0710-3 [1,6010-3-2,5810-3] замен сайт-1 год-1, против 6,4510-3 [5,0010-3-8,0610-3] замен сайт-1 год-1для С2-V4 участка gp120env.
Реконструкция филогенетических отношений между образцами суб-субтипа А6 ВИЧ-1 из Перми разных лет представлена на Рисунке 13. Как видно из рисунка 13, конгруэнции между филогенетическими деревьями, полученными по данным разных генов, не наблюдается. Основные различия наблюдались в топологии А6-кластера (PP=1,0, во всех случаях) и касались расположения последовательностей, полученных в 2008 и 2011 годах. Оценка TMRCA (медиана [95%ДИ]) Пермской популяции суб-субтипа А6 по фрагменту PR-RTpol соответствовала 1993,5 году [1992,5-1994,5] и несколько предшествовала таковой по С2-V4 участку gp120env – 1995,0 год [1994,0 1996,0]. В то же время, анализ совмещенных фрагментов генома (PR-RTpol + С2-V4 gp120env) расположил TMRCA популяции суб-субтипа А6 ВИЧ-1 в регионе в 1994,0 году [1993,0-1995,0].
В целом же, эти различия в оценках TMRCA по разным участкам генома незначительны, на что указывают плотные и перекрывающиеся доверительные интервалы каждой из них.
Байесовские Скайрид-графики, полученные по данным каждого из анализируемых фрагментов генома и их совокупности, продемонстрировали однотипный характер увеличении эффективной численности популяции вируса в регионе с течением временем (Рисунок 14). В период с 1996 по 1999 года, рост популяции суб-субтипа А6 в регионе демонстрировал колебательный характер. Начиная примерно с 2000 и до 2005 года, эффективная численность популяции вируса увеличивалась экспоненциально, после чего наблюдалось снижение темпов ее роста, вплоть до 2011 года.
Исследование филодинамики суб-субтипа А6 ВИЧ-1 в Иркутской области было проведено на выборке из 23 образцов, собранных от пациентов в 1999 и 2012 годов. Как и в предыдущем случае, наличие молекулярных часов и достаточность временной структуры используемой выборки была подтверждена результатами регрессионного анализа rootoip-расстояний. Значения корреляции между датами сбора и длинами ветвей для иркутских образцов вируса составили по фрагменту PR-RTpol и С2-С3 участку gp120env (r=0,54; P 110-4) и (r=0,59; P 110-4), соответственно. Средняя скорость нуклеотидных замен ([95% ДИ]) во фрагменте PR-RTpol составила 1,8710-3 [1,5010-3 -2,2610-3] замен сайт-1 в год-1, против 9,8910-3 [7,1610-3-12,7110-3] замен сайт-1 в год-1для С2-С3 участка gp120env. Отметим, что оценка скорости эволюции для PR-RTpol, полученная на выборке иркутских образцов суб-субтипа А6 ВИЧ-1значимо не отличается от ранее полученной на выборке образцов из Пермского края; свидетельством этому служат перекрывающиеся доверительные интервалы каждой из них. Однако, этого нельзя сказать относительно анализируемого фрагмента gp120env. Объяснение кажущегося несоответствия скорости накопления замен в области env служит использование более короткого (231 н. о. vs 498 н.о., выборка из Пермского края) и вариабельного фрагмента этого гена в случае иркутских образцов.
Филогенетические деревья, реконструированные по результатам анализа обоих генов иркутских образцов суб-субтипа А6, в целом были конгруэнтными (Рисунок 15). Незначительные отличия в топологии А6-кластера (PP =1,0, во всех случаях) касались положения небольшого числа последовательностей, полученных от пациентов в 2012 г. Оценки TMRCA иркутской популяции суб-субтипа А6, путем анализа разных генов (и их комбинации), также несколько отличалась. При расчете TMRCA по данным фрагмента гена PR-RTpol общий предок был помещен в 1995,7 год [1994,6-1996,7]. В то же время, анализ фрагмента С2-С3 gp120env и совмещенных фрагментов генома (PR-RTpol + С2-С3 gp120env) определил в качестве TMRCA 1997,4 год [1996,3-1998,1].
