Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Раково-тестикулярные антигены как прогностические маркеры и мишени иммунотерапии опухолей 14
1.1. Генно-клеточные вакцины, разработанные в ИБГ РАН 14
1.2. Общая характеристика группы раково-тестикулярных антигенов
1.2.1. История изучения и номенклатура раково-тестикулярных антигенов 16
1.2.2. Классификация раково-тестикулярных антигенов 18
1.2.3. Регуляция экспрессии раково-тестикулярных-антигенов 19
1.2.4. Функции раково-тестикулярных-антигенов 21
1.2.5. Раково-тестикулярные антигены как мишени для иммунотерапии 23
1.3. Характеристика отдельных групп раково-тестикулярных антигенов .24
1.3.1. Раково-тестикулярные гены и антигены семейства MAGE-А 24
1.3.1.1. Номенклатура семейства MAGE 24
1.3.1.2. Экспрессия генов и антигенов семейства MAGE-A в нормальных тканях и в опухолях 25
1.3.1.3. Иммунногенность раково-тестикулярных антигенов семейства MAGE-А 27
1.3.2. Раково-тестикулярные гены и антигены семейства В AGE 29
1.3.2.1. Номенклатура семейства BAGE 29
1.3.2.2. Экспрессия генов и антигенов семейства BAGE в нормальных тканях и в опухолях 30
1.3.2.3. Иммуногенность раково-тестикулярных антигенов семейства BAGE 31
1.3.3. Раково-тестикулярные гены и антигены семейства GAGE 32
1.3.3.1. Номенклатура семейства GAGE 32
1.3.3.2. Экспрессия генов и антигенов семейства GAGE в нормальных тканях и в опухолях 32
1.3.3.3. Иммуногенность раково-тестикулярного антигена GAGE 33
1.3.4. Раково-тестикулярные антиген и reHNY-ESO-1 34
1.3.4.1. Номенклатура семейства NY-ESO-1 34
1.3.4.2. Экспрессия гена и антигена NY-ESO-1 в нормальных тканях и в опухолях 34
1.3.4.3. Иммуногенность антигенов семейства NY-ESO-1 36
1.4. Раково-тестикулярные гены и антигены при раке молочной железы...
1.5. Раково-тестикулярные гены и антигены при лейкоплакии слизистой оболочки полости рта 47
2. Материалы и методы 51
2.1 Пациенты и биообразцы 51
2.1.1. Сбор биологического материала 51
2.1.2. Пациенты с лейкоплакией и образцы слизистой оболочки полости рта.. 51
2.1.3. Пациенты с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта и характеристика собранных образцов опухолей 51
2.1.4. Пациенты с раком молочной железы и характеристика собранных образцов опухолей
2.2. Стабилизация РНК в образцах 52
2.3. Выделение тотальной РНК из стабилизированных образцов 53
2.4. Обработка РНК ДНКазой 53
2.5. Реакция обратной транскрипции 53
2.6. Система контрольных образцов для исследования экспрессии раково-тестикулярных генов человека 54
2.7. Полимеразная цепная реакция 56
2.7.1. Состав реакции 56
2.7.1.1. Состав реакционной смеси 56
2.7.1.2. Праймеры 56
2.7.2. Условия проведения ПЦР 56
2.8. Порядок проведения ПЦР для исследованных образцов 57
2.9. ДНК-электрофорез в агарозном геле 2.10. Регистрация результатов исследования 58
2.11. Учет результатов исследования 58
2.12. Анализ транскриптома клеточной линии MelP, входящей в состав генно-клеточной противоопухолевой вакцины «Аллоген»
2.12.1. Клеточная линия меланомы MelP 59
2.12.2. Выделение тотальной РНК, оценка количества, качества, обработка ДНКазой 59
2.12.3. Выделение мРНК 60
2.12.4. Построение фрагментной библиотеки 60
2.12.5. Секвенирование РНК-библиотек 61
2.12.6. Биоинформатическая обработка результатов секвенирования транскриптомов меланомы 61
2.13. Статистическая обработка результатов анализа экспрессии генов 62
3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Разработка набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики экспрессии РТ-генов методом полимеразной цепной реакции 63
3.1.1 .Выбор генов для набора реагентов 63
3.1.3. Подготовка документов для регистрационного досье «Набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики экспрессии РТ-антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)» 67
3.1.4. Состав набора реагентов
3.1.5.1. Технические испытания 71
3.1.5.2. Медицинские испытания 72
3.1.5.3. Получение регистрационного удостоверения 74
3.2. Результаты исследования экспрессии раково-тестикулярных генов в
образцах рака молочной железы 76
3.2.1. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах нормальной ткани молочной железы 77
3.2.2. Исследование экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах рака молочной железы 78
