Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Эпизоотология АЧС 14
2.2 Устойчивость вируса АЧС 19
2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения 22
2.4 Иммунитет и вакцинопрофилактика АЧС 25
2.5 Классификация и таксономия 27
2.6 Структура вириона 27
2.7 Морфогенез вируса АЧС 30
2.8 Структура генома вируса АЧС 34
2.9 Анализ структуры генома вируса АЧС 37
2.10 Заключение по обзору литературы 46
3 Собственные исследования и обсуждение 48
3.1 Материалы и методы 48
3.2. Результаты собственных исследований и обсуждение 54
3.2.1 Изучение культуральных свойств изолятов ВАЧС 54
3.2.2 Биопробы на естественно восприимчивых животных 61
3.2.3 Биопроба на свиньях с заражением штаммом Ставрополь 01/08 61
3.2.4 Биопроба на свиньях с заражением изолятом Kashino 04/13 67
3.2.5 Биопроба на свиньях с заражением изолятом Odintsovo 02/14 72
3.2.6 Сравнительный анализ результатов биопроб 79
3.2.7 Полногеномное секвенирование 82
3.2.8 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 92
3.2.9 Усовершенствование схемы первичной оценки и группирования изолятов ВАЧС 108
4 Заключение 111
4.1 Выводы 113
5 Список сокращений 115
6 Список литературы
- Устойчивость вируса АЧС
- Структура генома вируса АЧС
- Биопробы на естественно восприимчивых животных
- Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей
Введение к работе
1.1 Актуальность темы исследования. Африканская чума свиней (АЧС, Pestis africana suum) – широко распространнная контагиозная вирусная геморрагическая болезнь животных, поражающая диких кабанов, бородавочников и домашних свиней всех пород и возрастов.
Как сама болезнь, так и применяемые меры борьбы оказывают значительное социально-экономическое воздействие на поражнные страны.
На территорию Российской Федерации в 2007 году из Грузии был занесн вирус АЧС II генотипа, по генетической структуре схожий с вирусом, циркулирующим в Мозамбике и Мадагаскаре [19]. По состоянию на 31 декабря 2016 г. зафиксировано 1112 вспышек заболевания.
Для вируса АЧС характерны гемадсорбирующая активность, эволюционное разнообразие и высокая генетическая и антигенная гетерогенность популяции, что обусловлено особенностями строения его генома и работы его ферментов. Длина генома ВАЧС может варьировать от 170 до 193,4 тысяч пар оснований, а кодируемая им вирусная полимераза Х обладает низкой нуклеотидной специфичностью и допускает наибольшее число ошибок при заполнении нуклеотидных пропусков. При этом вирусная лигаза также чрезвычайно толерантна к ошибкам полимеразы, что способствует их закреплению в геноме вируса [17].
Помимо указанных причин при репродукции вируса в культуре клеток макрофагов свиньи и в организме клеща значительно увеличивается число точечных мутаций по всей длине генома вируса АЧС [8, 18].
Существуют многочисленные научные данные, подтверждающие гетерогенность популяции вируса АЧС. В известных случаях, когда вирус длительное время циркулировал в дикой природе, анализ выделенных изолятов выявлял характерную гетерогенность сформировавшейся вирусной популяции, регистрировалось изменение вирулентности и антигенных свойств изолятов. По данным R. Portugal et al. (2015) в Португалии в 1960 г. был выделен высоковирулентный гемадсорбирующий изолят Lisbon 60, а спустя 8 лет в той же местности был выделен низковирулентный негемадсорбирующий изолят NH/P68, введение которого обеспечивало животным полную устойчивость к последующему заражению высоковирулентным изолятом Lisbon 60.
Boinas et al. (2004), изучая 10 полевых изолятов вируса АЧС, циркулировавших на фермах Португалии в 1988-1993 гг., обнаружили одновременную циркуляцию двух вирусных вариантов, один из которых вызывал гемадсорбцию в чувствительных культурах клеток и был патогенен для домашних свиней, в то время, как второй вариант вируса являлся негемадсорбирующим и апатогенным.
Freitas et al. (1978) сообщают, что во время эпизоотии в Бразилии в 1978 г. смертность животных 41,5%, а спустя 1 месяц снизилась до 0,16%. Установили наличие одновременной циркуляции двух независимых вариантов ВАЧС: средне- и низковирулентного.
