Аноктамины вкусовых клеток мыши: клонирование, экспрессия и локализация Колесникова Алиса Станиславовна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Колесникова Алиса Станиславовна. Аноктамины вкусовых клеток мыши: клонирование, экспрессия и локализация: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.01.03 / Колесникова Алиса Станиславовна;[Место защиты: Институт биофизики клетки РАН].- Пущино, 2016.- 100 с.

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 8

2.1. Семейство аноктаминов 8

2.1.1. Хлорные каналы, активируемые катионами кальция 8

2.1.2. Общая характеристика семейства аноктаминов 9

2.1.3. Топология и канальные свойства аноктаминов 12

2.1.4. Свойства и локализация Ано1 14

2.1.5. Свойства и локализация Ано

2 2.2. Строение периферического вкусового анализатора млекопитающих .21

2.3. Экспрессионный анализ одиночных хемосенсорных клеток

2.3.1. Методологические подходы для экспрессионного анализа одиночных клеток .26

2.3.2. Экспрессионный анализ одиночных хемосенсорных нейронов .30

2.3.3. Экспрессионный анализ одиночных вкусовых клеток 33

3. Материалы и методы 38

3.1. Животные, используемые в работе 38

3.2. Препараты вкусовой ткани .38

3.3. Препараты обонятельного эпителия 38

3.4. Имуногистохимия на срезах языка .39

3.5. Экспрессионный анализ генов аноктаминов во вкусовых почках 40

3.6. Клонирование полноразмерной кДНК Ано1 41

3.7. Клонирование полноразмерной кДНК Ано2 .43

3.8. Химическая трансформация клеток Е.coli 44

3.9. Трансфекция клеток линии CHO

3.10. Электрофизиология .45

3.11. Выявление сплайс-вариантов Ано1 45

3.12. Выявление сплайс-вариантов Ано2 45

3.13. Экспрессионный анализ одиночных вкусовых клеток 47

3.14. Электрофорез в агарозном геле .49

3.15. Синтез рибопробы для детекции мРНК Ано1 49

3.16. Синтез рибопробы для детекции мРНК Ано2 .51

3.17. Гибридизация in situ рибопроб на срезах вкусовой ткани мыши 53

4. Результаты и обсуждение .55

4.1. Экспрессия генов анактоминов во вкусовых почках 55

4.2. Клонирование полноразмерной кДНК Ано1 56

4.3. Клонирование полноразмерной кДНК Ано2 .58

4.4. Подтверждение функциональности рекомбинантных аналогов Ано1 и Ано2 63

4.5. Локализация мРНК Ано1 и Ано2 на срезах вкусовой ткани

4.6. Локализации Ано1 и Ано2 на срезах вкусовой ткани 69

4.7. Экспрессионный анализ одиночных клеток

5. Заключение .85

6. Выводы 88

7. Список литературы

Топология и канальные свойства аноктаминов
Строение периферического вкусового анализатора млекопитающих
Трансфекция клеток линии CHO
Клонирование полноразмерной кДНК Ано2