3.2.3. Сопоставление профиля экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы с набором РТ-генов клеточных линий противоопухолевых вакцин «Компливак» и «Аллоген» 82
3.3. Результаты исследования экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах лейкоплакии и плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта 84
3.3.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов в образцах нормальной слизистой оболочке полости рта 84
3.3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в образцах плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта 85
3.3.3. Результаты исследования экспрессии раково-тестикулярных генов в образцах лейкоплакии слизистой оболочки полости рта 87
3.4. Теоретическое обобщение литературных данных для обоснования перспективных направлений исследований функций MAGE-A антигенов.. 89
4. Заключение 100
5. Выводы 103 6. Список сокращений 104
7. Список литературы 107
- Регуляция экспрессии раково-тестикулярных-антигенов
- Иммуногенность раково-тестикулярного антигена GAGE
- Выделение тотальной РНК из стабилизированных образцов
- Подготовка документов для регистрационного досье «Набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики экспрессии РТ-антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)»
Регуляция экспрессии раково-тестикулярных-антигенов
Раково-тестикулярные антигены были впервые обнаружены в 1991 году Тьерри Буном и его коллегами, которые использовали очень трудный и длительный метод клонирования эпитопов Т-клеток [30]. Первый успешно клонированный опухолевый антиген был назван сначала MZ2-E, а затем MAGE-А1. В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что MAGE-А1 в нормальных тканях взрослого организма экспрессируется только в семенниках. С помощью метода клонирования эпитопов Т-клеток были открыты В AGE, GAGE1. Их экспрессия в норме также была ограничена семенниками. В 1995 году Pfreundschuh М. et al. предложили технологию клонирования опухолевых антигенов, распознающихся антителами сывороток больных опухолевыми заболеваниями - SEREX (serological expression cloning) [31]. С помощью технологии SEREX были обнаружены SSX-2, NY-ESO-1, SYCP-1. Эти антигены также экспрессировались исключительно в семенниках и опухолях. Для того чтобы объединить выявленные антигены со схожим паттерном экспрессии Chen Y.T. с соавторами, был предложен термин «раково-тестикулярные» [32]. В дальнейшем разработка RDA (representational difference analysis) [33], дифференциального дисплея (differential display), анализа кДНК-микрочипов (cDNA microarray analysis), SAGE (serial analysis of gene expression) и секвенирования EST (expressed sequence tag) способствовала поиску дополнительных продуктов генов с профилем экспрессии мРНК, ограниченным семенниками и опухолями. Накопленная информация позволила подсчитать, что РТ-антигены выявляются в 40% случаев опухолевых заболеваний.
Открываемым РТ-антигенам присваивались названия, имеющие окончание «-AGE», однако из-за бурного роста списка РТ-антигенов возникла задача разработки новой номенклатуры. Для этого было предложено использовать идентификационный номер, состоящий из букв СТ («cancerestis» - раково-тестикулярный) и цифры. Присваиваемый номер обычно соответствовал хронологическому порядку открытия. Если в семействе несколько членов, то каждому из них присваивался номер через точку [34]. При этом название генов совпадает с названием антигенов. Например, первым открытым семейством РТ-антигенов стало семейство MAGE-A, которое впоследствии получило идентификационный номер СТ1, а первый открытый антиген MAGE-А1 - СТ1.1. Вторым обнаруженным семейством РТ-антигенов стало семейство BAGE (СТ2), третьим - MAGE-B (СТЗ), четвертым - GAGE (СТ4), пятым - SSX (synovial sarcoma X) (СТ5). Шестое семейство включает в себя гены LAGEla, LAGElb и NY 18
ESO-1 (CT6), седьмое - MAGE-C (CT7). Эти 7 семейств РТ-антигенов на сегодняшний день являются наиболее изученными. Всего обнаружено 276 РТ-антигенов, которые объединены в 138 семейств, и все время открываются новые антигены. Для упорядочивания огромного потока информации, касающейся РТ-антигенов и РТ-генов, была создана электронная база данных - CTDatabase [35].