Многообразие генетических вариантов вируса АЧС является одной из причин отсутствия эффективных вакцин против данной болезни. На сегодняшний день на основании филогенетического анализа последовательности гена B646L, кодирующего основной капсидный белок ВАЧС vp72, различали 22 генотипа вируса, а по новейшим данным, полученным J. E. Achenbach et al. (2016) установлено существование нового, XXIII генотипа [15, 16]. Серологическая классификация, разработанная во ВНИИВВиМ, распределяет большинство известных изолятов на 9 сероиммунотипов [7, 9].
Уникальные свойства вируса в сочетании с отсутствием методов специфической
профилактики и лечения болезни превращают АЧС в глобальную угрозу свиноводству.
Поэтому наиболее действенными и эффективными средствами контроля
распространения болезни до настоящего времени являются быстрая диагностика, использование политики стемпинг-аута в очагах инфекции и жсткое карантинирование неблагополучных территорий. Разработка и совершенствование эффективных мер борьбы с АЧС требуют дальнейшего многостороннего изучения болезни и е возбудителя. Для создания средств специфической профилактики, диагностики и борьбы с АЧС вопрос группирования и классификации изолятов является первостепенным, на необходимость изучения и паспортизации полевых изолятов вируса АЧС неоднократно указывалось на совещаниях экспертов ФАО/ЕЕС и МЭБ по АЧС.
1.2 Степень разработанности проблемы. Первые исследования по изучению вируса АЧС в СССР были выполнены в ВИЭВ и ВНИИВВиМ. Они позволили определить ключевые моменты, влияющие на репродукцию, вирулентность, структуру вируса и характеристики течения болезни, разработать методы культивирования вируса и подходы к его серотиповой классификации [2 ,6, 9, 10].
На сегодняшний день благодаря исследованиям отечественных и иностранных авторов установлены общая структура генома возбудителя АЧС и функции большинства вирусных генов. Изучены структурные белки вириона, белки прикрепления, вирусные гомологи клеточных белков, нуклеазы и прочие специфические ферменты [16]. V. O’Donnell et al. (2015) установили, что удаление 6 генов в составе мультигенных семейств MGF 360 и 505 приводит к утрате вирусом АЧС вирулентности для свиней [11].
Тем не менее, функции отдельных генов, в том числе функции большинства генов мультигенных семейств, еще недостаточно изучены. Идентификация таких генов
сделает возможным получение делеционных мутантных вируса и разработку экспериментальных вакцин на их основе [11, 12, 13].
Ранее проведенные исследования российских полевых изолятов вируса АЧС, выделенных при вспышках у домашних свиней и диких кабанов в 2007-2009 гг., выполненные В.М. Балышевым с соавт. (2010), показали, что на территорию РФ был занесн и продолжает циркулировать высоковирулентный вирус АЧС, вызывающий гибель 100% восприимчивых животных на 3-7 сутки после заражения. Аналогичные результаты получил С.А. Белянин с соавт. (2011), в их работе смертность среди экспериментально заражнных животных составила 100% на 6-11 сутки [1, 4]. В зарубежной литературе сведения о высокой вирулентности российских изолятов ВАЧС приводятся в работах Chapman, Dixon и официальных сводках European Food Safety Authority (EFSA).
Для наиболее полного и подробного изучения свойств выделяемых вирусных изолятов АЧС необходимо исследовать в совокупности как их биологические свойства, так и генетическую структуру, поскольку сопоставление изменений в вирусном геноме выделенных изолятов с изменениями их биологических свойств позволяет установить причины, обуславливающие изменения вирулентности, клинических проявлений и антигенную вариабельность вируса.
Для определения изменчивости вируса АЧС решающее значение имеют данные, получаемые в ходе полногеномного секвенирования. В частности, в работе Gallardo et al. (2014) исследователям с помощью данных, полученных при полногеномном секвенировании и сравнении с геномом изолята Georgia 2007/1, удалось обнаружить новый тандемный повтор GGAATATATA, обнаруженный в интергенном регионе I73R-I329L и позволяющий проводить дифференциацию современных российских и европейских изолятов ВАЧС. Эти данные нашли подтверждение в работах ВНИИВВиМ и наших исследованиях [14, 19].
