Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений .5
2. Общая характеристика работы
2.1. Актуальность работы .6
2.2. Цели и задачи исследования .8
2.3. Научная новизна и практическая значимость работы 9
2.4. Апробация работы .9
2.5. Структура и объем диссертации .10
3. Обзор литературы 11
3.1. Общая характеристика клеточного ответа на тепловой шок и другие формы стрессовых воздействий 11
3.1.1. Регуляция транскрипции при стрессе .12
3.1.2. Регуляция трансляции при стрессе 13
3.1.3. Стресс эндоплазматического ретикулума 14
3.1.4. Влияние стресса на репликацию и целостность ДНК .15
3.1.5. Белки теплового шока (Hsp) и их роль в поддержание гомеостаза клеток
3.1.5.1. Функции Hsp и регуляция экспрессии генов hsp при стрессе 17
3.1.5.2. Роль Hsp в регуляции фенотипической изменчивости организмов 20
3.2. Регуляция экспрессии генов с помощью коротких некодирующих РНК 22
3.2.1. Механизмы образования и функционирования миРНК 23
3.2.2. Роли миРНК в физиологии клеток 29
3.2.3. Функции и особенности регуляции миРНК при стрессе
3.2.3.1. Типы регуляции активности миРНК и миРНК-RISC при стрессе 32
3.2.3.2. Изменение внутриклеточной локализации миРНК-белковых комплексов при стрессе 37
3.2.3.3. Функции миРНК при патологиях
3.2.4. Происхождение, образование и функции пиРНК 42
3.2.5. пиРНК-кластеры – основной источник пиРНК в герминальных тканях дрозофилы .43
3.2.6. Особенности первичного и вторичного процессинга пиРНК 45
3.2.7. Биологические функции пиРНК 48
4. Материалы и методы .52
4.1. Молекулярно-биологические методы 52
4.1.1. Использованные линии D. melanogaster 52
4.1.2. Условия теплового шока и определение термоустойчивости 52
4.1.3. Выделение тотальной РНК .52
4.1.4. Выделение геномной ДНК .53
4.1.5. Электрофорез нуклеиновых кислот 53
4.1.6. Реакция обратной транскрипции .54
4.1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) .54
4.1.8. Количественная ПЦР 55
4.1.9. Нозерн-гибридизация
4.1.10. Гибридизация по Саузерну 56
4.1.11. Клонирование и секвенирование библиотек коротких РНК 57
4.1.12. Вестерн-блоттинг 58
4.1.13. Гель-шифт анализ .59
4.1.14. Включение [35S]-Met в белки слюнных желез личинок D. melanogaster 59
4.1.15. Иммунноокрашивание яичников D. melanogaster .60
4.1.16. Статистический анализ .60
4.1.17. Последовательности использованных олигонуклеотидов 60
4.2. Биоинформатические методы
4.2.1. Обработка библиотек коротких РНК 62
4.2.2. Анализ дифференциальной экспрессии миРНК и пиРНК 62
4.2.3. Прогнозирование мишеней миРНК .63
4.2.4. Анализ генной онтологии .64
4.2.5. Анализ последовательностей .64
5. Результаты .65
5.1. Регуляция экспрессии миРНК в ответ тепловой шок
5.1.1. Особенности физиологии организма после теплового шока при недостатке Hsp70 65
5.1.2. Динамика ответа на тепловой шок при нарушении действия основного фактора транскрипции Hsf .67
5.1.3. Анализ дифференциальный экспрессии миРНК после теплового шока 69
5.1.4. Функциональный анализ мишеней термочувствительных миРНК 72
5.1.5. Анализ профилей экспрессии миРНК после теплового шока 75
5.1.6. Анализ экспрессии при-миРНК, а также генов миРНК пути в ответ на тепловой шок .81 5.1.7. Сравнительно-функциональный анализ стрессчувствительных генов и
термочувствительных миРНК .84
5.2. Особенности экспрессии пиРНК после воздействия теплового шока .87
5.2.1. Анализ дифференциальной экспрессии пиРНК после теплового шока 87
5.2.2. Локализация Hsp70 в клетках яичника дрозофилы .89
5.2.3. Поиск корреляции между уровнем экспрессии МЭ и изменением уровня экспрессии гомологичных пиРНК после теплового шока 90
5.2.4. Анализ экспрессии пиРНК-кластеров после теплового шока
6. Обсуждение .99
7. Выводы 106
8. Список цитируемой литературы 107
- Научная новизна и практическая значимость работы
- Влияние стресса на репликацию и целостность ДНК
- Клонирование и секвенирование библиотек коротких РНК
- Функциональный анализ мишеней термочувствительных миРНК
Введение к работе
Актуальность темы
За последние 15 лет было открыто несколько классов коротких некодирующих РНК, которые принимают активное участие в регуляции экспрессии генов на всех этапах реализации генетической информации. Наибольшее внимание привлекают два класса коротких РНК – микроРНК (миРНК), подавляющие экспрессию белок-кодирующих генов и пиРНК, регулирующие экспрессию мобильных генетических элементов (МЭ) в репродуктивных органах.