В группу РТ-антигенов входят белки с разным строением, объединяемые лишь схожим паттерном экспрессии. Гомология в строении наблюдается только внутри семейств между их членами. Принято классифицировать РТ-антигены по расположению генов, их кодирующих, в геноме. Так выделяют РТ-гены, расположенные на Х-хромосоме - СТ-Х (cancerestis X) гены (например, MAGE-А, MAGE-B, MAGE-C, LAGE, NY-ESO-1, GAGE, SSX). РТ-гены, расположенные на других хромосомах называются non-X СТ гены (например, BAGE, ACRBP, ADAM2, АКАРЗ, BORIS, SPOll, SYCP1). Из 276 РТ генов 129 локализованы на X-хромосоме, а на Y-хромосоме расположены 9 генов, принадлежащих одному семейству TSPY. По результатам исследования экспрессии 153 РТ-генов, проведенного Hoffman О. с соавторами [1], была предложена другая классификация, подразделяющая РТ-гены на 3 группы, в зависимости от того, в каких органах регистрируется их экспрессия:
Экспрессия раково-тестикулярных антигенов и генов носит яркий ткане-специфический характер, что указывает на наличие сложных эпигенетических механизмов реализации генетического материала. Для того чтобы понимать, почему в одной опухоли экспрессируются РТ-гены, а в другой — нет, необходимо, во-первых, знать, какими механизмами регулируется экспрессия генов в данной опухоли, а во-вторых, знать, с какими другими молекулярными процессами связана работа этих механизмов. Не менее актуальным является исследование механизмов регуляции трансляции мРНК, кодирующих РТ-антигены. Знание закономерностей, которые определяют, будет ли в клетке синтезирован белок или нет, исключительно важно как для диагностических целей, так и для целей иммунотерапии.
В настоящее время известно, что процесс метилирования отвечает за эктопическую депрессию РТ-генов. При использовании деметилирующих агентов, таких как 5-аза-2-дезоксицитидин, экспрессия РТ-генов в культурах опухолевых клеток усиливается. 5-аза-2-дезоксицитидин захватывает ДНК-метилтрансферазы в комплекс с ДНК, что ведет к потере метильных групп на ДНК и разрушению транскрипционного блока. Такая зависимость наблюдается для MAGE-1, -2, -3, and -6, CTAG2, SSX-2, CAGE, NY-ESO-1 [36, 37]. Дело в том, что два главных элемента промотора генов MAGE-A имеют сайты связывания Ets, которые содержат CpG динуклеотиды. Эти CpG динуклеотиды деметилированы в тех культурах опухолевых клеток, которые экспрессируют гены MAGE-А [38, 39]. Экспрессия генов определяется не только метилированием промотора, но и конфигурацией хроматина [40]. Ацетилтрансферазы и деацетилазы гистонов участвуют в посттранскрипционных модификациях, приводящих к ремоделированию хроматина. Деацетилазы гистонов в одиночку или в сочетании с 5-аза-2-дезоксицитидином также могут индуцировать экспрессию РТ-генов, включая членов семейств MAGE, SSX, NY-ESO-1. Однако при детальном исследовании этих механизмов оказалось, что для индукции и репрессии экспрессии разных РТ-генов и антигенов метилирование промоторов и ацетилирование гистонов имеют разную значимость. При исследовании иммортализированных мезенхимальных стволовых клеток было обнаружено, что для экспрессии GAGE деметилирование промоторов необходимо, но его недостаточно [37]. Для экспрессии генов и белков GAGE необходимо ацетилирование гистонов. Экспрессия белков MAGE не была обусловлена степенью метилирования проксимальных промоторов генов MAGE-A. В другой работе было выяснено, что для экспрессии генов LAGE-1 и NY-ESO-1 в опухолевых стволовых клетках необходимым условием является деметилирование промоторов, а ацетилирование гистонов увеличивает уровень экспрессии незначительно [41]. То есть ингибиторы деацетилаз гистонов и репрессоры ДНК-метилтрансфераз являются потенциальными препаратами для терапии опухолей, экспрессирующих РТ-гены [39].