На настоящий момент в базах данных GenBank опубликовано 18 полногеномных
последовательностей различных изолятов ВАЧС, что открывает возможности для
проведения их филогенетического анализа, установления эволюционных связей,
обнаружения изменений и особенностей геномов и аминокислотных
последовательностей кодируемых ими белков, а также определения эволюционной истории и внутри генотипового распределения вирусных изолятов.
Следовательно, работа по сравнительному анализу биологических свойств новых изолятов и изучению структуры их геномов является актуальной.
1.3 Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы являлось определение полных нуклеотидных последовательностей геномов полевых изолятов
вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации и проведение сравнительного анализа биологических свойств и выявленных отличий.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
а) изучить основные биологические свойства выделенных изолятов и отобрать
изоляты вируса АЧС с отличающимися от штамма Ставрополь 01/08 биологическими
свойствами;
б) подобрать методы очистки вируса АЧС и выделения его ДНК, пригодной для
полногеномного секвенирования;
в) определить полные нуклеотидные последовательности генома вируса АЧС
выбранных изолятов;
г) провести сравнительный анализ структуры геномов вируса АЧС выбранных
изолятов с геномом изолята Georgia 2007/1;
д) провести сравнительный анализ выявленных изменений в геномах изолятов со
степенью изменения их биологических свойств;
е) определить маркерные области в геноме вируса АЧС, по которым возможно
проводить внутригенотиповую дифференциацию изолятов вируса АЧС,
циркулирующего на территории РФ.
1.4 Научная новизна результатов исследований. Для сравнительного анализа отличий в геноме впервые определены биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, установлены основные параметры развития болезни: длительность сроков проявления признаков болезни и наступления гибели животных, а также характерные патологоанатомические признаки.
Впервые определены и опубликованы в базе данных GenBank полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 под номерами KJ747406.1 и KP843857.1, соответственно.
Проведенный сравнительный анализ позволил выявить достоверные различия в нуклеотидных последовательностях геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, затрагивающие области генов и мультигенных семейств, ответственных за вирулентность вируса и его репродукцию в организме клещей; в том числе структурные белки, гомологи клеточных белков, ферменты обмена нуклеиновых кислот, а также вспомогательные протеины, участвующие в сборке вириона.
Впервые обнаружена встройка, представляющая собой прямой тандемный повтор в интергенном регионе 9R/10R длиной 17 нуклеотидов. Проведен анализ пространственно-временного распространения современных российских и европейских изолятов вируса АЧС, имеющих в геноме встройки в интергенных регионах 9R/10R и I73R/I329. Установлены предположительные географические регионы возникновения встроек в геноме циркулирующего вируса. Показана возможность проведения
внутригенотиповой дифференциации и отслеживания динамики распространения вируса АЧС по наличию данных встроек.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Полные геномные
последовательности российских изолятов вируса АЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14
могут быть использованы для изучения молекулярно-биологических свойств вируса
АЧС.
Вирус АЧС изолята Odintsovo 02/14 детально охарактеризован и депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Усовершенствована разработанная А. Казаковой и А. Варенцовой [3, 5] схема систематизации выделяемых изолятов вируса АЧС на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов и интергенных регионов.
Разработаны гармонизированные с требованиями МЭБ к референтным
лабораториям «Методические рекомендации по наработке ДНК вируса африканской
чумы свиней в первичной культуре клеток макрофагов свиньи для последующего
пиросеквенирования»; «Методические рекомендации по получению препаратов ДНК
вируса африканской чумы свиней из цельной крови свиней для
высокопроизводительного полногеномного секвенирования»; «Методические
рекомендации по оценке клинических признаков и патологоанатомических изменений
при экспериментальном заражении вирусом африканской чумы свиней»;
«Методические рекомендации по выявлению генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 9 октября 2015 г.; 9 октября 2015 г.; 9 октября 2015 г.; 25 декабря 2015г., соответственно.
1.6 Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали
молекулярно-биологические (ПЦР, пиросеквенирование, сравнительный анализ
нуклеотидных последовательностей, филогенетический анализ), вирусологические
(вирусовыделение, культивирование вируса, титрование вируса, постановка биопроб)
методы исследований, а также очистку вируса и выделение недеградированной
вирусной ДНК.
