Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. История распространения вируса гриппа птиц 12
2.2. Этиология вируса гриппа птиц 14
2.2.1. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц 14
2.2.2. Морфология и антигенная структура вируса гриппа птиц 15
2.2.3. Физико-химические характеристики вируса гриппа птиц и устойчивость во внешней среде 17
2.2.4. Жизненный цикл вируса гриппа птиц 18
2.2.5. Факторы вирулентности вируса гриппа птиц и патогенез инфекции 21
2.3. Эпидемиология вируса гриппа птиц 23
2.3.1. Источники и пути передачи инфекции 23
2.3.2. Эпизоотическая ситуация по высокопатогенному гриппу A/H5N1 в России и мире за период 2014-2018 гг. 28
2.4. Клинические признаки, патологоанатомические и гистологические изменения при гриппе птиц 34
2.5. Профилактика и контроль заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц 38
2.6. Диагностика гриппа птиц 41
2.7. Заключение по обзору литературы 46
3. Собственные исследования и обсуждение 47
3.1. Материалы 47
3.2. Методы исследований 51
3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 62
3.3.1. Выделение и изучение свойств ВГП A/H5N1, вызвавшего вспышки болезни в Алтайском крае в 2014 г. 62
3.3.1.1. Особенности вспышки острой инфекции среди домашних птиц в Алтайском крае в 2014 г 62
3.3.1.2. Идентификация возбудителя заболевания и выделение изолятов ВГП. 63
3.3.1.3. Определение титра инфекционной активности выделенных изолятов ВГП А/H5N1. 64
3.3.1.4. Определение вирулентных свойств выделенных изолятов ВГП А/H5N1. 65
3.3.1.5. Генетическая характеристика изолята ВГП A/duck/Altai/469/2014 H5N1 . 67
3.3.2. Получение специфических компонентов для разработки метода по выявлению АГ вируса гриппа типа А в тканях птиц с использованием реакции ИГХ. 72
3.3.2.1. Получение фракции rNP вируса гриппа типа А. 73
3.3.2.2. Получение поликлональных антител против rNP вируса гриппа типа А 75
3.3.3. Разработка метода по выявлению АГ ВГП в тканях птиц с помощью реакции ИГХ на парафиновых срезах 76
3.3.3.1. Подготовка препаратов срезов тканей птиц для гистологического и ИГХ исследований. 76
3.3.3.2. Проведение ИГХ реакции на парафиновых срезах тканей здоровых и экспериментально зараженных вирусом A/H5N1 птиц и анализ результатов. 78
3.3.4. Особенности течения инфекции у птиц при экспериментальном заражении ВГП A/duck/Altai/469/14 H5N1 81
3.3.4.1. Схема экспериментального заражения птиц вирусом A/duck/Altai/469/14 H5N1 с целью выявления особенностей течения болезни . 81
3.3.4.2. Клинические признаки, патологоанатомические и патоморфологические особенности течения инфекции у кур. 84
3.3.4.3. Клинические признаки, патологоанатомические и патоморфологические особенности течения инфекции у уток 85
3.3.4.4. Клинические признаки, патологоанатомические и патоморфологические особенности течения инфекции у индеек 94
4. Заключение 101
4.1. Выводы 103
5. Список сокращений 105
6. Список литературы 106
7.Приложения 129
- Жизненный цикл вируса гриппа птиц
- Генетическая характеристика изолята ВГП A/duck/Altai/469/2014 H5N1
- Схема экспериментального заражения птиц вирусом A/duck/Altai/469/14 H5N1 с целью выявления особенностей течения болезни
- Клинические признаки, патологоанатомические и патоморфологические особенности течения инфекции у индеек
Жизненный цикл вируса гриппа птиц
Процессу проникновения вируса гриппа в клетку предшествует его прикрепление к поверхностным рецепторам (корецепторам) с последующей интернализацией лигандов. Основными рецепторами вирусов гриппа на поверхности клетки-хозяина являются N-ацетилнейраминовые (сиаловые) кислоты, которые встречаются у клеток различных типов многих видов животных и человека [52]. НА вируса гриппа обладает специфичностью в отношении связывания различных типов сиаловых кислот. Распределение a-2,3- или a-2,6-рецепторов на клеточной поверхности является одним из определяющих признаков клеточного тропизма и фактором, определяющим патогенез вирусов гриппа [171].