Иммуногенность раково-тестикулярного антигена GAGE
В настоящее время рак СОПР и губ занимает одиннадцатое место среди всех онкологических заболеваний в мире [17], а среди мужчин в Российской Федерации - 7-е место [135]. В 90% случаев рак СОПР и губ является плоскоклеточным [175]. Рак СОПР в 60,6 % случаев выявляется на III-IV стадии, что объясняет низкий уровень пятилетней выживаемости - 48,2% [146]. Между тем, выявление заболевания на I-II стадии увеличивает уровень пятилетней выживаемости до 82,4% [176]. Проведение своевременной надежной диагностики позволяет увеличить долю выявляемых на I-II стадиях больных плоскоклеточным раком СОПР.
Лейкоплакия СОПР - хроническое заболевание, имеющее риск озлокачествления, клинически характеризуется нарушением ороговения слизистой оболочки. По Классификации опухолей головы и шеи ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) 2005 года лейкоплакия СОПР вместе с эритроплазией/эритроплакией относится к эпителиальным предраковым заболеваниям СОПР [175]. Термин «предраковые заболевания» предполагает, что все описанные под этим термином заболевания обязательно трансформируются в рак СОПР, но в действительности это не так. Поэтому Рабочей группой ВОЗ с 2005 года было рекомендовано использовать термин «потенциально злокачественные заболевания» [177]. Лейкоплакия - это наиболее распространенное и наиболее изученное предраковое заболевание СОПР [178]. В настоящее время в клинической практике отсутствует метод, позволяющий достоверно определить злокачественный потенциал каждой конкретной лейкоплакии и выбрать на основании этого стратегию лечения пациента. На данный момент единственным признанным ВОЗ прогностическим маркером риска злокачественной трансформации лейкоплакии является дисплазия эпителия [179, 180]. Показано, что лейкоплакии с тяжелой дисплазией имеют высокий риск трансформации в рак СОПР - 10%/год, лейкоплакии с легкой дисплазией имеют низкий риск - около 1-2%/год, без дисплазии - 0,2%/год [181-184]. Существует большая вариабельность в оценке наличия степени дисплазии не только у разных гистологов, но и у одного и того же гистолога [185-187]. Кроме того, наличие дисплазии, а тем более слабой или умеренной степени, не означает обязательную трансформацию лейкоплакии в рак СОПР. В настоящее время в клинической практике отсутствуют объективные прогностические маркеры, позволяющие в каждом отдельном клиническом случае определить риск злокачественной трансформации лейкоплакии СОПР и выбрать терапевтический подход. По-прежнему актуальным остается вопрос своевременной дифференциальной диагностики предрака и рака. Известны случаи, когда в биопсии отдельной части образования признаки карциномы отсутствуют (до 10% случаев [188]), а при гистологическом исследовании ткани после хирургического иссечения обнаруживается рак [186, 189].