Полученные по данным разных фрагментов генома (и их совокупности) Байесовские Скайрид-графики показывали однотипное увеличение эффективного размера популяции суб-субтипа А6 в регионе. На протяжении эпидемии, начиная с 1996 и до 2008 года эффективная численность популяции вируса в Иркутске возрастала по экспоненте; в последующий период, вплоть до 2012 года, наблюдается снижение темпов роста популяции вируса в регионе (Рисунок 16).
Тропизм используемых в работе штаммов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и связь тропизма с клинико-лабораторными показателями пациентов
Наличие в составе исследуемого фрагмента гена env ВИЧ-1, соответствующего V3-петле gp120, детерминирующей использование вирусом того или иного корецептора, позволило предсказать тропизм анализируемых в настоящем исследовании вариантов ВИЧ-1.
По результатам анализа последовательности V3-петли 202 пермских и иркутских образцов ВИЧ-1 суб-субтипа А6, 88,1% (178/202) были определены как R5-тропные, 8,9% (18/202) – R5X4-тропные и 3,0% (6/202) – X4-тропные варианты вируса. Распределение вариантов с различным тропизмом среди пациентов из указанных регионов представлены в Таблице 10.
Для дальнейшей оценки ассоциации между используемыми ВИЧ-1 корецепторами и клинико-эпидемиологическими показателями пациентов, потенциально связанными с тропизмом вируса, были отобраны 156 штаммов вируса с разным тропизмом (R5-, N=132; R5X4-, N=18; X4-тропные, N=6). С целью увеличения выборки в анализ были дополнительно включены 45 образцов вируса того же суб-субтипа (R5-, N=29; R5X4-, N=8; X4-тропные, N=8), последовательности V3-петли для которых были предоставлены нам коллегами из Центра СПИД г. Ноябрьска. Все используемые образцы вируса принадлежали ВИЧ-инфицированным инъекционным наркопотребителям и/или гетеросексуалам.
Распределение R5-, R5X4- или X4-вариантов вируса среди участвующих в исследовании ВИЧ-инфицированных ПИН и гетеросексуалов в целом было равномерным (Рисунок 23 А.). Показатели числа CD4+ Т-клеток, вирусной нагрузки и времени с момента постановки диагноза «ВИЧ-инфекция» до взятия образца (продолжительность заболевания) в изучаемых когортах пациентов с R5-, R5X4- или X4-вариантами вируса значимо не различались (P 0.05, во всех случаях; Рисунок 23 Б., В. и Г., соответственно).
По результатам количественной оценки числа выявленных R5-, R5/X4- и X4-вирусов среди ПИН и гетеросексуалов значимой взаимосвязи между частотой встречаемости R5- и неR5-вариантов и фактором риска выявлено не было (Рисунок 24 Г.). Анализ распределения R5-, R5/X4-и X4-вирусов среди пациентов с различным иммунным статусом обнаружил умеренную ассоциацию между частотой выявления неR5-вариантов ВИЧ-1 (R5X4- и X4-вирусов) и абсолютным значением числа CD4+ T-клеток (r=0,24; P=0,03). По мере снижения уровня CD4+ T-клеток у пациентов в пределе от 200 клеток/мм3 до 600 клеток/мм3 доля выявляемых неR5-тропных вариантов ВИЧ-1 увеличивалась. В группе лиц со значением данного показателя 200 такие варианты вируса выявлялись 6,8 раза чаще по сравнению с пациентами, число CD4+ T-клеток для которых было 600 (отношение рисков 6,78 [95% ДИ: 1,57-29,24]; P=0,01) (Рисунок 24 А.).
В то же время статистически значимой взаимосвязи между частотой встречаемости неR5-тропных вариантов вируса в интервале значений показателей: вирусной нагрузки, от 3 log10 копий РНК/см3 до 4,48 log10 копий РНК/см3 (r=0,01; P=0,35) и продолжительности заболевания, от 1 года до 9 лет (r=0,02; P=0,21) обнаружено не было (Рисунок 24 Б. и 24 В.).