Так, НА вируса гриппа птиц предпочтительно связывается с a-2,3-сиаловыми кислотами, поскольку рецепторы именно такого типа преобладают в кишечном тракте водоплавающих птиц, представляющих собой естественный резервуар вирусов гриппа А. На поверхности эпителиальных клеток верхних дыхательных путей человека преобладают a-2,6-сиаловые кислоты, хотя встречаются и a-2,3; это объясняет тот факт, что хотя НА вируса гриппа человека специфически взаимодействует с a-2,6-сиаловыми кислотами, вирусы гриппа птиц изредка способны инфицировать людей без предварительной адаптации [162].
Вопрос о корецепторах вируса гриппа до сих пор остается слабо изученным. Есть данные, что при гриппозной инфекции макрофагов поверхностные вирусные белки НА и NА прямо взаимодействуют с доменом маннозных рецепторов, которые сами являются сиалированными белками. Дополнительные корецепторы, связанные с маннозой или галактозой, не только повышают репродукцию вируса в клетках, но и усиливают фагоцитоз в макрофагах мышей [161, 119].
Этапы репродукции вируса гриппа представлены на рисунке 3.
При заражении клеток-мишеней субъединица гемагглютинина HА1 связывается с сиаловыми кислотами (SA) на поверхности клеток-мишеней, и вирионы проникают в клетку с помощью эндоцитоза.
Низкий рН внутри эндосомы вызывает конформационные изменения в субъединице HА2, приводящие к изменению конформации НА, и вызывает слияние вирусной и эндосомальной мембран. Ионные каналы, сформированные белком М2, способствуют дополнительному закислению среды внутри эндосомы, что приводит к диссоциации комплекса vRNP от матриксного белка М1 и последующему проникновению RNP в цитоплазму и далее - внутрь клеточного ядра.
Репликация вирусной РНК протекает в ядре с участием трех вирусных полимераз (PA, PB1 и PB2). Cинтез вирусных белков проходит в цитоплазме, процессинг белков М1, HA и NA осуществляется в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, после чего эти белки направляются к клеточной мембране.
Вновь синтезированный вирусный белок NP направляется в ядро, где образует комплекс с вирусной PНК и полимеразами (RNP) и далее, при участии матриксного белка (М1), направляется из ядра в цитоплазму и к клеточной мембране для сборки вирусной частицы и образования оболочки из клеточной мембраны в процессе почкования. Освобождение почкующихся вирусных частиц от клеточной мембраны осуществляется при участии поверхностного вирусного белка NА, который отщепляет сиаловые кислоты (SA), связывающие HА вируса с клетками и препятствующие освобождению вирусных частиц для дальнейшего инфицирования соседних клеток.
8-й сегмент РНК вируса гриппа кодирует так называемые неструктурные белки NS1 и NS2. Белок NS1 является основным фактором патогенности вируса гриппа, так как он подавляет трансляцию клеточной мРНК, а также синтез и работу системы интерферона с использованием различных механизмов. NS2 (NEP) обеспечивает ядерный экспорт вирусной РНК в комплексе с NP [13, 154].
Генетическая характеристика изолята ВГП A/duck/Altai/469/2014 H5N1
Ввиду того, что выделенные изоляты оказались схожи по ряду характеристик, для выполнения полногеномного секвенирования был выбран первый выделенный от домашней утки вирус A/duck/Altai/469/2014 H5N1.
Согласно филогенетическому анализу с использованием международной базы данных GenBan установили, что по гену гемагглютинину наиболее родственными к изучаемому патогену оказались изоляты вируса гриппа обширной генетической линии A/Goose/Guangdong/96 клада 2.3.2.1с, которая появилась в Китае с 2014 г., затем вызвала серию эпизоотий в России, Болгарии, Румынии и получила распространение в Индии, странах Ближнего Востока и Африки (рис. 4) [136, 153, 91].