Введение к работе

Актуальность проблемы. Идентификация ионных каналов, вовлеченных в сигнальные процессы во вкусовых клетках млекопитающих, является актуальной проблемой, поскольку молекулярные механизмы детекции вкусовых стимулов и принципы кодирования вкусовой информации во многом остаются неизученными. В настоящий момент не вызывает сомнения то обстоятельство, что вкусовая трансдукция протекает при участии фосфоинозитидного каскада, который обеспечивает сопряжение молекулярных рецепторов вкусовых веществ с мобилизацией внутриклеточного кальция. Стимул-зависимые Са²⁺-сигналы затем конвертируются Са²⁺-активируемым катионным каналом TRPM5 в деполяризацию вкусовых клеток с последующим выбросом афферентного нейромедиатора АТР. По имеющимся данным межклеточные коммуникации во вкусовой почке протекают при участии ряда первичных медиаторов, которые также стимулируют кальциевую сигнализацию во вкусовых клетках (Chaudhari, 2014). Следует отметить, что Са²⁺-зависимые ионные каналы обеспечивают сопряжение внутриклеточных Са²⁺-сигналов с поляризацией плазматической мембраны в самых разнообразных клетках. В этом отношении вкусовые клетки не являются исключением. Так, в лаборатории молекулярной физиологии клетки ИБК РАН ранее было показано, что в субпопуляции вкусовых клеток пуринергические агонисты стимулируют метаботропные рецепторы P2Y типа с последующей мобилизацией внутриклеточного кальция и активацией анионных каналов, управляемых Са²⁺ (Kim et al., 2000; Baryshnikov et al., 2003; Bystrova et al., 2007). Молекулярная природа последних до сих пор не установлена. Белки из семейства аноктаминов (Ано) выполняют самые разнообразные функции и найдены в различных клеточных типах. Первые два представителя этого семейства Ано1 и Ано2 способны формировать хлорные каналы, активируемые кальцием (СаСС-каналы). Известно, что в хемосенсорных системах СаСС-каналы играют особую роль, они вовлечены в обонятельную рецепцию и детекцию феромонов. В обонятельных и вомеронасальных нейронах активация CaCC служит дополнительным механизмом усиления рецепторного потенциала, повышающим чувствительность систем детекции запахов и феромонов на клеточном уровне. К настоящему времени установлено, что Ано1 и Ано2 отвечают за кальций-зависимый хлорный ток в двух видах хемосенсорных клеток - в обонятельных и вомеронасальных нейронах (Sagheddu et al, 2010; Dibattista et al, 2012; Saidu et al, 2013). Аноктамины вкусовых клеток не были исследованы. В свете вышеизложенного актуальной задачей является исследование аноктаминов вкусовых клеток, поскольку это будет способствовать выявлению молекулярной природы функционирующих в них СаСС-каналов.

Цели и задачи работы. Целью данной работы было исследовать аноктамины вкусовых клеток мыши в качестве возможных кандидатов на роль функционирующих в них СаСС-каналов. Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:

Провести экспрессионный анализ генов семейства аноктаминов во вкусовой почке мыши.
Клонировать полноразмерные комплементарные ДНК Aнo1 и Aнo2 из вкусовых почек мыши и сконструировать рекомбинантные плазмиды для гетерологической

экспрессии кДНК этих белков с целью последующего исследования их

фармакологического профиля и биофизических характеристик.

Изучить локализацию мРНК генов Aнo1 и Aнo2 во вкусовых почках с использованием гибридизации in situ смысловых и антисмысловых рибопроб на криосрезах желобоватого вкусового сосочка языка.
Исследовать локализацию Ано1 и Ано2 в желобоватом вкусовом сосочке с помощью методов иммуногистохимии и иммунофлуоресцентного анализа.
С использованием метода глобальной амплификации мРНК и последующего экспрессионного анализа одиночных клеток выявить, в клетках какого типа во вкусовой почке локализованы транскрипты Ано1 и Ано2.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данная работа является пионерским исследованием семейства аноктоминов в периферической вкусовой системе млекопитающих и представляет собой первый шаг в направлении молекулярной идентификации СаСС-каналов, функционирующих во вкусовых клетках мыши. Основные результаты получены впервые. Впервые проведен экспрессионный анализ генов семейства аноктаминов в препарате РНК, выделенной из вкусовых почек желобоватого вкусового сосочка языка мыши, и выявлены сплайс-варианты Ано1 и Ано2. Впервые клонированы полноразмерные кДНК генов Ано1 и Ано2 из вкусовой ткани мыши. Сконструированы плазмиды для экспрессии клонированных кДНК, слитых с геном зеленого флуоресцентного белка, и впервые показано, что рекомбинантные аноктамины, клонированные из вкусовой ткани мыши, в гетерологической системе экспрессии индуцируют появление Са²⁺-активируемой анионной проводимости плазматической мембраны, во многом сходной по биофизическим характеристикам с проводимостью мембран вкусовых клеток. С помощью гибридизации in situ смысловых и антисмысловых рибопроб впервые выявлена специфическая локализация транскриптов мРНК аноктаминов 1 и 2 во вкусовых почках желобоватого сосочка языка мыши. Впервые изучена локализация Ано1 и Ано2 во вкусовой ткани с помощью иммуногистохимии и иммунофлуоресцентного анализа. Впервые исследовано распределение транскриптов Ано1 и Ано2 среди одиночных вкусовых клеток типов I, II и III, изолированных из вкусовой почки мыши. При исследовании одиночных клеток выявлены межклеточные вариации в уровне экспрессии бета-актина, и высказано предположение, что бета-актин не может служить надежным контролем при экспрессионном анализе одиночных клеток. Полученные в работе данные расширяют существующие представления о молекулярной природе Са²⁺-активируемых анионных каналов, функционирующих во вкусовых клетках млекопитающих. Сконструированные плазмиды могут быть использованы для исследования фармакологического профиля и биофизических свойств ионных каналов, сформированных при участии аноктаминов.

