Введение к работе
Актуальность проблемы.
Альфавирусы занимают особое место среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных. Медицинское значение некоторых из них определяется способностью вызывать тяжело протекающие нейроинфекции (энцефалиты, энцефаломнелиты). В более легких случаях, альфавирусы становятся причиной геморрагических лихорадок, нередко осложняющихся артритами с ярко выраженным болевым синдромом.
Альфавирусы серокомплекса ВС-ВЗЭЛ имеют широкое распространение в мире и выделяются на всех пяти обитаемых континентах. Широкий спектр возможных хозяев и переносчиков в природных условиях делает указанные вирусы весьма опасными с точки зрения возникновения эпидемических вспышек альфавирусных инфекций. На территории стран СНГ выделено более двух десятков альфавирусов, относящихся в основном к серокомплексам Спндбис-ЗЭЛ и Леса Семлики (Д.К.Львов и др., 1989).
Немаловажным является то, что некоторые представители данного рода способны не только вызывать заболевания диких животных, обеспечивая тем самым наличие эндемических очагов, но и являются причиной крупномасштабных эпизоотии среди домашних животных. В первую очередь это относится к вирусам Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ) и Западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ)(Я.51юре, 1984).
С молекулярно-биологическоіі точки зрения альфавирусы представляют собой удобную модель для изучения процессов взаимодействия вируса и клетки. Данные вирусы имеют относительно просто устроенный вирнон, хорошо репродуцируются в различных клетках, что существенно облегчает их препаративное получение и последующий биохимический анализ. Установлено, что репродукция альфавирусов, как правило, происходит независимо от функции клеточного ядра. Альфавирусы вызывают индукцию интерферона в клетке, что обеспечивает удобную модель для изучения ее защитных механизмов (Ф.И.Ершов и А.С.Новохатский, 1981).
На протяжении ряда лет альфавирусы интенсивно изучались как западными, так и отечественными исследователями (В.М.Жданов и С.Я.Гайдамович, 1982; J.H.Strauss a. E.G. Strauss, 1994). В результате этих исследований, были получены обширные данные о репликации альфа-вирусов, механизмах отдельных стадий биосинтеза компонентов вириона и их сборки, функционировании и взаимодействии друг с другом вирусных и вирус-индуцированных клеточных белков. Совершенствование методик сек-венирования позволило определить первичную структуру геномов ряда представителей рода Alphavirus (E.G.Strauss a. J.H.Strauss, 1986; В.Е. Волчков и др.,1991; K.Takkinen et al., 1986). Детальное изучение этапов биосинтеза ВС и ВЛС в клетке позволило предложить последовательную схему регуляции их репликации (M.J.Sclilesinger a. S.Schlesinger, 1986, Yu.Shirako a. J.H.Strauss, 1994), а возможность провести сравнение с другими вирусами данного рода - проверить ее и вычленить наиболее общие особенности функционирования данных вирусов. Изучение закономерностей строения и репликации альфавирусов на моделях вирусов венесуэльского и западного энцефалитов на протяжении многих лет проводится в лаборатории энзимо-логии Института вирусологии. Существенный вклад в изучение антигенных свойств, структуры и морфогенеза вириона, генетики этих вирусов их взаимосвязей с представителями других родов и семейств внесли отечественные исследователи (С.М.Клименко, 1982, Ф.Ф.Быковскин и др., 1984, Я.Я.Цилинский, 1988).
В то же время, следует отметить, что молекулярно-биологический анализ структуры и функции генома и белков альфавирусов проводился главным образом на моделях менее патогенных для человека вируса Сннд-бис и вируса Леса Семлики. Другие вирусы этого рода начали активно изучаться только в последние годы.
Особый интерес, с нашей точки зрения, вызывают альфавирусы, относящиеся к серокомплексу Синдбнс-ЗЭЛ. Это обусловлено прежде всего их широким распространением как в мире, так и на территории СНГ (Карелия, Эстония, Удмуртия, Южное Поволжье, Южный Урал, Западная Сибирь, Алтай, Северный Кавказ, Азербайджан, Западная Украина, Средняя Азия).
По данным серологических обследований (Д.К.Львов и др., 1989, Т.М. Скворцова и др., 1989) в ряде регионов России высокие титры антител к вирусам указанного серокомплекса выявляются у более 20% лиц с завоеваниями суставов неясной этиологии. В то же время диагностика инфекций, вызываемых вирусами этой группы затруднена как из-за невыраженной клинической картины заболевания, так и из-за отсутствия коммерческих тест-систем для их обнаружения.
Рекомбинантное происхождение одного из представителей данной серо-группы - вируса ЗЭЛ - заставило по-новому взглянуть на движущие силы эволюции вирусов, в частности - на значение рекомбинации для эволюции вирусов с несегментпрованным геномом. Кроме тог,о, появляется задача уточнения классификации вирусов, относящихся к серокомплексу Снндбис-ЗЭЛ. Отметим, что в последних классификациях альфавирусов высказываются предложения о выделении вируса ЗЭЛ в особую группу внрусов-рекомбинантов.