Одним из направлений поиска прогностических факторов риска злокачественной трансформации лейкоплакии СОПР является исследование молекулярных изменений в патологических очагах [6]. Выявлены биомаркеры, наличие которых увеличивает риск злокачественной трансформации лейкоплакии СОПР: анэуплоидия [190], потеря гетерозиготности в локусах Зр и/или 9р, экспрессия сурвивина, металлопротеиназы 9 [191] и подопланина [192]. Однако проведенных исследований не достаточно для введения приведенных выше молекулярных маркеров в клиническую практику, и поиск биомаркеров активно продолжается [179, 191]. Практически неизученной областью этого поиска является экспрессия РТ-генов и кодируемых ими антигенов. Недавно в литературе появились работы, посвященные изучению экспрессии РТ-генов и РТ-антигенов в лейкоплакии. Было подтверждено, что в образцах нормальной СОПР отсутствует экспрессия генов семейства MAGE-A, а в образцах плоскоклеточного рака СОПР MAGE-A гены экспрессируются с высокой частотой: мРНК одного из десяти MAGE-А генов обнаруживалась в 93% образцов рака [193]. Было предложено использовать анализ экспрессии РТ-генов семейства MAGE-A в образцах лейкоплакии в качестве метода ранней диагностики карциномы СОПР, например, у пациентов с раком СОПР в анамнезе и у пациентов с лейкоплакиями СОПР с неопределенным риском злокачественной трансформации [193, 194]. В образцах щеточной биопсии и инцизионной биопсии лейкоплакии с подозрением на рак СОПР была детектирована экспрессия генов MAGE-A3 и MAGE-A4 [194]. Ранее экспрессия РТ-генов выявлялась только в образцах рака СОПР, поэтому лейкоплакия была полностью иссечена. По результатам гистологического исследования она оказалась ранней инвазивной карциномой. Возникло предположение, что экспрессия РТ-генов может служить маркером рака СОПР, дифференцирующим его от лейкоплакии.
В результате дальнейших исследований было выяснено, что это не совсем так. При анализе экспрессии генов семейства MAGE-A в образцах одного пациента, собранных на разных стадиях прогрессии заболевания из лейкоплакии в плоскоклеточный рак, оказалось, что в фиброме с воспалительным инфильтратом и лейкоплакии с гиперплазией нет экспрессии MAGE-A генов, а на стадии лейкоплакии с тяжелой дисплазией появляется экспрессия генов MAGE-A3, -А4, -А6, -А10 и -А 12 [195]. В развившейся из лейкоплакии карциноме дополнительно экспрессировался ген MAGE-A1. Исследование экспрессии генов семейства MAGE-A для своевременной диагностики рецидивов рака СОПР было распространено и на образцы щеточной биопсии полости рта [196].
На уровне экспрессии белка с помощью иммуногистохимического метода MAGE-A антигены были обнаружены вначале только в лейкоплакиях с дисплазией (33%), а в лейкоплакиях без дисплазии их нет [197]. В результате ретроспективных исследований впоследствии было выявлено прогностическое значение экспрессии MAGE-А антигенов (MAGE-A1, MAGE-A3, -А4, -А6, -А10, -А 12) для оценки риска трансформации лейкоплакии в плоскоклеточный рак СОПР [198, 199]. Из 24 лейкоплакий, прогрессировавших в плоскоклеточный рак СОПР, 11 экспрессировали хотя бы один MAGE-А антиген (46%). Экспрессия MAGE-А антигенов была обнаружена даже в лейкоплакии без дисплазии (42%), и эти лейкоплакии тоже трансформировались в рак. Таким образом, экспрессия MAGE-A антигенов указывает на высокий риск трансформации лейкоплакии СОПР в рак [198].
Итак, изучение экспрессии РТ-генов в потенциально злокачественных заболеваниях может дать основание для разработки диагностических методов и молекулярно-генетические предпосылки для исследования потенциала вакцин, содержащих РТ-антигены, для иммунотерапии и профилактики злокачественной трансформации. Совсем недавно получены данные о том, что РТ-антигены MAGE 50
А можно использовать для оценки риска озлокачествления лейкоплакии СОПР. Однако, во-первых, это пока единичное исследование, а во-вторых, неизвестна экспрессия других РТ-генов в лейкоплакии СОПР. В Российской Федерации подобных исследований не проводилось.
Выделение тотальной РНК из стабилизированных образцов
В состав набора входят праймеры для исследования экспрессии раково-тестикулярных генов MAGE-АЗ, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, GAGE, NY-ESO-1, LAGE-la, BAGE (Таблица 3). Данный набор содержит также праймеры к гену GAPDH, что даёт возможность проводить качественную оценку выделенной из исследуемых образцов РНК.