A/H5N1 генетической линии 2.3.2.1с в период с 2014 по 2017 циркулировали в странах Юго-Восточной Азии, Западной Африки, Ближнего Востока и Восточной Европы (рис. 5) [53, 92, 76, 24].
По данным отчета OFFLU в период с сентября 2017 по февраль 2018 гг. вспышки острой инфекции, вызванные изолятами ВГП A/H5N1 клада 2.3.2.1с регистрировали в Бангладеше, Камеруне, Ираке, Вьетнаме, Индонезии, Камбодже, Мьянме (Бирме) [201, 129]. В России последний случай инфицирования домашней птицы вирусом A/H5N1 клада 2.3.2.1с был зарегистрирован в 2015 г. в Сибирском Федеральном округе. Однако эпизоотическая ситуация в мире не исключает повторного заноса вируса A/H5N1 на территорию РФ из эндемичных очагов по Восточно-Африканскому и Азиатскому пролетным путям диких птиц [201, 24].
По гену PВ2 исследуемый изолят A/duck/Altai/469/2014 H5N1 относится к группе реассортантов вируса H5N1 с антигенным шифтом от низкопатогенного подтипа H9N2 (рис. 6).
Анализ нуклеотидной последовательности полного генома изолята A/duck/Altai/469/2014 H5N1 показал ряд маркерных замен в структуре основных белков вируса (табл. 9).
Гемагглютинин (HA) определяет ряд важнейших биологических свойств вируса гриппа, в первую очередь видовую специфичность (круг хозяев) и вирулентность. Большинство аминокислотных позиций гена HA указывают на высокое сродство рецепторсвязывающего сайта вирусного протеина к Sia2-3Gal-рецепторам эпителиальных клеток птиц [176]. В структуре гена полимеразного комплекса PB2, отвечающего за транскрипцию м-РНК, отмечены аминокислоты в положениях Q591, E627 и D701, что способствует адаптации вируса к репликации в клетках птиц. В то же время выявлены некоторые маркерные замены в аминокислотных последовательностях генов HA и PB2, которые предполагают распознавание Sia2-6Gal-рецепторов эпителия и способствуют проникновению и размножению вируса в клетках млекопитающих. Замены, выявленные в предсказанной аминокислотной последовательности неструктурного белка NS, в частности S42, E87, F98, M101, и белка M1 указывают на более высокую вирулентность исследуемого изолята для мышей. Имеющаяся аминокислотная делеция в вирусной нейраминидазе указывает на высокую вероятность инфицирования домашней птицы в случае контакта с вирусом от диких водоплавающих особей.
Отсутствие аминокислоты Y в позиции 275 вирусной нейраминидазы свидетельствует о чувствительности вируса к озельтамивиру. Предсказать чувствительность к препаратам амантадина по результатам анализа маркерных замен затруднительно, в частности выявлена аминокислота S31 свидетельствующая о чувствительности вируса к амантадину, но выявлена также аминокислота I27 которая характерна для вирусов слабо чувстительных к амантадину.
На этом основании данный штамм был депонирован в коллекцию штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» как представитель современной клады 2.3.2.1с изолятов вируса H5N1 c уникальными генетическими характеристиками.
В дальнейшем штамм был использован для изучения биологических свойств вируса А/H5N1 при экспериментальном заражении различных видов птиц.
Схема экспериментального заражения птиц вирусом A/duck/Altai/469/14 H5N1 с целью выявления особенностей течения болезни
С целью понимания механизма патогенеза заболевания, а также для прогнозирования эпизоотической опасности выделенного патогена, проведено три эксперимента по заражению домашней птицы: 6-недельных кур, 3-недельных уток и 6-недельных индеек вирусом A/duck/Altai/469/14 H5N1 в дозе 5,0 lg ЭИД50/0,5см3.
Не иммунных к вирусу гриппа птиц каждого вида содержали в изолированных боксах со свободным доступом к корму и воде. В каждом эксперименте подопытных особей разделяли на группы, согласно представленной в таблице 15 схеме.
Экспериментальное заражение особей I и II групп проводили интраназально в объеме 0,25 см3 в каждый носовой ход в дозе 5,0 lg ЭИД50/0,5см3. Птицам контрольных групп (III) вводили ЭЭЖ от СПФ-КЭ аналогичным способом. Длительность каждого опыта составляла 5-6 сут.