1.7 Положения, выносимые на защиту:
а) биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14
отличаются от таковых штамма Ставрополь 01/08;
б) определены и депонированы в базе данных GenBank полные нуклеотидные
последовательности генома вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 под
номерами KJ747406.1 и KP843857.1, соответственно;
в) в геноме изолята Odintsovo 02/14 присутствует дополнительный прямой
тандемный повтор GGAATATATA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Kashino
04/13 и Georgia 2007/1;
г) в геноме изолята Kashino 04/13 присутствует дополнительный прямой тандемный
повтор GATAGTAGTTTAGTTAA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Odintsovo
02/14 и Georgia 2007/1;
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2013-2015 гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении ФГБУ «ВНИИЗЖ».
1.8 Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает свою искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ
«ВНИИЗЖ»: к.б.н. Варенцовой А.А., к.б.н. Елсуковой А.А., к.б.н. Зинякову Н.Г, к.в.н.
Першину А.С., к.б.н. Ремыге С.Г., к.в.н. Шевцову А.А., вед. биологу Жукову И.Ю, к.в.н.
Иголкину А.С. за помощь в проведении отдельных этапов работы, проф. Рахманову
А.М. и проф. Груздеву К.Н. за консультативную помощь и содействие в выполнении
работы и сотрудникам ИАЦ Россельхознадзора за предоставленный иллюстративный
материал по эпизоотической ситуации в РФ.
1.9 Степень достоверности и апробация результатов. Материалы
диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и
методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-2015 гг.), на заседаниях НТС (Научно-
технического совета) Россельхознадзора (2014-2015 гг.), 4 и 5 международном
ветеринарном конгрессе (Казань, 2014г и Москва, 2015 г.) на VII-VIII-X ежегодной
встрече Европейской исследовательской группы Epizone (2013, 2014, 2016 гг.), на 18-й
Международной научно-методической конференции по патологической анатомии
животных (г. Москва, 2014 г.), на 17-й Международной конференции по вирусологии и
инфекционным болезням (г. Лондон, 2015), на 6 Международном ветеринаром
конгрессе (с. Сочи, 2016).
1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13
научных работ, в том числе 5 статей - в изданиях по перечню ВАК Министерства
образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах
компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения;
иллюстрирована 20 таблицами и 21 рисунком. Список использованной литературы
включает 225 источников, из них 161 иностранный. В приложении представлены копии
титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее
научную новизну и практическую значимость.
Устойчивость вируса АЧС
Впервые определены и опубликованы в базе данных GenBank полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 под номерами KJ747406.1 и KP843857.1, соответственно.
Проведенный сравнительный анализ позволил выявить достоверные различия в нуклеотидных последовательностях геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, затрагивающие области генов и мультигенных семейств, ответственных за вирулентность вируса и его репликацию в организме клещей; в том числе структурные белки, гомологи клеточных белков, ферменты обмена нуклеиновых кислот, а также вспомогательные протеины, учавствующие в сборке вириона.
Впервые в РФ были обнаружены встройки, представляющие собой прямые тандемные повторы в интергенных регионах 9R/10R и I73R/I329L длиной 17 и 10 нуклеотидов, соответственно. Проведен анализ пространственно-временного распространения современных российских и европейских изолятов вируса АЧС, имеющих тандемные повторы в геноме. Установлены предположительные сроки и регионы возникновения встроек в геноме циркулирующего вируса. Показана возможность проводить внутригенотиповую дифференциацию и отслеживать динамику распространения вируса АЧС по наличию данных встроек.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены полные геномные последовательности российских изолятов вируса АЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, которые могут быть использованы для изучения молекулярно-биологических свойств вируса АЧС.
В международную базу данных GenBank внесены первые полные геномные последовательности российских изолятов вируса АЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14.
