Введение к работе
Актуальность проблемы. Ротавирусы (род Rotavirus, семейство Reoviridae) являются этиологическим агентом тяжелых дегидратирующих диарей преимущественно у детей младшего возраста, обусловливая в разных странах от 20 до 60% случаев, требующих госпитализации [Бюл. ВОЗ, 1991]. Интенсивное изучение ротавирусов человека со времени их открытия в 1973 г. позволило выявить существование различных серологических групп, подгрупп, серотипов, геногрупп вируса и электрофоретипов геномной РНК [Estes М, Cohen N.,1989]. Значение ротавирусов в инфекционной патологии человека, их антигенное и генетическое разнообразие определяют необходимость проведения постоянного контроля за циркулирующими штаммами. Использование при этом молекулярных характеристик стимулировалось сложностями культивирования ротавируса человека (РВЧ), что привело к поиску альтернативных серотипированию подходов к дифференциации штаммов.
Одним из молекулярно-генетических методов дифференциации штаммов является элекгрофоретипирование ротавирусов, основанное на анализе профиля распределения одиннадцати сегментов двупитевой РНК ротавирусного генома при электрофорезе в геле [Kalica A.R., 1978, Espejo R.T., 1979]. Электрофоретипирование широко применяется за рубежом для характеристики циркулирующих штаммов, выявления доминирующих генетических вариантов вируса, установления эпидемиологических связей в очаге инфекции [Lonrenco М.Н., 1981; Cash P. et al, 1986; Clark J.D. et al, 1988; Stewien K.E. et al, 1994]. Однако, отсутствие единого подхода к типировашпо затрудняет сравнение результатов и обобщение данных, полученных разными авторами и обусловливает целесообразность проведения исследований по унификации метода электрофоретипирования ротавирусов.
Работы отечественных авторов посвящены использованию метода в диагностике ротавирусного гастроэнтерита (РВГЭ), выяснению клинического значения определения электрофоретипа РНК, оценке роли метода в изучении эпидемиологии ротавирусной инфекции [Букринская А.Г. и соавт., 1986; Хаустов В.И. и соавт., 1989; Тен Н.А. и соавт., 1991; Васильев Б.Я. и соавт., 1995]. В то же время недостаточно внимания уделено изучению циркуляции ротавирусов с различными электрофоретипами (ЭФ-типами) РНК, оценке значения конкретных типов вируса в возникновении гастроэнтеритов, установлению доминирующих в популяциях генетических вариантов вируса и анализу их распространенности, что определило актуальность настоящей работы, направленной на исследование генетической гетерогенности ротавирусных популяций, циркулирующих на территории ряда городов европейской части Российской Федерации, и выявление наиболее значимых в этиологии РВГЭ генетических вариантов вируса.
Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ в качестве фрагмента № 004.06 к договору № 3-157-04 «Средства и методы, направленные на снижение заболеваемости энтеро- и ротавирусными инфекциями», № госрегистрации 018700099929.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение генетических вариантов ротавируса человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации, с использованием унифицированного метода электрофоретипирования штаммов.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Оптимизировать метод электрофоретипирования ротавирусов.
2. Провести электрофоретипирование ротавирусов человека,
циркулирующих на территории ряда регионов европейской части России.
Составить классификационную схему электрофоретипов РНК.
3. Определить доминирующие в популяциях электрофоретипы РНК,
оценить распространенность различных генетических вариантов РВЧ на
изучаемой территории.
. 4. Изучить генетические взаимоотношения между ротавирусами человека с доминирующими электрофоретипами РНК.
5. Оценить значимость электрофореза РНК в изучении ротавирусной
инфекции человека. /
Научная новизна работы. Впервые по результатам широких исследований с применением молекулярно-генетических методов охарактеризованы генетические варианты ротавируса человека, циркулирующие на территории четырнадцати городов Российской Федерации. Составлена классификационная схема, отражающая их многообразие и включающая в себя пять электрофорегрупп РНК. Определены доминирующие в популяциях электрофоретические типы ротавирусов. Впервые выявлен наиболее широко распространенный, генетически стабильный вариант ротавируса, вызывающий основную массу ротавирусных гастроэнтеритов на изучаемой территории.
Получены новые данные о распространенности на территории нашей страны ротавирусов группы С, обнаружен регион их интенсивной циркуляции.
Предложен бесфенольный способ обработки первичного копроматериала, новизна которого подтверждена авторским свидетельством №1448448 «Способ получения двунитевой рибонуклеиновой кислоты ротавирусов», приоритет от 24.02.87.
Практическая значимость работы. Унифицирован метод
электрофоретипирования РВЧ путем оптимизации методических приемов получения картин миграции ротавирусной РНК в геле и анализа электрофоретипов на основе разработанной классификационной схемы. Составлено информационное письмо «Электрофоретипы ротавирусов человека и их классификационная схема» [Горький, 1990], являющееся практическим пособием по электрофоретипированию РВЧ, которое используется при
обучении специалистов центров СЭН в рамках действующего при ННИИЭМ семинара «Новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний и способы типирования их возбудителей».
Бесфенольный способ экстракции РНК ротавирусов был использован при создании ДНК-зондов для выявления и дифференциации ротавирусов человека, а также применен в лабораторной диагностике ротавирусной инфекции, результаты которой учитывались работниками лечебных учреждений при выборе методов лечения больных.
В процессе работы по теме расшифрована ротавирусная этиология 29,3% случаев острой кишечной инфекции небактериальной природы, охарактеризован этиологический агент ряда вспышек заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Комплекс оптимизированных методических приемов, в том числе
бесфенольная экстракция РНК, стандартизация условий электрофореза,
упрощенная окраска гелей серебром, использование классификационной схемы
ЭФ-типов РНК, обеспечивает надежную дифференциацию штаммов РВЧ
методом электрофоретипирования.
2. На фоне широкой генетической вариабельности штаммов,
циркулирующих на территории европейской части России, существуют
доминирующие в популяциях электрофоретические типы ротавируса, один из
которых, характеризующийся генетической стабильностью, широкой
распространенностью и продолжительной циркуляцией, играет ведущую роль в
возникновении небактери&тьных гастроэнтеритов на изучаемой территории.
3. Атипичные ротавирусы характеризуются низкой частотой выявления в
целом и интенсивной циркуляцией в одном из исследованных регионов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на
конференциях молодых ученых в Горьковском НИИ эпидемиологии и микробиологии (Горький, 1988) и в институте им. Пастера (Ленинград, 1988), на республиканской конференции «Актуальные вопросы медицинской вирусологии» (Свердловск, 1989), Всесоюзном съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Алма-Ата, 1989), на совместном заседании семинаров по проблемам эпидемиологии, микробиологии и вирусологии и по проблемам биохимии Нижегородского НИИЭМ (1991, 1996).
Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 18 июня 1996 г.
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения и выводов; изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 5 рисунков, 12 фотографий. Список литературы включает 272 источника.