Праймеры, входящие в данный набор, позволяют достоверно фиксировать наличие информационной РНК в анализируемом образце, кодирующей соответствующие антигены. По результатам экспериментальной части работы делается заключение об экспрессии конкретных опухолевых антигенов в клетках гистологического материала пациента, клеточных линиях и первичных культурах, полученных из опухолевых тканей пациентов. Таблица 3 - Праймеры, входящие в состав «Набора реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)»
Особое место при разработке тест-системы уделялось выбору контролей (процесс приготовления контрольных образцов описан в главе 2.6). Сам метод ПЦР чувствителен к различным факторам, поэтому о правильности проведения исследований можно судить только при воспроизведении положительного и отрицательных контролей. В состав набора входят два положительных контрольных образца. Положительный контрольный образец 1 используется при проведении ПЦР с праймерами к гену GAPDH для оценки качества исследуемой РНК. Положительный контрольный образец 2 используется при проведении ПЦР с праймерами к РТ-генам. В качестве отрицательного контроля используется вода.
Для визуализации результатов анализа применяется метод горизонтального электрофореза, разделяющего фрагменты ДНК в агарозном геле. В норме регистрируется отсутствие полос в заданном диапазоне относительно маркера молекулярного веса, а при онкологическом заболевании может регистрироваться одна (праймеры 1, 2, 3, 4, 5 и 7), две (праймеры 6 и 8) или три (праймеры 9) полосы в этом же диапазоне. 3.1.5. Валидация тест-системы
В ходе испытания каждой пары праймеров контролировалось наличие яркого сигнала положительного контрольного образца (К+) в диапазоне длин фрагментов, специфических для данного гена, контролировалось отсутствие сигнала в отрицательном контрольном образце и в контрольном образце специфичности (КОС). В контрольном образце чувствительности 1 (КОЧ1) должен детектироваться сигнал в диапазоне длин фрагментов, специфических для данного гена. В контрольном образце чувствительности 2 (КОЧ2) специфический сигнал может присутствовать или может отсутствовать, так как концентрация мишени в данном образце низкая, на нижней границе чувствительности. Чувствительность набора реагентов «РТ-антиген» составила 10 копий матрицы (при 38 циклах амплификации) до 10 копий матрицы (при 26 циклах амплификации).
После того, как три серии набора прошли все этапы контроля качества на контрольных образцах, были проведены медицинские испытания на биообразцах. В ходе данных испытаний контролировалась воспроизводимость результатов в заявленных типах биологических образцов пациентов с подтвержденным диагнозом. Медицинские испытания включали 3 этапа, в ходе каждого из них тестировалась работа набора на разном типе биообразцов. На первом этапе испытаний участвовали биопсийные образцы злокачественных новообразований (РМЖ, плоскоклеточного рака СОПР) и клеточных линий меланомы. На втором этапе испытывали набор на образцах злокачественных опухолей (РМЖ, плоскоклеточного рака СОПР, меланома, аденокарциномы кишечника) и доброкачественных новообразованиях (полипах кишечника, лейкоплакии СОПР, доброкачественных опухолях молочной железы, невусах)), результаты приведены на Рисунках 7 и 8 соответственно. Экспрессия хотя бы одного РТ-гена была детектирована у 12 из 15 пациентов с диагнозом рак, и только у одного пациента из группы доброкачественных заболеваний (NY-ESO-1 у пациента с фиброаденомой молочной железы). Было подтверждено, что наличие экспрессии хотя бы одного из панели РТ-генов статистически достоверно ассоциируются с опухолевыми заболеваниями (р=0.0001, двунаправленный критерий Фишера).
Электрофореграмма результатов второго этапа медицинских испытаний «Набора реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)», где «К+» - положительный контроль, «К-» - отрицательный контроль, 7-12 - образцы меланом, 13-15 - образцы плоскоклеточного рака СОПР, 16 -образец фиброаденомы молочной железы, 17-19 - образцы полипов прямой кишки, 20-22 - невусы кожи, «+» - положительная проба ОТ, «-» - отрицательная проба ОТ, «М» - маркер молекулярного веса ДНК.