Предположение о рекомбинантной природе вируса ЗЭЛ впервые было высказано в работе Halin et al., 1988. Тем не менее, вирус ЗЭЛ оставался до настоящего времени недостаточно изученным: вывод о его рекомбинантной происхождении был сделан Hahn et al. на основании первичной структуры генома только одного штамма ВЗЭЛ (BFS-17Q3), причем им была проанализирована только 1/3 геномной РНК. Исследования, посвященные сравнению и анализу функциональных сайтов и вторичных структур регуляторних участков рекомбннантных вирусов, в настоящее время представлены отдельными сообщениями или практически отсутствуют.
Поскольку традиционно вирус ЗЭЛ на основании антигенной классификации относят к ВС-подобным вирусам, особый интерес вызывает сравнение антигенно значимых участков, а также доменов и сайтов, связанных с взаимодействием между белками оболочки и белком нуклеокапспда в процессе формирования рекомбинантного вириона. Экспериментальные исследования в этой области в настоящее время проводятся группой Strauss (B.Weiss a. S.Schlesinger, 1991; S.Lopez et al.,1994).
Появление работ по рентгеноструктурному анализу белка нуклео-капсида дало возможность проанализировать участки белка С, важные с точки зрения взаимодействия с белками оболочки и латерального взаимодействия (взаимодействия между отдельными копиями С-белка) в процессе формирования рекомбинантного вириона. Подобные исследования позволяют оценить возможность формирования жизнеспособного природного рекомбинанта и экспериментально смоделировать этот процесс.
Выявление среди альфавирусов природных вариантов, допускающих включение в состав зрелого вириона субгеномной 26S РНК, делает необходимым проверку ранее высказанных гипотез о функциональных участках 42S РНК и белка нуклеокапсида, значимых для формирования полноценного вириона. С другой стороны, это свойство, обнаруженное у альфа-вирусов теплокровных, позволяет провести параллели со сборкой мульти-партитных вирусов растений, входящих в одно суперсемейство с представителями рода Alphavirus и имеющих много структурных и функциональных особенностей, объединяющих их с альфавнрусами животных.
Выдвинутая Halm et al., 1988 гипотеза предполагает рекомбинацию геномов двух родительских вирусов, один из которых обладает выраженными энцефалитогенными свойствами (ВВсЭЛ), а другой не вызывает поражения головного мозга (ВС) с образованием энцефалитогенного вируса с белками оболочки, унаследованными от менее патогенного предка. Это явление позволяет предположить, что существенный вклад в патоген-ность возникшего рекомбинанта внесли белки полимеразного комплекса и белок нуклеокапсида. В связи с этим представляется целесообразным установить происхождение и функциональный вклад в интегратнвное свойство патогенности и цитоцидности неструктурных белков рекомбинантного вируса ЗЭЛ. Сравнение отдельных функциональных участков белков полимеразного комплекса у разных альфавирусов является одним из подходов для такого анализа. Его результаты могли бы явиться основой для проведения экспериментов по получению рекомбинантных вирусов.
Практическое значение такого рода работы объясняется возможностью создания эффективных вакцинных штаммов, обладающих высокой пммуно-
генностью и широкой перекрестной иммунореактивностью при отсутствии энцефалитогенных признаков.
Предположение о корреляции цитопатичности альфавирусов и развития апоптоза в зараженной клетке с точечными заменами в белке Е2 позволяет более подробно проанализировать этот участок у всех изученных альфа-вирусов. Другим важным практическим результатом такой работы могли бы быть рекомендации по изменению или элиминации этого участка из структуры генома с целью получения слабовирулентных живых вакцин или РНК-вирусных векторов.
Высказанная ранее гипотеза о механизмах гибели клеток при альфа-вирусной инфекции (Л.В.Урываев, 1991) объединяет разрозненные подходы и увязывает основные метаболические изменения в клетке. Обнаруженные черты сходства белка нуклеокапсида и некоторых ядерных РНП-белков клетки, выполняющих транспортную функцию, позволяют сравнить особенности строения вирусного и клеточных белков.
В последние годы накапливается все большее количество данных об эволюционной преемственности отдельных функциональных мотивов, сохраняющихся в структуре модифицированных белков. Углубление знаний об уровнях наследования генетической информации позволит разработать новые подходы к созданию иммуногенных и противовирусных препаратов.
Цель и задачи исследования Все вышеизложенное позволило выдвинуть в качестве основной задачи нашего исследования - уточнение и анализ деталей строения и функционирования генома альфавирусов на модели рекомбинантного вируса ЗЭЛ (шт.МсМіІІап-16310).
