Биотехнология получения и применение противовирсных моноклональных иммуноглобулиновых препаратов Глобенко, Людмила Алексеевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Традиционная биотехнология изготовления иммунных сывороток, иммуноглобулинов сводится к гипериммунизации животных-продуцентов (лошадей, баранов, кроликов и т.д.) соответствующими специфическими антигенами, получению от животных антителосодержащих сывороток и выделению из них специфических иммуноглобулинов.

Значительные успехи биотехнологии за последние 15-20 лет были достигнуты благодаря созданному в 1975 г. Келлером и Мильштейном методу получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. С его помощью получены моно-клональные антитела ко многим возбудителям вирусной природы.

Эти антитела нашли применение в создании диагностических препаратов, в технологии получения чистых антигенов и белков с помощью иммуносорбентов. а также при исследовании антигенных детерминант, расположенных на поверхности и внутри вирусной частицы. Решение указанной проблемы может быть достигнуто с использованием новых методов, которые основаны на достижениях молекулярной биологии, генной и клеточной инженерии, биоорганической химии, иммунологии.

Принципиально важной отличительной стороной указанных методов является то, что они основаны на использовании высокоспецифических моноклональных антител, а с их помощью осуществляется изучение особенностей структуры генома, физико-химических свойств компонентов вириона. Наиболее перспективным моле-кулярно-биологическим методом идентификации штаммов, фрагментов вириона является иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител.

Биотехнология моноклональных антител включает в себя технологическую и методическую цепочку, начиная от получения антигенов, затем моноклональных антител до создания на их основе методов идентификации антигенных сайтов на поверхности вирионов и диагностики заболеваний вирусной этиологии.

При диагностике инфекционных заболеваний оптимальным является применение моноклональных антител - специфического компонента иммуноферментного анализа. При этом обосновано применение моноклональных антител при диагности-се таких заболеваний как ящур и другие болезни с везикулярным синдромом, бо-іезнь Ауески, репродуктивно-респираторный синдром свиней, которые имеют либо широкое распространение, либо имеются затруднения при диагностике заболевания или характеристике возбудителя. В литературе представлены данные по изуче-

нию моноклональных антител, полученных к возбудителям болезней наиболее часто встречающихся в различных странах. Однако исследований по получении: моноклональных антител к возбудителям вирусных болезней, которые возникли Е СССР и в России, и по разработке диагностических методов с использованием эти> антител в нашей стране до восьмидесятых годов не проводились. Хотя эта проблема быль и остается актуальной для создания специфических и точных методов диагностики заболеваний и дифференциации штаммов вирусов, выделенных на территории СССР и России.

Представляют наибольший интерес моноклональные антитела, полученные на антигены вирусов, выделенных ранее и используемых в настоящее время в качестве производственных и применяемых при изготовлении вакцин и диагностику-мов. Работа в этом направлении не проводилась. Хотя известно, что в процессе пассажей при культивировании вирусов могут происходить изменения свойств вирусов, а поэтому необходимо постоянно следить за изменениями антигенной структуры вирионов, что возможно при применении моноклональных антител, полученных на цельные вирионы и их фрагменты. Кроме того, несмотря на имеющиеся публикации, которые касаются гибридомной биотехнологии получения иммуноглобулино-вых препаратов , они часто носят противоречивый харктер, так как результаты получены при использовании различных методик и других штаммов вирусов.

Перечисленные обстоятельства показывают, что исследования по получению моноклональных антител к вирусам, выделенным на территории России, разработке методов диагностики с использованием МАТ и использование МАТ в молекулярно-биологических исследованиях являются актуальными задачами как в научно-исследовательском, так и в практическом отношении.

Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка биотехнологии получения моноклональных антител к возбудителям болезней вирусной этиологии (ящур, другие везикулярные заболевания, болезнь Ауе-ски, репродуктивно-респираторныи синдром свиней), выделенных на территории Российской Федерации для разработки и усовершенствования средств диагностики и дифференциации возбудителей, а также для эпитопного картирования вирусных геномов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-разработать и подобрать наиболее эффективные методы получения очищенных и концентрированных антигенов вирусов и их фрагментов, относящихся к разным таксономическим группам, пригодных для получения моноклональных антител;

-получить гибридомы-продуценты моноклональных антител и отобрать наиболее перспективные для использования в биотехнологии;

-получить моноклональные антитела к возбудителям ящура и его фрагментам, а также других везикулярных болезней (ВБС, ВЭС), болезни Ауески и репро-дуктивно-респираторного синдрома свиней;

-разработать наиболее технологичные методы выделения специфических иммуноглобулинов и подготовить на их основе гомогенные по биологическим и физико-химическим свойствам препараты;

-изучить биологические свойства полученных моноклональных антител в различных иммунохимических реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами, их фрагментами и синтетическими пептидами;

-провести идентификацию антигенных сайтов на поверхности вирусных частиц с использованием моноклональных антител и различных вариантов иммуно-ферментного анализа;

-провести оценку пригодности препаратов моноклональных антител для диагностики некоторых вирусных заболеваний;

-подготовить коллекции моноклональных антител для использования в дифференциальной диагностике болезней вирусной этиологии;

-сконструировать и испытать диагностические наборы на основе моноклональных антител для обнаружения вируса ящура и противоящурных антител в ИФА;

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые.