Конкретное личное участие автора в получении результатов. Все результаты,
представленные в диссертации, получены при личном участии автора. Все работы,
касающиеся экспрессии аноктаминов во вкусовых клетках, клонирования

полноразмерных кДНК аноктаминов, конструирования рекомбинантных плазмид, синтеза рибопроб, приготовления криосрезов, гибридизации in situ и иммуногистохимического анализа, проводились лично автором. Данные о локализации рекомбинантных аналогов

аноктаминов в трансфецированных культуральных клетках были получены совместно с
сотрудником лаборатории молекулярной физиологии клетки ИБК РАН к.б.н. Рогачевской
О.А. Данные о биофизических свойствах рекомбинантных аноктаминов в

гетерологической системе экспрессии были получены совместно с аспирантом ИБК РАН Черкашиным А.П. Автор выражает особую благодарность инженеру центра коллективного пользования ИБК РАН Кучину А.В. за неоценимую помощь в получении конфокальных изображений.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 167 ссылок. Диссертация содержит 40 рисунков.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на XXVI Зимней молоджной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии "(Москва, 2014); Международной конференции молодых ученых "Экспериментальная и теоретическая биофизика '14" и "Экспериментальная и теоретическая биофизика '15" (Пущино, 2014, 2015); 18-й и 19-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология-наука ХХI века" (Пущино, 2014, 2015); Международном симпозиуме "Biological motility. New facts and hypothesis" (Пущино, 2014); конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2015); международной конференции Advanced Microscopy Meeting “Super-resolution in different dimensions” (Москва, 2015); конференции “Внутриклеточная сигнализация, транспорт и цитоскелет” Санкт-Петербург, 2015; международной конференции the 6^th EMBO Meeting “Advancing the life sciences” (Birmingham, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах и две статьи в сборниках научных статей.

Топология и канальные свойства аноктаминов

В настоящее время установлено, что анионы хлора активно транспортируются и участвуют во внутриклеточной сигнализации во многих типах клеток, и нарушения в хлорном транспорте могут быть причиной серьезных патологий. Ионы Cl- – самые распространенные анионы в большинстве живых организмов. У взрослых млекопитающих концентрация внеклеточного Cl- значительно выше концентрации внутриклеточного. Движение ионов хлора через цитоплазматическую мембрану происходит за счет хлорных каналов и транспортеров. Ионы хлора играют роль вторичного посредника в клетках, их концентрация постоянно меняется, они транспортируются во внутрь и из клеточных органелл и регулируют функции ряда белков (Duran et al., 2010). Хлорные каналы – это трансмембранные белки, образующие поры, проницаемые для анионов хлора (Chih-Yung Tang et al, 2011). Хлорные каналы были обнаружены в цитоплазматической мембране большинства клеток, а также во внутриклеточных органеллах; они участвуют во многих важных регуляторных процессах – от ионного гомеостаза до транс-эпителиального транспорта, в регуляции клеточного объема и стабилизации мембранного потенциала. Хлорные каналы вовлечены в трансдукцию вкусовых стимулов, в фототрансдукцию, в сокращение гладкой мускулатуры.