За птицей был установлен ежесуточный клинический контроль. В экспериментальной группе I каждой особе присваивали порядковый номер c целью выявления особенностей течения болезни и последующего расчета инкубационного периода (MTO) и среднего времени гибели (MDT) (п. 3.2 раздела «Материалы и методы»). Состояние цыплят из группы I (наблюдение патологического процесса) оценивали по следующим критериям: З – птица здорова; Б - птица больна; ТБ – птица тяжело больна; П – птица погибла.
Первый этап патоморфологического исследования проводили посредством визуального осмотра изменений внутренних органов при патологоанатомическом вскрытии павших (группа I) и убитых с диагностическими целями птиц (группа II).
Следующий этап патоморфологического исследования включал оценку поражений органов экспериментально зараженных вирусом A/H5N1 птиц каждого вида на тканевом и клеточном уровнях с применением методов гистологического и ИГХ анализа.
В группах II и III ежесуточно осуществляли отбор образцов внутренних органов размером 0,5 см3: тканей респираторной, пищеварительной, сердечно-сосудистой, нервной, выделительной, лимфоидной и мышечной систем, начиная с 1 сут после заражения.
Препараты фиксировали в смеси спирт-формол по Шафферу, через 48 часов осуществляли проводку и заливку материала в парафиновые блоки. С помощью ротационного микротома Microm HM340E готовили парные срезы тканей органов индеек толщиной 5-7 мкм. Один из препаратов подвергали окраске Г-Э, а его дубликат - ИГХ исследованию. Подготовку образцов срезов к ИГХ окрашиванию осуществляли по схеме, представленной в п. 3.2 раздела «Материалы и методы».
Этапы реакции осуществляли согласно протоколу к набору «Reveal Biotin-Free Polyvalent DAB» (Spring Bioscience, США) для ИГХ исследования тканей. В качестве первичных использовали полученные нами поликлональные АТ против rNP вируса гриппа типа А в разведении 1:2000.
Фотодокументирование окрашенных препаратов срезов тканей осуществляли с помощью камеры, подключенной к микроскопу Nikon Eclipse Ti-E C2+. В работе представлены микрофотографии образцов фрагментов органов птиц, отобранных через 2-4 сут после инокуляции, в которых были выявлены выраженные изменения структуры ткани с распространением вируса в пораженных участках.
Клинические признаки, патологоанатомические и патоморфологические особенности течения инфекции у индеек
Производство мяса индейки – это активно развивающаяся в нашей стране птицеводческая отрасль: в 2017 г. товарное производство мясной продукции оценивалось в 222 тыс. т в убойном весе, к 2020 году ожидается рост указанного показателя до 485 тыс. т [8]. При этом данный вид птиц очень восприимчив к вирусу А/Н5 [27, 102, 143, 160]. Так, в конце 2016 – начале 2017 гг. в Ростовской области при вспышках высокопатогенного гриппа А/Н5N8 было уничтожено более 500 тыс. голов индеек [201].
Таким образом, индейка является актуальным развивающимся направлением сельскохозяйственного производства, поэтому была выбрана для воспроизведения экспериментальной инфекции высокопатогенного гриппа при заражении изолятом ВГП A/duck/Altai/469/14 H5N1.
Клинические симптомы заболевания появились у индеек через 2 сут после введения вируса. Птицы были угнетены, некоторые стояли с опущенными вниз крыльями (парез). У половины индеек выявляли слизистые истечения из носа, отдышку, диарею с выделениями бело-желтого цвета.
Через 3 сут после начала эксперимента наблюдали выраженное нарушение систем кровообращения у подопытных особей: у 8 из 10 птиц, в том числе трех погибших, отмечали цианоз лап и шеи (рис. 19 а).
Развитие симптомов поражения нервной системы различной степени тяжести в виде дискоординации движений, треморов, парезов, нистагма глаз наблюдали у 7 из 10 индеек через 3-4 сут после заражения (рис. 19 б).