миРНК образуются из предшественника, обладающего характерной
шпилечной вторичной структурой, в результате многоступенчатого процессинга с
участием эндорибонуклеаз III типа - комплексом Drosha/DGCR8 в ядре и белком
Dicer в цитоплазме. Сформированные или зрелые миРНК (длина 21-23 нт.)
взаимодействуют с белками Argonaute (Ago) и образуют комплекс выключения
гена (миРНК-RISC; от англ. RNA-induced silencing complex), в составе которого
могут узнавать последовательности мРНК, имеющие неполную
комплементарность молекулам миРНК, и подавлять их экспрессию. Эти последовательности, в основном, расположены в 3’-нетранслируемых областях (НТО) мРНК-мишени. Благодаря своей функции миРНК выполняют важнейшую роль в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток, а также в развитии организма.
Воздействие стрессовых факторов оказывает существенное влияние на физиологию клеток. В зависимости от тяжести и продолжительности стрессового воздействия, клетки либо стремятся к сохранению гомеостаза, либо стараются адаптироваться, корректируя базовую программу экспрессии генов. В данном контексте миРНК могут служить подходящим молекулярным инструментом для изменения паттерна экспрессии генов. Исследования последних лет показали, что при стрессе, в частности, при воздействии теплового шока (ТШ), наблюдается изменение уровней экспрессии миРНК, а также модуляция активности миРНК-RISC-комплекса. На культурах человеческих клеток показано, что в условиях стресса Ago2 подвергается поли(АДФ)-рибозилированию, в результате чего снижается сродство миРНК-RISC к мРНК-мишени. Кроме того, под действием ТШ происходит фосфорилирование Drosha и нарушение его взаимодействия с кофактором DGCR8, что приводит к нарушению процессинга миРНК.
Таким образом, непосредственно при стрессе происходит общее снижение миРНК-опосредованной репрессии в клетках. Однако особенности регуляции
миРНК в динамике развития ответа на ТШ изучены недостаточно. Например, не ясно, какой вклад вносят миРНК в формирование адаптационного профиля экспрессии генов.
К настоящему времени описано множество случаев активации МЭ при
воздействии абиотических и биотических стимулов у животных и растений. Одним
из возможных подходов для понимания молекулярных механизмов действия ТШ и
других стрессовых факторов на активность МЭ является изучение
функционирования системы пиРНК, препятствующей активации МЭ. Сравнение паттернов пиРНК до и после воздействия ТШ позволяет оценить влияние стресса на всю совокупность экспрессирующихся МЭ. Несмотря на активное изучение роли коротких РНК при стрессе, характер влияния ТШ на экспрессию пиРНК в герминальных клетках подробно не исследовался.
К настоящему времени накоплено большое количество данных, указывающих на важную роль белков-шаперонов в биогенезе миРНК и пиРНК. В частности, показано, что взаимодействие Hsp90 с Ago и Dicer необходимо для формирования миРНК-RISC-комплекса. Также установлено, что мутация гена hsp90, а также воздействие гелданамицина (ингибитора Hsp90) ведут к дерепрессии транспозонов.