В ходе третьего этапа медицинских испытаний тестировалась специфичность анализа экспрессии РТ-генов набором реагентов «РТ-антиген» в биопсийных образцах злокачественных образований (РМЖ, карциномы прямой кишки, меланомы, плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта) с помощью капиллярного секвенирования последовательностей ПЦР-фрагментов. Секвенирование проводилось в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/).
Консенсусные последовательности всех ПЦР-фрагментов имели высокий уровень гомологии (от 93% до 100%) с последовательностями кДНК РТ-генов. На основании данных результатов третий этап испытаний был успешно выполнен, а экспериментальная часть процесса регистрации набора реагентов закончена.
После представления всех нормативных документов, проведения успешных технических и медицинских испытаний приказом № 10362-Пр/10 от 09 ноября 2010 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации было разрешено производство, продажа и применение изделия медицинского назначения «Набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)» на территории Российской Федерации (Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09180 от 09 ноября 2010 года) (Рисунок 9).
Внешний вид «Набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)» отражен на Рисунке 10. Рисунок 10 - Внешний вид «Набора реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)».
Подготовка документов для регистрационного досье «Набора реагентов для молекулярно-генетическои диагностики экспрессии РТ-антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-антиген)»
На мышиной модели было показано, что конститутивная экспрессия Notch-IC в клетках Сертоли приводит к преждевременному выходу гоноцитов из митотического ареста, миграции в семенные канальцы и дифференциации раньше срока. Все это приводит к гибели гоноцитов уже ко второму дню после рождения [221]. Таким образом, физиологический смысл связывания MAGE-А1 со SKIP и репрессии транскрипции под действием Notch 1-1С в сперматогониях, возможно, заключается в поддержании гоноцитов в недифференцированном состоянии в течение фетального развития.
Из работы Laduron et al. Можно сделать два принципиальных вывода -MAGE-А1 взаимодействует со SKIP и может привлекать гистоновые деацетилазы. В серии работ, выполненных под руководством Wilson Е., было продемонстрировано, что MAGE-A11 является корегулятором рецептора андрогенов, обеспечивает возможность образования связи между ним и коактиваторами семейства SRC и транскрипционным регулятором рЗОО [222-225]. На основании результатов этой серии работ была создана иллюстрация обнаруженной функции MAGE-A11 (Рисунок 23).
В рецепторе андрогенов существуют домены: NTD (Nerminal Domain), LBD (Ligand Binding Domain), DBD (DNA Binding Domain) и два сайта активации транскрипции - сайт AF1 и сайт AF2. В отсутствие агониста AR находится в цитоплазме и стабилизируется HSP (Heat Shock Protein), а через филамин-А связан с актиновыми филаментами. Поступающий в клетку тестостерон под действием 5 а-редуктазы преобразуется в ДГТ (5а-дигидротестостерон). ДГТ связывается с доменом, связывающим лиганд. Это вызывает конформационные изменения, позволяющие взаимодействовать между собой участкам на NH2- и СООН-концах -N/C взаимодействие. Связывание с агонистом и последующее N/C взаимодействие стабилизирует рецептор андрогенов. В результате этого он перемещается в ядро, где образует гомодимеры. Через сайт AF1 рецептор андрогенов связывается с ARE (Androgene Responsive Elements). Это взаимодействие привлекает коактиваторные белки (например, p/CAF) и гистоновые ацетилтрансферазы (например, рЗОО), что вызывает активацию транскрипции андроген-зависимых генов. При наличии в клетке андрогенов рецептор андрогенов и MAGE-A11 колокализуются в ядре. MAGE-A11 способен связаться с рецептором андрогенов, но эта связь кратковременная. Наличие MAGE-A11 снижает время связи рецептора андрогенов с лигандом, он может диссоциировать. В эти моменты N/C взаимодействие нарушается, и MAGE-A11 может связаться с мотивом FXXLF рецептора андрогенов и позволить присоединиться к сайту AF2 коактиваторам семейства SRC/pl60. Присоединение MAGE-A11 и коактиваторов к рецептору андрогенов привлекает гистоновую ацетилрансферазу рЗОО, которая способствует активации транскрипции андроген-зависимых генов в отсутствие ДГТ через сайт AF2.