Вирус АЧС изолята Odintsovo 02/14 депонирован в ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Разработана схема предварительной систематизации вновь выделяемых изолятов вируса АЧС. Разработаны «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней»; «Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ)»; «Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней»; «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней»; «Методические рекомендации по получению типоспецифической сыворотки крови свиней для постановки реакции задержки гемадсорбции»; «Методические рекомендации по оценке клинических признаков и патологоанатомических изменений при экспериментальном заражении вирусом африканской чумы свиней»; «Методические рекомендации по выявлению генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»; «Методические рекомендации по наработке ДНК вируса африканской чумы свиней в первичной культуре клеток макрофагов свиньи для последующего пиросеквенирования»; «Методические рекомендации по получению препаратов ДНК вируса африканской чумы свиней из цельной крови свиней для высокопроизводительного полногеномного секвенирования», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 24 июня 2014 г.; 18 ноября 2013 г.; 20 декабря 2013 г.; 24 июня 2014 г.; 6 февраля 2015 г.; 9 октября 2015 г.; 25 декабря 2015г.; 9 октября 2015 г.; 9 октября 2015 г. соответственно.
Методология и методы исследования. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, пиросеквенирование, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей), вирусологические (вирусовыделение, культивирование вируса, титрование вируса, постановка биопроб) методы, а также традиционные исследований - очистка вируса и выделение недеградированной вирусной ДНК. Положения, выносимые на защиту: а) биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 отличаются от таковых референс-штамма Ставрополь 01/08; б) сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 позволил выявить изменения нуклеотидов в полноразмерных последовательностях генов и мультигенных семейств в геномах вируса АЧС российских изолятов, составившие 0,033% и 0,051% от размера генома, соответственно; в) в геноме изолята Odintsovo 02/14 присутствует прямой тандемный повтор GGAATATATA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Kashino 04/13 и Georgia 2007/1; г) в геноме изолята Kashino 04/13 присутствует прямой тандемный повтор GATAGTAGTTTAGTTAA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Odintsovo 02/14 и Georgia 2007/1; д) Данные тандемные повторы могут быть использованы для дифференциации современных российских и европейских изолятов вируса АЧС. Исследования по диссертационной работе выполнены в 2013-2015 гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ за консультативную помощь, поддержку и содействие в выполнении работы.
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-2015 гг.), на заседаниях НТС (Научно-технического совета) Россельхознадзора (2014-2015 гг.), 4 и 5 международном ветеринарном конгрессе (Казань, 2014 г и Москва, 2015 г.) на VII-VIII ежегодной встрече Европейской исследовательской группы Epizone (2013-2014 гг.), на 18-й Международной научно-методической конференции по патологической анатомии животных (г. Москва, 2014 г.), на 17-й Международной конференции по вирусологии и инфекционным болезням (г. Лондон, 2015 г.).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях по перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения; иллюстрирована 22 таблицами и 20 рисунками. Список использованной литературы включает 184 источника, из них 145 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.
Структура генома вируса АЧС
Значимость для экономики. АЧС наносит существенный социально-экономический ущерб свиноводству вновь поражаемых и эндемичных по АЧС стран и регионов. Причем, урон наносится как интенсивному, так и экстенсивному производствам свинины. Поскольку в рамках реализации политики стемпинг-аута поголовье уничтожается, вспышки АЧС приводят к значительному экономическому ущербу для поражённых свинокомплексов, а также для частного сектора, который не способен поддерживать на высоком уровне биобезопасность; применять эффективные и, как правило, высокозатратные меры борьбы без государственной поддержки. Например, на Мадагаскаре и в Кот-д Ивуаре эпидемия АЧС привела к потере до 50% свинопоголовья стран.
Усреднённый общий ущерб на один очаг в 2010 году в РФ по данным Гулёнкина с соавт. составил более 37 млн. руб, а общий экономический ущерб, причинённый стране по состоянию на начало 2013 г. по данным Макарова с соавт превысил 1 миллиард долларов США [10, 19].
В свою очередь, урон для свиноводства ведёт к снижению продовольственной безопасности страны, особенно тех стран, где свинина – основной источник животного белка, а выращивание КРС затруднено.
Наконец, важную составляющую в причиняемом АЧС ущербе играет потеря страной возможностей международной торговли мясом и продуктами свиноводства. Для ликвидации развившейся эпизоотии АЧС приходится реализовывать дорогостоящие многолетние госпрограммы по искоренению болезни [24, 119, 139].
Историческая справка. Первый случай АЧС был описан в Кении в 1920 г., как острая геморрагическая лихорадка, приводящая к гибели до 100% поражённых свиней. В 1921 г. Ю. Монтгомери был установлен возбудитель болезни – вирус, обнаруженный у диких бородавочников. Дальнейшие исследования показали, что вирус длительно присутствует у диких животных на территории южной и восточной Африки [58, 139].