Хлорные каналы, в основном, обладают неспецифической ионной селективностью и проницаемы и для других анионов. Активация хлорных каналов может зависеть от трансмембранного потенциала, изменения объема клетки, от концентрации других ионов и АТФ. Физиологические исследования показали огромное разнообразие хлорных каналов, c различными канальной проводимостью, ионной селективностью и механизмами регуляции. Хлорные каналы делятся на четыре категории: хлорные каналы, управляемые лигандами; потенциал-управляемые хлорные каналы; цАМФ-управляемые хлорные каналы; хлорные каналы, активируемые катионами кальция (СаСС). Белки, участвующие в формировании первых трех групп каналов, давно установлены, их структура и функции изучены. Для молекулярной идентификации СаСС-каналов потребовалось более 30 лет, и даже сейчас есть много невыясненных вопросов по поводу молекул, отвечающих за СаСС-ток в нативных клетках.

Хлорные каналы, активируемые ионами кальция (САСС-каналы) впервые были описаны в 1881 у лягушки (Cross et al, 1981). Было показано, что в ооцитах лягушки эти каналы активируются после оплодотворения в ответ на повышение концентрации ионов кальция. Затем на функциональном уровне САСС-каналы были обнаружены во внутренних сегментах палочек сетчатки у саламандры Ambystoma tigrinum (Bader et al., 1982) и в ооцитах Xenopus (Barish, 1983; Miledi, 1982). В последующие годы САСС-каналы были выявлены в разнообразных клеточных типах у многих организмов. Хотя кальций-активируемые хлорные каналы были описаны на функциональном уровне более 30 лет назад, их молекулярная природа долгое время оставалась неизвестной. Среди кандидатов на роль САСС-каналов были предложены белки семейства CLCАs (Parassotiriou, 2001), два белка, кодируемые генами человека hTTHY2 и hTTHY3 (Hartzell, 2009), а также белки семейства Bestrophin (Barro-Sorria, 2010). Однако по биофизическим и фармакологическим свойствам все эти кандидаты отличались от нативных каналов, к тому же они присутствовали не во всех клетках, в которых были выявлены кальций-управляемые хлорные токи. В настоящее время наиболее вероятными кандидатами на роль САСС-каналов считаются белки из семейства аноктаминов. Очень важно подчеркнуть, что СаСС-токи в различных типах клеток могут генерироваться не одним типом канальных белков, а несколькими. Это следует из следующих фактов. Экспериментально были выявлены различия в канальной активности СаСС в различных типах клеток с точки зрения проводимости одиночных каналов, кинетики активации и инактивации, зависимости канальной активности от киназ, фармокологической чувствительности к традиционным блокаторам хлорных каналов (Eggermont, 2004; Planells-Cases and Jentsch, 2009).

В основу названия семейства аноктаминов (anoctamin) положена игра слов. AN- от сокращенного аnion - анион-селективные каналы с восемью (ОСТ) трансмембранными областями. До того, как появились первые экспериментальные факты в 2008 году об участии Ано1 (TMEM16a) в формировании СаСС, семейство TMEM16 относилось к суперсемейству эукариот известному как DUF590 (domain of unknown function), о котором мало что известно. Консервативный домен DUF590 соответствует серии восьми предсказанных трансмембранных доменов в структуре белков TMEM16 и коротким промежуточным петлям между ними. Кальций-активируемые хлорные каналы были описаны на функциональном уровне более 34 года назад, но их молекулярная природа долгое время оставалась неизвестной. И только в 2008 сразу три группы независимо друг от друга опубликовали результаты, указывающие на то, что аноктамин 1 (альтернативное название TMEM16A) отвечает требованиям, позволяющим рассматривать его как кандидата на роль САСС-канала (Caputo et al., 2008, Yang et al., 2008; Schroeder et al., 2008). Биофизические и фармакологические свойства канала, формируемого рекомбинантным Ано1 наиболее близко соответствовали нативному CaCC-каналу, первоначально обнаруженному в ооцитах Xenopsis (Сross et al., 1981).