Рецептор андрогенов - это член подсемейства рецепторов стероидов семейства ядерных рецепторов. Под действием агонистов (дигидротестостерона) рецептор андрогенов (Androgen Receptor - AR) активирует транскрипцию андроген-зависимых генов через сайт AF1 (Activation Function 1). Также AR может быть активирован через сайт AF2 под действием коактиваторов из семейства SRC/pl60. В норме активация AR под действием коактиваторов незначительна, но увеличивается при отсутствии андрогенов. Такое состояние может возникнуть в результате лечения карцином простаты путем уменьшения уровня андрогенов, то есть коактиваторы играют важную роль в работе рецептора андрогенов и вносят свой вклад в прогрессию и развитие рака простаты. Эти наблюдения привели к постулированию существования корегулятора AR, который открывает AF2 сайт для связывания коактиватора. MAGE-A11 присоединяется специфически к участку на ]ЧН2-конце рецептора андрогенов, содержащему мотив FXXLF. При этом сайт AF2 остается доступным для связывания коактиваторов. Коактиваторы семейства SRC/pl60 присоединяются к FXXLL сайта AF2. Одновременное присоединение MAGE-A11 и коактиваторов к рецептору андрогенов синергично усиливает его транскрипционную активность. MAGE-A11 использует для образования связи с рецептором андрогена высоко консервативный F-box (остатки 329-369) в MHD. Кроме того, MAGE-A11 взаимодействует с членом семейства SRC - TIF2 (Transcription Intermediary Factor 2), который увеличивает транскрипционную активность рецептора андрогенов через сайт AF2, а также с ]ЧН2-концевым мотивом FXXLF ацетилтрансферазы рЗОО, то есть MAGE-A11 связывает рецептор андрогенов с рЗОО и с коактиваторами р160 (TIF2) [224, 225]. Таким образом, MAGE-A11 путем взаимодействия с рецептором андрогенов, его коактиваторами и транскрипционными факторами может значительно активировать транскрипцию андроген-респонсивных генов, тем самым поддерживая существование андроген-зависимых опухолей. Помимо рака простаты рецепторы андрогена обнаруживаются в 2% всех карцином молочной железы и в 10% так называемых тройных негативных опухолей [167]. Возможно, для лечения этой подгруппы опухолей помимо лекарств, направленных на рецептор андрогена, в качестве адъювантной терапии было бы разумно использовать и вакцины против MAGE-А антигенов.
Работы, посвященные исследованию функций РТ-антигенов MAGE-А1 и MAGE-A11 легли в основу первой теоретической предпосылки о возможных функциях MAGE-A антигенов. Известно, что белок SKIP участвует не только в сигнальном пути Notch 1 но также в сигнальных путях витамина D3, ретиноевой кислоты, эстрогенов, глюкокортикоидов и TGFp\ Было предположено, что MAGE-А1 может взаимодействовать со SKIP в одном из перечисленных выше сигнальных путей.
Рецептор витамина D3 (Vitamin D Receptor - VDR) также принадлежит к группе ядерных рецепторов и в его структуре также могут быть выделены домены: NTD, LBD, DBD и два сайта активации транскрипции - сайт AF1 и сайт AF2. В отсутствие агониста VDR находится в цитоплазме. Поступивший в клетку 1,25-дигидроксихоликальциферол (кальцитриол) образует связь с LBD VDR. Это вызывает N/C-взаимодействие, как и в AR. Далее VDR образует гетеродимер с ретиноид-Х-рецептором (А или В) (Retinoid-X-Receptor - RXR) и перемещается в ядро. В ядре комплекс VDR с RXR и кальцитриолом связывется с респонсивными элементами витамина D3 (Vitamin D Responsive Elements - VDRE). Это взаимодействие привлекает коактиваторные белки (например, p/CAF) и гистоновые ацетилтрансферазы (например, рЗОО), что вызывает активацию транскрипции генов мишеней витамина D3. Этот процесс похож на активацию андроген-зависимых генов. Но отличие состоит в том, что в комплекс на VDRE привлекается еще белок SKIP [226-228]. Описанный сигнальный путь рецептора витамина Оз проиллюстрирован оригинальным рисунком (Рисунок 24).