-разработаны эффективные методы получения очищенных и концентриро ванных антигенов вирусов для получения и характеристики моноклональных ан тител;

-получены гибридомы-продуценты моноклональных антител и отобраны наи более перспективные для использования в биотехнологии;

- получены моноклональные антитела к возбудителям ящура и его фрагмен там (12S субъединицам и синтетическим пептидам), а также других везикулярны; болезней (ВБС, ВЭС), болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдромг свиней;

-изучены биологические свойства полученных моноклональных антител е различных реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами, их фрагментами и син тетическими пептидами;

-осуществлена идентификация антигенных сайтов на поверхности вирусны> частиц с использованием полученных моноклональных антител и различных вариантов иммуноферментного анализа;

-показана возможность использования моноклональных антител для диагностики ящура и других везикулярных болезней (ВБС, ВЭС), болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней;

Новизна научных исследований подтверждена 5 авторскими свидетельствами. 2 патентами и 1 положительным решением ВНИИГПЭ на выдачу патента Российской Федерации.

Практическое значение работы. На основании проведенных исследований разработан комплект методических и нормативно-технических документов, регламентирующих основные этапы гибридомной биотехнологии получения и применения моноклональных антител к производственным штаммам вируса ящура, которые утверждены ГУВ МСХ СССР и директором ВНИИЗЖ (ВНИЯИ). Создана коллекция штаммов гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусам ящура А₅, Агг. О,, Сі, Азия-1, САТ-1, ВБС, ВЭС, вируса болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Отобраны наиболее перспективные клоны-продуценты моноклональных антител с высокой стабильностью и антителопродуцирующей активностью, на которые

составлены паспорта и проведено их депонирование во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, г.Санкт-Петербург.

Получены жидкие и лиофилизированные препараты моноклональных антител и их конъюгаты с пероксидазой хрена, пригодные для определения вирусов и противовирусных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных, а также для изучения антигенной структуры возбудителей и анализа генно-инженерных продуктов и синтетических пептидов.

Создана коллекция моноклональных антител для использования в дифференциальной диагностике болезней с вирусной этиологией.

Сконструированы, изготовлены и испытаны диагностические наборы на основе поли- и моноклональных антител для обнаружения вирусов ящура и проти-воящурных антител в ИФА.

Ряд предложенных нами методических разработок применяется во ВНИИЗЖ и могут быть использованы другими учреждениями, занимающимися производством средств диагностики и профилактики ящура и других болезней сельскохозяйственных животных при выявлении возбудителей, дифференциации штаммов и их контроле при производстве вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка методов получения инактивированных, очищенных и концентрированных антигенов вирусов и их фрагментов, относящихся к различным таксономическим группам (семейства: Picornaviridae, Caliciviridae, Herpesviridae, Togaviridae).

2. Разработка методов получения специфических, гомогенных, очищенных, концентрированных и конъюгированных препаратов моноклональных антител к вирусным антигенам и их фрагментам для выявления и идентификации типовой и подтиповой принадлежности штаммов, возбудителей болезней, протекающих с везикулярным синдромом и некоторых других болезней вирусной этиологии.

3. Характеристика коллекции моноклональных антител к производственным штаммам вирусов ящура (А₅, А₂г, О,, С, №564, Азия-1 №48, САТ-1 №96) и болезни Ауески(УНИИЭВ-18В).

4. Схема идентификации антигенных сайтов на поверхности частиц вируса ящура с использованием моноклональных антител в различных вариантах иммуно-ферментного анализа и реакции нейтрализации.

5. Технология изготовления безопасных в ветеринарно-санитарном отношении антительных и антигенных препаратов для выявления возбудителей и для осуществления ретроспективной диагностики вышеуказанных болезней с помощью моноклональных антител.

Апробация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы на разных этапах ее выполнения рассматривались на заседаниях ученого соЕета ВНИЯИ, ВНИИЗЖ, ВНИИВВиМ, на заседаниях научно-технических советов ГУВ МСХ СССР и ГУНИ и ЭПУ МСХ СССР, на координационных совещаниях исполнителей НИР по проблеме ящура стран-членов СЭВ, Международных , Всесоюзных, Всероссийских и межинститутских научных конференциях.

Разработанные методы и средства проходили межинститутские, межведомственные и межлабораторные комиссионные проверки. Диагностические наборы на основе МАТ экспонировались на ВДНХ в 1989г. и удостоены серебряной медали.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 61 печатная работа в материалах международных конференций, рабочих совещаний специалистов стран-членов СЭВ, материалах Всесоюзных и Всероссийских конференций по проблемам ветеринарной вирусологии, иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии и эпизоотологии , в том числе получено 5 авторских свидетельств, 2 патента и 1 положительное решение ВНИИГПЭ на выдачу патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страни-