Естественными носителями вируса АЧС являются кустарниковые свиньи и дикие африканские бородавочники Phacochoerus africanus, в организме которых вирус способен бессимптомно персистировать неограниченное время. Однако, вирус присутствует в организме этих животных в малых титрах. Большинство авторов соглашается, что контактная передача вируса от бородавочника к свинье в полевых условиях невозможна, в то время, как возможность заражения домашних свиней при поедании трупов бородавочников и скрещивании, представляется вероятной [120, 121].
В роли вектора распространения и резервуара возбудителя выступают питающиеся кровью (103-104 ГАдЕ50/см3) молодых бородавочников аргасовые клещи рода Ornithodoros. Клещи Ornithodoros moubata способны передавать вирус свиньям при укусе, а внутри их популяции – трансовариально, трансстадиально и при половом контакте. Вместе клещи и бородавочники образуют устойчивый сильватический цикл в большинстве регионов Африки.
Так, в восточной и южной Африке заражение домашних свиней от бородавочников происходит преимущественно при укусах клещей или поедании их трупов. Для западной части Африканского континента, где численность клещей рода Ornithodoros низка, наиболее характерен алиментарный путь заражения домашних свиней, а также передача вируса при непосредственном контакте между свиньями [24, 94, 162, 173].
За последние 20 лет болезнь распространилась в пределах африканского континента, поразив центральную и западную его части, откуда продвинулась на острова Индийского океана, охватив в 1998 году Мадагаскар, а в 2007 – Маврикий [47, 162].
Распространение АЧС в мире. Первый случай выноса АЧС за пределы Африки произошёл в 1957 г. в Португалии, когда необеззараженные пищевые отходы с самолёта были скормлены свиньям в близлежащем городе Лиссабон. Несмотря на принятые меры к быстрой ликвидации вспышки, в 1960 г. в Лиссабоне вновь зарегистрировали АЧС, и Пиренейский полуостров оставался неблагополучным по АЧС вплоть до середины 90-ых годов. Из Португалии АЧС распространилась в Испанию, где в 1963 г. была установлена роль аргасовых клещей вида Ornithodoros как переносчиков и природного резервуара заболевания в Европе и Африке. АЧС поразила Францию (1964), Италию (1967), Мальту (1978), Бельгию (1985) и Голландию (1986). Впоследствии заболевание было искоренено во всех странах, кроме итальянского острова Сардиния, остающегося стационарно неблагополучным по АЧС и по сей день.
АЧС регистрировали также в странах Карибского бассейна – Кубе (1971), Доминиканской республике (1978), Гаити (1979) и Южной Америке (Бразилия, 1978), куда она была, предположительно, занесена из Испании с пищевыми отходами пассажирских авиалиний или ввозимыми туристами продуктами из свинины [58, 139, 145, 162].
АЧС в России. В апреле 2007 г. АЧС появилась в Грузии и быстро распространилось по её территории. По данным ФАО, возбудитель АЧС был занесён в страну на грузовом корабле через черноморский порт Поти с инфицированными мясопродуктами, часть которых была скормлена свиньям. Неэффективность принятых мер борьбы и особенности свиноводства в Грузии, заключающиеся в традиционном свободном выпасе свиней и кормлении их отходами, привели к нарастанию эпизоотии и распространению АЧС в близлежащие страны: Армению и Азербайджан [1, 26, 91, 105].
В ноябре 2007 г. первый случай АЧС был зарегистрирован в России, когда в Шатойском ущелье Республики Чечня был обнаружен павший кабан [116]. При проведении отстрелов в Республике Чечня весной 2008 г. обследование трупов кабанов выявило наличие у них вируса АЧС. По результатам секвенирования генома было установлено, что вспышка вызвана изолятом вируса II генотипа, схожим с изолятами, ранее циркулировавшими на Мадагаскаре, в Мозамбике и Замбии [11].