В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:
I) Выяснение первичной структуры генома вируса ЗЭЛ (шт.МсМіїїап),
сопоставление последовательностей отдельных генов двух изученных в
настоящее время штаммов вируса ЗЭЛ, а также сравнение вируса ЗЭЛ с
другими представителями серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ и со всеми
изученными альфавирусами. Уточнение эволюционного происхождения и филогенетических взаимосвязей вируса ЗЭЛ и его отдельных генов.
-
Поиск и локализация в первичной структуре белков вируса ЗЭЛ (шт.МсМіИап) участков, функциональная значимость которых была ранее показана для других вирусов, в том числе и не входящих в род Alphavirus.
-
Поиск и локализация в геноме вируса ЗЭЛ (шт.МсМШап) функционально значимых участков. Анализ регуляторных участков генома и сравнение их вторичных структур.
В качестве прикладной была поставлена задача по проведению расчетов олнгонуклеотидов для их последующего использования в качестве прай-меров в ПЦР, основываясь на полученных нами данных о первичной структуре генома ВЗЭЛ и участков гомологии отдельных генов альфавпрусов.
Новизна и практическая ценность.
На основании детального анализа генома вируса ЗЭЛ (штамм McMilhm-16310-5614) были получены новые доказательства рекомбинант-ной природы этого вируса. Выполнен расширенный сравнительный анализ функционально значимых участков ряда белков альфавпрусов.
Локализованы ранее неизвестные у альфавпрусов функционально значимые участки - бипартитные сигналы ядерной транслокации в белках nsP2 и С, что объясняет обнаружение этих белков в ядре зараженной клетке и позволяет предположить их регуляторную роль в программируемой гибели клеток. Построена вторичная структура промотора синтеза субгеномной РНК.
В результате сравнения протяженных участков генома ВКЛ, установлена принадлежность данного вируса к ВС-подобным и его филогенетическая близость с вирусом Окельбо.
Полученные данные были использованы при расчете олнгонуклеотид-ных праймеров с целью создания дпагностикума для выявления генетического материала ВС-подобных и ВЗЭЛ-подобных вирусов в биопробах и их типирования.
' В методические рекомендации "Организация эколого-эпидемиоло-гического мониторинга территории Российской Федерации". (Москва, 1993.) включены критерии выбора ПЦР-праймеров и условия их использования в ГЩР.
На защиту выносятся следующие полол/сепия '
1) На основании сравнительного анализа:
5-первичных структур генов и белков и функционально значимых участков геномов представителей рода альфавирусов,
физико-химических свойств белков,
анализа филогенетических взаимосвязей внутри рода Alphavirus,
вторичной структуры участков РНК установлено, что по белкам EI и Е2 вирус ЗЭЛ близок к вирусам Синдбис и Аура, образуя вместе с ними группу ВС/ВЗЭЛ-подобных вирусов, а по белкам полнмеразного комплекса и белку С - к вирусам ВсЭЛ и ВЭЛ, образуя вместе с ними группу энцефалитных вирусов Нового Света. З'-нетранслируемая область ВЗЭЛ включает как ВС-подобные, так и ВВсЭЛ-подобные элементы.
2) В белках вируса ЗЭЛ локализованы потенциальные функциональ
ные мотивы:
- в белке nsP2 - гелнказный мотив, протеазный мотив и бмпартитный
сигнал ядерной транслокацин (ранее у альфавирусов не описан),
- в белке С - протеазный мотив, сайты взаимодействия с глико-
протеинами оболочки, бмпартитный сигнал ядерной транслокации (ранее у
альфавирусов не описан); уточнена консенсусная последовательность
взаимодействия С-белка с большой рибосомальной субъединицей.
- в белках Е2, Е1 и 6К локализованы трансмембранные домены.
3) Анализ первичной структуры участков генома вируса Карельской
лихорадки доказывает принадлежность ВКЛ к Синдбис-подобным вирусам.
Публикация работ.
Основные положения диссертации отражены в 12 опубликованных научных работах. Определенные нуклеотидные последовательности депонированы в EMBL.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены и обсуждены на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН в феврале 1996г. Отдельные этапы проведенных исследований были представлены на III европейском конгрессе по ветеринарной вирусологии (Интерлакен, Швейцария, 1994), X международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, Израиль, 1996) и международной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, Россия, 1996).
Автор выражает искреннюю благодарность за продуктивное сотрудничество сотрудникам НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского Т.М.Соко-ловой, Т.К.Селивановой, Н.А.Парасюк, К.С.Ионовой, Е.И. Самохвалову, В.П.Юферову, а также сотрудникам ВНИИ молекулярной биологин (Кольцово, Новосибирская область) В.М.Блинову, В.Е.Волчкову, П.Ф. Сафронову, С.В.Нетесову, совместно с которыми выполнялись отдельные этапы работы.