Строение периферического вкусового анализатора млекопитающих

Трансфекция клеток линии CHO

Компетентные клетки Е.coli штамм XL1-Blue фирмы Евроген (100 мкл), хранившиеся при температуре -70С, размораживали на льду в течение 10-15 минут. В пробирку добавляли 10 мкл реакции лигирования (или 10 мкл смеси ПЦР фрагментов в случае Ано2) и инкубировали еще 20 минут на льду. Далее помещали пробирку в водяную баню и инкубировали 90 секунд при температуре 42С (тепловой шок). Сразу после этого пробирку охлаждали на льду 2 минуты, после чего добавляли 500 мкл среды SOС и инкубировали еще 60 мин при 37С на качалке. Полученную бактериальную суспензию высевали на чашки Петри со средой LB-агар-ампициллин.

Клетки СНО трансфецировали рекомбинантной плазмидой при помощи реагента Lipofectamin (Invitrogen) по следующему протоколу. Поддержание клеток и их модификация проводилась на 12-луночном планшете, объем ростовой среды - 1мл). Накануне трансфекции клетки рассеваются в количестве, необходимом для достижения 60-70% монослоя на следующий день. Готовится комплекс-смесь для трансфекции следующим образом:

Добавить 200 мкл комплекса в лунку к клеткам со средой. Если необходимо, сменить среду через 4-6 часов. Поскольку липофектамин обладает низкой токсичностью, смена среды не делалась, и это повышало время взаимодействия клеток с трансфекционным комплексом и, следовательно, эффективность трансфекции. Через 24 часа тестировалась продукция GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Максимальный уровень продукции целевых белков с плазмиды достигается на 2-3 сутки после трансфекции. Наличие в клетках химерного целевого белка проверяется по свечению GFP. В результате трансфекции клеток СНО плазмидой, несущей целевой ген, через 24 часа в культуре присутствовали клетки, от которых при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 480 нм регистрировалось излучение в виде зеленого свечения (флуоресценция GFP). Количество подобных клеток составило порядка 20%.

Электрофизиология. Ионные токи регистрировали и анализировали с использованием усилителя Axopatch 200 B, ЦАП-АЦП конвертеров Digidata 1440 и MiniDigi 1B и пакета лицензионных программ pClamp10.0 (все Molecular Devices, США). Клетки в электрофизиологической камере анализировали с использованием микроскопа Axioscop-2 (Zeiss, Германия) и объектива LD A-Plan 32x. Обычно использовался метод перворированного пэтча (perforated patch clamp approach). Базовый внутриклеточный раствор содержал (мМ): 140 CsCl, 1 MgSO4, 0.5 EGTA, 10 HEPES-CsOH (pH 7.2), аmphotericin B (400 мкг/мл). Базовый внеклеточный раствор содержал (мМ): 140 NaCl, 5 KCl,1 MgSO4, 1 CaCl2, 10 HEPES-NaOH (pH 7.4). В случае необходимости этот раствор модифицировался в том отношении, что 140 мМ NaCl заменялись на 140 мМ Na-HEPES или концентрация CaCl2, устанавливалась 0.5 или 5 мМ. Опыты проводились при комнатной температуре 22-24C.

В настоящее время в базе данных NCBI есть две последовательности, которые соответствуют двум транскрипт-вариантам Ano1 мыши: GenBank NM_178642.5 и NM_001242349.1. Транскрипт-вариант 1 отличается от 2 наличием добавочных 12-ти нуклеотидов в позициях 1608-1619 и отсутствием трех нуклеотидов, которые расположены в позициях 230-232 в последовательности транскрипт-варианта 2. Транскрипт-варианты Ано1 анализировались с помощью реакции ПЦР и транскрипт-специфических праймеров.