Биопробы на естественно восприимчивых животных
Влияние способа заражения. Во всех случаях животные, которым вводили вирус внутримышечно в равных дозах погибали раньше животных, заражённых интраназально. При этом длительность инкубационного периода и время жизни после введения вируса у животных, заражённых внутримышечно, практически совпадали (до 1 суток). Поросята, зараженные интраназально в равных дозах, демонстрировали значительную разницу в длительности инкубационного периода и времени жизни после введения вируса (до 9 суток).
При заражении животных в естественных условиях попадание вируса в организм через дыхательные пути более вероятно, в то время, как внутримышечное его введение представляется практически невозможным. Однако, при интраназальном введении вируссодержащей суспензии в экспериментальных условиях сложно гарантировать доставку полного объёма вводимой жидкости в лёгкие животного, поскольку ее введение в дыхательные пути может вызвать у животного кашлевой рефлекс, в результате чего вируссодержащая жидкость может быть потеряна или проглочена животным. Алиментарный путь заражения наименее эффективен, поскольку вирус разрушается, попадая в агрессивную среду пищеварительной системы [120].
В то же время внутримышечное введение позволяет гарантировать отсутствие потерь вирусного материала при его введении, а процесс заражения проходит значительно быстрее. Также, естественная воспалительная реакция организма на введение чужеродного агента, возникающая после инъекции, ускоряет генерализацию инфекции за счёт привлечения макрофагов к месту введения вируса. Этим, по-видимому, объясняется значительная разница в скорости наступления клинической картины заболевания у поросят при интраназальном и внутримышечном введении равных доз. Следовательно, внутримышечный способ введения вируса является предпочтительным для заражения экспериментальных животных с целью воспроизведения болезни.
Влияние заражающей дозы. Все исследованные в наших экспериментах варианты ВАЧС обладали 100% летальностью для свиней. При заражении одним и тем же способом и изолятом разница в продолжительности жизни животных, заражённых в дозе 5000 ГАдЕ50 и 50 ГАдЕ50, составляла до 12 суток. Практически во всех случаях заражение в большей дозе ускоряло развитие лихорадки и гибель животных. Однако, по результатам вскрытий павших поросят было установлено, что выраженность патоморфологических изменений у животных находится в обратной зависимости от заражающей дозы. Кроме того, ранняя гибель (1-3 дня после заражения) заражённых в высокой дозе поросят не оставляет времени для развития антительного ответа. Таким образом, заражение животных в дозе 50 ГАдЕ50 не только приводит к развитию заболевания и гибели животных, но и оставляет время для проявления специфических для АЧС клинических признаков и патологоанатомических изменений.
Различия биологических свойств изученных изолятов. Из данных, представленных на рисунке 14 видно, что быстрее всего при экспериментальном заражении гибель опытных животных вызвал ВАЧС штамма Ставрополь 01/08. Срок жизни заражённых животных составлял 6-9 суток с момента заражения. При этом разница в длительности инкубационного периода и сроках жизни животных, заражённых в разных дозах и различными способами, составила в среднем не более суток. Так, заражённые интраназально в дозах 50 и 5000 ГАдЕ50 поросята погибли одновременно, что свидетельствует о высокой вирулентности данного изолята и гомогенности состава популяции.
При для поросят, заражённых вирусом АЧС изолята Kashino 04/13 продолжительность жизни составляла 8-21 суток после заражения; в то время, как для ВАЧС изолята Odintsovo 02/14 продолжительность жизни поросят после заражения варьировала в пределах 12-32 суток.
Следовательно, поросята, зараженные вирусом изолятов ВАЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 проявили тенденцию к увеличению сроков течения болезни, что выражается в увеличении продолжительности инкубационного периода в 1,5-6 раз (в зависимости от заражающей дозы) и продолжительности жизни животных в 3-4 раза.
Поскольку для исследуемых изолятов вируса АЧС были обнаружены различия в проявлении как культуральных (уменьшение количества прикрепленных эритроцитов), так и биологических свойств, было принято решение о необходимости проведения полногеномного секвенирования для установления полных нуклеотидных последовательностей геномов выбранных изолятов с целью сопоставления изменений их культурально-биологических свойств и структуры генома.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей
Анализ на наличие второго тандемного повтора, наряду с присутствием встройки в интергенном регионе I73R-I329L также может применяться для внутригенотиповой дифференциации современных изолятов ВАЧС, циркулирующего на территории России и отслеживать динамику их распространения.