Известно, что экспрессия многих Hsp существенно повышается при воздействии стрессовых факторов. Белки семейства Hsp70 доминируют в общем паттерне Hsp, синтезируемых в ответ на стресс. Помимо шаперонной активности, белки Hsp70 контролируют активность ряда протеинкиназ и факторов транскрипции и вовлечены в регуляцию различных сигнальных путей. В совокупности эти данные позволяют предположить, что физиологическая активность Hsp70 влияет на функционирование миРНК-RISC и пиРНК-RISC-комплексов в условиях стресса.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось изучить особенности регуляции экспрессии коротких некодирующих РНК в динамике развития ответа на тепловой шок, а также выявить роль основного стрессового белка Hsp70 в формировании адаптационного профиля экспрессии коротких РНК в условиях стресса у Drosophila melanogaster. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ дифференциальной экспрессии миРНК у различных линий D. melanogaster, в том числе у линии с делетированными генами hsp70 до и после воздействия теплового шока.
-
Определить группы миРНК, динамика экспрессии которых в условиях сильного стресса зависит от физиологической активности Hsp70.
-
Провести количественную оценку уровней экспрессии первичных транскриптов миРНК (при-миРНК) для ряда зрелых термочувствительных миРНК.
-
Определить мишени термочувствительных миРНК среди стрессчувствительных генов.
-
Провести анализ дифференциальной экспрессии пиРНК, а также пиРНК-кластеров в герминальных тканях D. melanogaster до и после воздействия теплового шока.
-
Локализовать экспрессию Hsp70 в клетках яичника дрозофилы.
Научная новизна и практическая значимость работы
В работе впервые показано, что выраженный межлинейный полиморфизм
экспрессии миРНК нивелируется после воздействия сильного ТШ, в результате
чего формируется унифицированный паттерн экспрессии миРНК. Установлено, что
функционально общие группы стрессчувствительных генов могут регулироваться
различными группами термочувствительных миРНК, демонстрирующих
различные профили экспрессии в ответ на ТШ. Обнаружено, что регуляция экспрессии многих термочувствительных миРНК происходит на посттранскрипционном уровне. Показано, что делеция генов hsp70 влияет на динамику экспрессии миРНК в ходе развития ответа на ТШ. Также впервые показано, что воздействие ТШ приводит к изменению уровней экспрессии ряда двунитевых пиРНК-кластеров в герминальных клетках яичника дрозофилы. Выявлено, что экспрессия Hsp70 происходит исключительно в соматических клетках фолликулов дрозофилы.
Полученные результаты дополняют наши знания о механизмах регуляции физиологических процессов в условиях стресса, в частности, с помощью изменения уровней экспрессии миРНК. Количественный анализ пула пиРНК после ТШ позволил оценить влияние ТШ на общую активность МЭ в условиях стресса, и тем самым расширить наше понимание роли абиотических факторов в мобилизации транспозонов.
Апробация работы
Работа была апробирована на межлабораторном коллоквиуме в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (г. Москва, Россия); работа также была представлена в виде устных и постерных докладов на отечественной и международных научных конференциях: RNAi (2016), FEBS congress (2015) и Биология – наука 21 века (2015).
Объем диссертации
Материал диссертации изложен на 140 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 7 таблиц. Список цитированной литературы включает 410 источников.
Научная новизна и практическая значимость работы
Открытие механизма РНК-интерференции – одно из наиболее существенных и важных достижений в области молекулярной биологии за последние несколько десятилетий. В общем понимании механизм РНК-интерференции сводится к подавлению экспрессии и, следовательно, активности генов с помощью комплементарных коротких РНК, длина которых составляет 21-30 нт. (Kim et al., 2009). Изначально роль коротких РНК сводилась к борьбе с РНК-кодирующими вирусами. Однако к настоящему времени накоплено огромное количество данных, демонстрирующих, что короткие РНК принимают активное участие в регуляции экспрессии белок-кодирующих генов (миРНК путь), а также подавляют экспрессию мобильных генетических элементов в репродуктивных органах животных (пиРНК путь) (Kim et al., 2009; Siomi et al., 2011).