Экспрессионный анализ одиночных клеток. Клетка засасывалась в микроэлектрод, помещались в ПЦР-пробирку содержащую 3.3 pmol T7- oligo(dT)15 праймера Эмбервайна. (5 -AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTT-47 ), и немедленно замораживалась при -80. Первая цепь кДНК была синтезирована с использованием клеточного лизата, полученного замораживанием-размораживанием одиночной клетки. Образец нагревался до 70C 5 минут, затем охлаждался на льду. Реакция обратной транскриции проводилась в 10 l раствора, содержащего 2 l ОТ буфера, 0.5 l 0.1 M DTT, 0.5 l 10 mM dNTP, 20 U RNaseOUT (Invitrogen), 100 U SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) при 50C 30 минут. Затем к реакционной смеси добавляли 0.3 l RNase H (Invitrogen) и 10 U DNA polymerase I (Promega). Синтез второй цепи ДНК проводили при 12C 30 минут, затем при 22C 1 час. Затем добавляли 20 U T4 DNA polymerase (Promega), инкубировали 10 минут при 37C и 3 минуты при 80C. Реакция транскрипции in vitro в объеме 100 l 3 часа с использованием T7 RNA полимеразы (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем ДНК матрица разрушалась при добавлении 2 U DNaseI (Sigma) и инкубации 15 минут. Амплифицированная аРНК очищалась на колонке RNeasy MinElute Kit (Qiagen), концентрировалась на вакуумной центрифуге-испарителе (Еппендорф) и использовалась в качестве матрицы в последующей реакции обратной транскрипции с 200 U SuperScript III (Invitrogen) и 200 ng праймеров-гексамеров в 20 l при 50C 1 час. Реакция ПЦР с ген-специфическими праймерами проводилась с готовой смесью для ПЦР с горячим стартом (Евроген) при следующих условиях 95C for 2 мин, затем 40 циклов at 95C -20 сек, 55C – 30 сек, 72C -55 сек. Последовательности ген-специфических праймеров, использованных для экспрессионного анализа одиночных вкусовых клеток приведена в таблице.

Клонирование полноразмерной кДНК Ано2

Мы использовали методы иммуногистохимии, иммунофлуоресцентного анализа и гибридизации in situ для исследования локализации аноктаминов на уровне мРНК и белка во вкусовой ткани, а именно, на срезах желобоватых вкусовых сосочков языка мыши. Для проведения гибридизации in situ мы синтезировали смысловые и антисмысловые рибопробы, меченные дигоксигенином, к исследуемым аноктаминам с использованием Sp6 и T7 РНК полимераз и метода in vitro транскрипции. Для этого негомологичные участки кДНК аноктаминов были клонированы в векторы pALA (Ано1) и pSPT19 (Ано2), содержащие последовательности промоторов Sp6 и T7 РНК полимераз. Для синтеза смысловых и антисмысловых РНК-проб in vitro использовались Т7 и SP6 РНК полимеразы и смесь рибонуклеотидов, в состав которой входит меченный дигоксигенином UTP. Размер DIG-рибопроб составлял 336 и 1135 п.н. для Ано1 и Ано2, соответственно. В беседах с несколькими коллегами, имеющими опыт в проведении гибридизации in situ, нам был дан один и тот же совет: использовать длиную рибопробу в районе 1000 п.н., поскольку от размера пробы существенно зависит успех гибридизации. Однако теоретически короткие пробы легче проникают к целевой мРНК на срезах ткани. Поэтому мы синтезировали рибопробы различной длины. Мы использовали иммунологическую детекцию рибопроб, связавшихся с молекулами мРНК на срезах, с помощью антител к дигоксигенину, конъюгированных с щелочной фосфатазой. В случае Ано1 мы использовали флуоресцентный субстрат щелочной фосфатазы в области вкусовых почек на гистологических срезах желобоватого сосочка языка мыши (Рис. 24). Для выявления рибопроб к Ано2 использовался субстрат-хромофор NBT/BCIP. Бурые точки в области вкусовых почек на срезе соответствовали молекулам мРНК Ано2 (Рис. 25). Отметим, что в случае Ано1 интенсивность сигнала была значительно сильнее по сравнению с сигналом Ано2, однако, возможно, это связано с большей чувствительностью флуоресцентного субстрата Elf97 (Molecular Probes) по сравнению с хромофорным субстратом NBT/BCIP (Roche). Хотелось бы подчеркнуть, что гибридизация in situ показывает лишь место локализации целевой мРНК на гистологических срезах, но не является методом для количественной оценки, поскольку мы имеем дело не с прямой детекцией мРНК, а с детекцией пробы. Интенсивность сигнала на срезах определяется множеством факторов, например, нуклеотидным составом пробы и степенью деградации мРНК, которая имеет место после многочисленных проводок во время фиксации ткани, приготовления срезов и иммунохимической детекции. Еще большее значение имеют процесс проникновения пробы к целевой мРНК, которая может быть замаскирована окружающими молекулами белков на срезе, а также последующие проводки для отмывки не связавшейся пробы. Иногда на одном и том же стекле встречались срезы с хорошим сигналом и совсем без него. Поэтому метод гибридизации in situ не может применяться для количественного анализа.