Эксперимент закончился через 5 сут после инокуляции индеек ВГП A/duck/Altai/469/14 H5N1, в результате чего погибли все подопытные особи (табл. 22).
Расчетные параметры патогенности течения гриппозной инфекции у индеек оказались чуть выше, по сравнению с курами: MTO составил 2,4 сут., MDT - 3,8 сут. Патологоанатомическое вскрытие павших (группа I) и убитых с диагностическими целями птиц (группа II) показало следующие изменения внутренних органов: спленомегалию, геморрагический и экссудативный диатез множества внутренних органов, миокардиодистрофия и гидроперикардит, кровенаполненность легких, нефрит, крупноочаговые кровоизлияния в поджелудочной железе, катаральное воспаление желудка и кишечника (рис. 20).
Следующий этап патоморфологического исследования включал оценку поражений органов, экспериментально зараженных вирусом A/H5N1 индеек на тканевом и клеточном уровнях, с применением методов гистологического и ИГХ анализа. Для этого от птиц II (изучение патоморфологических изменений) и III (контроль) групп отбирали фрагменты трахеи, легкого, тонкого кишечника, печени, поджелудочной железы, мозга, мозжечка, сердца, почек, селезенки и скелетных мышц.
Согласно исследованиям ученых предыдущих лет по экспериментальным заражениям индеек ВГП A/H5N1 обширное распространение вируса в тканях происходит через 2-3 сут после инфицирования птиц [139, 143, 160, 102 ].
Респираторный тракт. В трахеях выявляли очаговые геморрагии за счет инфильтрация эритроцитов в слизистую и подслизистую оболочки. В легких отмечали умеренный ателектаз воздухоносных капилляров (рис. 21).
Пищеварительная система. В железистом желудке просвет подслизистых кишечных желез сужен, в междольковом пространстве наблюдали очаги пролифирации лимфоцитов. В основании ворсинок тонкого кишечника выявляли очаги воспалительно-клеточной инфильтрации, в апикальной части – вакуолизацию эпителиальных клеток. В препарате поджелудочной железы границы ацинусов почти не различимы, отмечены обширные области коагуляционного некроза эпителия ацинарных клеток, которые ассоциированы с размножением ВГП. (рис. 22).
Выделительная система. В почках наблюдали дилатацию почечных канальцев, некроз почечных телец с выходом наружу эритроцитов.
Размножение ВГП выявляли в эпителии праксимальных канальцев. Сердечно-сосудистая система. В сердце отмечали дистрофию миокарда, обширные области некроза кардиомиоцитов, лимфоцитарно-плазмоцитарным инфильтрат.
Лимфоидные органы. Области белой и красной пульпы селезенки почти неразличимы, ввиду множественных очагов некробиоза клеток лимфоидного ряда (рис. 23).
Нервная система. В ткани головного мозга регистрировали вакуолизацию нейропиля, периваскулярный отек. В мозжечке отмечали некроз нейронов Пуркинье, встречали области геморрагий в молекулярном и зернистом слоях (рис. 24).
Мышечная система. В препаратах скелетной мускулатуры наблюдали единичные очаги дегенерации мышечных волокон, которые были ассоциированы с локализацией ВГП.
Выявленные при ИГХ анализе поражения были ассоциированы с распространением вируса в отобранных образцах органов. В таблице 23 представлены данные о локализации и степени распространении АГ ВГП в исследуемых тканях.
Экспериментальных данных по заражению индеек вирусом A/H5N1 в зарубежных публикациях представлено мало, а в отечественной литературе подобных исследований не найдено (табл. 24). К тому же, целями работ E.W. Aldous с соавт. (2010 г.) и W.N. Kilany с соавт. (2011 г.) являлась оценка качества ветеринарных препаратов, поэтому детальной патоморфологической характеристики течения болезни у птиц не отмечено [102, 160].
Результаты нашего опытного заражения индеек сравнимы с исследованием Mehrabanpour M.J. с соавт. (2007 г.), в котором приведены гистологические описания изменений в тканях селезенки, головного мозга, легких, поджелудочной железы и слепых отростков кишечника при инфицировании индеек изолятом ВГП, выделенным во Вьетнаме в 2005 году, без указания локализации АГ в клетках [144].