Результаты, полученные в ходе наших исследований, обнаруживают генетическую вариабельность у современных изолятов ВАЧС, циркулирующего на территориях России и Восточной Европы. Описанный метод обнаружения тандемных повторов в интергенных регионах при помощи ПЦР может быть полезен для установления различий между близкородственными изолятами вируса АЧС, установления источников заноса и путей распространения болезни.
Таким образом, применение метода полногеномного секвенирования для определения полных нуклеотидных последовательностей изолятов вируса АЧС позволило выявить различия в нуклеотидных последовательностях геномов, затрагивающие области генов и мультигенных семейств, ответственных за вирулентность вируса и его репликацию в организме клещей; в том числе структурные белки, гомологи клеточных белков, ферменты обмена нуклеиновых кислот и вспомогательные протеины, участвующие в сборке вириона, а также определить в геноме вируса маркерные области, по которым возможно установить родство изолятов вируса АЧС, циркулирующего на территории РФ.
Значительное генетическое разнообразие вируса АЧС и существование неоднородных популяций вируса усложняют задачу классификации и группирования его изолятов, что находит подтверждение в многочисленных работах российских и зарубежных исследователей [135, 22, 53, 88, 40].
В результате изучения литературных данных были выявлены основные гены вируса АЧС, анализ которых позволяет проводить предварительную оценку биологических свойств и генетических характеристик вновь выделенных вирусных изолятов. Так, для определения генотипа вируса A. Bastos et al. (2003) было предложено проводить филогенетический анализ последовательности гена B646L, кодирующего основной консервативный капсидный протеин вируса АЧС vp72 [107].
Для определения сероиммунотиповой принадлежности изолята ВАЧС В. Балышевым с соавт. (1995) была предложена методика на основе реакции задержки гемадсорбции [30], что позволило распределить имеющиеся изоляты на 10 групп: 9 сероиммунотипов и 1 группа гетерогенных по составу изолятов. Данные, опубликованные в работах С. Gallardo et al., А. Казаковой и др. [103, 81, 93, 12, 13] позволили установить связь между сероиммунотиповой принадлежностью изолятов и структурой гена E183L, кодирующего структурный протеин vp54.
В работах L. Dixon, L. Zsak, T. Burrage и С. Afonso показано, что в состав мультигенных семейств MGF 360 и 505 вируса АЧС входят гены, отвечающие за вирулентность вируса и необходимые для его репликации и генерализации инфекции как в организме свиней, так и клещей рода Ornithodoros, а также гены, модулирующие продукцию интерферонов в организме хозяина [54, 48, 50, 49]. В исследовании V. O Donnell et al (2015) продемонстрировано, что делеция 6 генов в составе MGF 360 и 505 приводит к утрате вирусом АЧС вирулентности для свиней.
По данным A. Angulo (1992), наиболее вариабельным участком генома при пассировании вируса являются ген O61R и его интергенный регион [62].
Связь между гемадсорбирующей активностью вируса АЧС, обусловленной функциональностью гена EP402R, кодирующего вирусный гомолог макрофагального белка CD2, и его вирулентностью была показана в работах M. Borca, A. Leitao [41, 175].
А. Варенцовой в 2014 г. была разработана схема первичной оценки изолятов на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов B646L, E183L, MGF 360, EP402R, O61R и его интергенного региона, применяющаяся в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в настоящее время [6].
Вновь полученные в ходе нашей работы данные о наличии встроек в интергенных регионах I73R-I329L и 9R/10R геномов современных российских и европейских изолятов ВАЧС и полученные результаты территориально-временного распределения изолятов явились основой для усовершенствования схемы первичной группирования вновь выделяемых изолятов [80, 79, 166, 141]. На настоящий момент предлагаются следующие основные этапы систематизации вновь выделенных изолятов (рисунок 20):
Определение генотипа и предварительное выявление возможной серотиповой принадлежности изолята проводится на основе филогенетического анализа последовательности генов B646L и E183L. Изменения гемадсорбирующей способности определяются в ходе анализа структуры гена EP402R, а изменения вирулентности в результате наличия и функциональной активности генов в составе мультигенных семейств MGF 360 и 505. Определение степени родства изолятов ВАЧС проводится по анализу трех интергенных регионов: O61R, I73R/I329L и 9R/10R.