Локализация Ано1 и Ано2 на срезах желобоватого вкусового сосочка мыши. Локализация белков Ано1 и Ано2 на криосрезах желобоватого сосочка языка была исследована с помощью иммунофлуоресценции и иммуногистохимии. Поскольку в этих экспериментах использовались коммерческие антитела, по существующей в настоящее время традиции необходимо подтвердить их специфичность, и этого от нас потребовали рецензенты при публикации результатов этой работы в журнале. Для подтверждения специфичности антител обычно используются срезы ткани, для которой уже установлена локализация исследуемых антигенов, и эти эксперименты служат положительным контролем метода. Для выполнения положительного контроля мы использовали срезы обонятельного эпителия OMP-GFP мышей, у которых ген зеленого флуоресцентного белка экспрессируется под контролем промотора специфического маркера зрелых обонятельных нейронов ОМР. Все дифференцированные обонятельные нейроны, установившие контакт с обонятельной луковицей, у OMP-GFP мышей обладают зеленой флуоресценцией. Для детекции аноктаминов мы использовали кроличьи анти-Ано1 и анти-Ано2 антитела (Alomone) и вторичные антивидовые антитела, меченные AlexaFluor-647 (Abcam). На одном и том же срезе мы можем увидеть, локализованы ли аноктамины (красная флуоресценция) в зрелых обонятельных нейронах (зеленая флуоресценция) или в других клеточных типах. Обонятельный эпителий является псевдо-многорядным эпителием, состоящим из трех основных клеточных типов: базальные клетки, опорные клетки и обонятельные нейроны. Ядра этих клеток лежат на разных уровнях. Нижний ряд составляют ядра базальных клеток, ядра опорных клеток находятся ближе всего к поверхности обонятельного эпителия, а посередине находятся ядра обонятельных нейронов. Схема строения обонятельного эпителия, применительно к полученным нами срезам, предоставлена на рисунке 26. Рисунок 26. Схема строения обонятельного эпителия мыши.

На конфокальных изображениях гистологических срезов OMP-GFP мышей (рис.27) очень хорошо просматривается морфология обонятельных нейронов, включая вытянутые тела, дендриты и обонятельные булавы, представленные отдельными зелеными точками на поверхности обонятельного эпителия. В этих исследованиях нас интересовал поверхностный слой обонятельного эпителия, где располагаются обонятельным булавы дендритов. По данным литературы известно, что Ано2 располагается в области тончайших цилий, отходящих от булав (Dibattista et al, 2012; Dauner et al, 2012). Топографически эта область находится на поверхности обонятельного эпителия, на границе с обонятельными булавами и чуть повыше них. Результаты иммунофлуоресцентного анализа локализации Ано2 в обонятельном эпителии приведены на рисунке 28В. Интенсивная красная полоса иммунофлуоресценции, соответствующей Ано2, покрывает сплошной широкой полосой зеленые обонятельные булавы дендритов и заканчивается чуть повыше них. Такой паттерн локализации мы получили с применением анти-Ано2 антител (Alomone) и вторичных антител, конъгированных с AlexaFluor 647 (Рис. 28В). Он соответствует цилиарной области в обонятельном эпителии (Dibattista et al, 2012; Dauner et al, 2012).