миРНК – это класс коротких некодирующих молекул РНК, длиной 21-23 нт., которые образуются из предшественника, обладающего характерной шпилечной вторичной структурой, в результате многоступенчатого процессинга с участием эндорибонуклеаз III типа - комплексом Drosha/DGCR8 в ядре и белком Dicer в цитоплазме (Kim et al., 2009). Сформированные или зрелые миРНК взаимодействуют с белками Argonaute (Ago) и образуют миРНК-RISC-комплекс (от англ. RNA induced silencing complex), в составе которого могут узнавать последовательности мРНК, имеющие неполную комплементарность молекулам миРНК, и подавлять их экспрессию. Эти последовательности, в основном, расположены в 3 -нетранслируемых областях (НТО) мРНК-мишени. По оценке компьютерных алгоритмов прогнозирования мишеней миРНК, до 60% всех генов находится под контролем миРНК (Friedman et al., 2009). Как правило, каждая миРНК имеет сайты связывания в 3 -НТО многих мРНК, а одна мРНК представляет собой потенциальную мишень для нескольких миРНК, вследствие чего миРНК формируют сложную сеть регуляторных взаимодействий (Bartel, 2004; Berezikov, 2011). Благодаря тому, что миРНК контролируют синтез белков в клетке путем репрессии трансляции или деградации целевой мРНК, они выполняют важнейшую роль в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток, а также развитии организма (Bushati and Cohen, 2007).
Исходя из концепции гомеостаза, любая биологическая система стремится к поддержанию динамического равновесия посредством координированных биохимических реакций. Таким образом, стрессовым воздействием, в широком смысле, будет являться любое воздействие, приводящее к нарушению равновесного состояния внутренней среды. В зависимости от тяжести, а также продолжительности стрессового воздействия, клетки либо стремятся к восстановлению исходного клеточного гомеостаза, либо стараются адаптироваться, корректируя базовую программу экспрессии генов. В данном контексте, миРНК могут служить удобным молекулярным инструментом для изменения паттерна экспрессии генов. Исследования последних лет в данной области показал, что при стрессе, в частности, при воздействии теплового шока (ТШ), наблюдается изменение уровней экспрессии миРНК, а также модуляция активности миРНК-RISC (Leung and Sharp, 2010). Недавно у Caenorhabditis elegans удалось выявить ключевые миРНК, необходимые для сохранения двигательных, репродуктивных и поведенческих функций после воздействия ТШ (Nehammer et al., 2015). Объектом активного изучения является регуляция функционирования ключевых белков миРНК-пути при стрессе. На культурах человеческих клеток показано, что в условиях стресса Ago2 подвергается поли(АДФ)-рибозилированию в результате чего снижается сродство миРНК-RISC к мРНК-мишени (Leung et al., 2011). Также продемонстрировано, что фосфорилирование Drosha под действием стрессовых факторов нарушает его взаимодействие с кофактором DGCR8 и приводит к нарушению процессинга миРНК (Yang et al., 2015).
Таким образом, непосредственно при стрессе происходит общее снижение миРНК-опосредованной репрессии в клетках. Однако особенности регуляции миРНК в динамике развития ответа на ТШ недостаточно изучены. Например, не ясно, какой вклад вносят миРНК в формирование адаптационного профиля экспрессии генов.
Спонтанные стрессовые воздействия являются индукторами геномной нестабильности, так как могут приводить к амплификации и транспозиции мобильных генетических элементов (МЭ). К настоящему времени зарегистрированы случаи как спонтанной активации МЭ, так и активации при воздействии абиотических стимулов у животных и растений (Guerreiro, 2012). Одним из возможных подходов для понимания молекулярных механизмов действия ТШ и других стрессовых факторов внешней среды на активность МЭ является изучение функционирования системы пиРНК (от piRNA, Piwi-interacting RNAs) (Siomi et al., 2011). Большинство пиРНК комплементарны последовательностям МЭ и другим геномным повторам, а их экспрессия происходит, в основном, в репродуктивных органах животных (Siomi et al., 2011). Сравнение паттернов пиРНК до и после воздействия ТШ позволяет оценить влияние стресса на всю совокупность экспрессирующихся МЭ. Несмотря на активное изучение роли коротких РНК при стрессе, характер влияния ТШ на экспрессию пиРНК в герминальных клетках подробно не исследовался.
К настоящему времени накоплено большое количество данных, указывающих на важную роль белков-шаперонов в биогенезе миРНК и пиРНК. В частности, установлено, что взаимодействие Hsp90 с Ago и Dicer необходимо для формирования миРНК-RISC (Miyoshi et al. 2009; Iwasaki et al., 2010). Мутация гена hsp90, а также воздействие гелданамицина (ингибитора Hsp90) ведет к дерепрессии транспозонов (Specchia et al. 2010). Кроме того, к активации МЭ приводит недостаток кошаперона Shutdown (Shu) в герминальных клетках (Preall et al., 2012). Установлено, что Hsp90 совместно с Shu участвуют в первичном процессинге пиРНК (Specchia et al., 2010; Preall et al., 2012).
Хорошо известно, что экспрессия многих Hsp существенно повышается при воздействии стрессовых факторов, таких как ТШ, воздействие различных окислителей, при аноксии и т.п. Причем белки семейства Hsp70 доминируют в общем паттерне Hsp, синтезируемых в ответ на стресс (Lindquist, 1986; Morimoto et al., 1992). Помимо шаперонной активности, белки Hsp70 контролируют активность ряда протеинкиназ и факторов транскрипции и вовлечены в регуляцию различных сигнальных путей (Evgen ev et al., 2013). При ТШ Hsp70 мигрирует из цитоплазмы в ядро клетки, где может взаимодействовать c белками ядерного матрикса (Abe et al., 1995). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что физиологическая активность Hsp70 влияет на активность миРНК-RISC и пиРНК-RISC-комплексов в условиях стресса.
Влияние стресса на репликацию и целостность ДНК
Наиболее изученной моделью стрессового воздействия является воздействие ТШ на биологическую систему. Следует отметить, что воздействие ТШ является одной из наиболее сильных форм стресса и обладает рядом особенностей. Одним из эффектов ТШ на физиологию клеток является временное подавление активности РНК полимеразы II (Dubois et al., 1997). Данный эффект на транскрипцию вызван тем, что при ТШ происходит инактивация протеинкиназы, под действием которой происходит гиперфосфорилирование С-концевого домена РНК полимеразы II и переход транскрипционного комплекса от стадии инициации к стадии элонгации транскрипции (Dubois et al., 1997). Кроме того, известно несколько механизмов, при которых транскрибируемые SINE (короткие диспергированные повторы; от англ. short interspersed elements) РНК связываются с РНК полимеразой II и блокируют сборку преинициаторного комплекса при ТШ, тем самым подавляя транскрипцию на стадии инициации (Mariner et al., 2008; Yukovchuk et al., 2009). Вклад в общее снижение уровня транскрипции при ТШ может вносить снижение уровня ацетилирование гистонов и сдвиг статуса хроматина к более закрытому типу (Fritah et al., 2009). Примечательно, что транскрипционный фактор Hsfl, активирующий транскрипцию генов hsp, принимает участвие в деацетилировании гистонов при ТШ (Fritah et al., 2009).
Воздействие ТШ отличается от других форм стресса еще и тем, что ингибирует сплайсинг (Yost and Lindquist, 1986; Biamonti and Caceres, 2009). Ключевым белком-ингибитором сплайсинга при ТШ является фактор сплайсинга SRp38 (Shin et al., 2004). Показано, что в нормальных физиологических условиях SRp38 находится в фосфорилированной форме, но при ТШ фосфорилирование SRp38 резко снижается, что приводит к сильному ингибированию сборки сплайсосом in vitro (Shin et al., 2004). Следует отметить, что блокирование сплайсинга, как и снижение уровня транскрипции, носит временный характер и восстанавливается в течение нескольких часов после прекращения воздействия повышенной температуры.
Несмотря на более выраженный эффект при ТШ остальные формы стресса также воздействуют на аппарат транскрипции (Thomas and Lieberman, 2013). Например, небольшие дозы ультрафиолетового (УФ) облучения изменяют статус фосфорилирования РНК полимеразы II и снижает уровень транскрипции генов (Muoz et al., 2009). Осмотический шок может регулировать сплайсинг путем изменения локализации hnRNP A1 (heterogenenous nuclear ribonucleoprotein A1), фактора, участвующего в ремоделирование хроматина (van der Houven van Oordt et al., 2000). 3.1.2 Регуляция трансляции при стрессе Целый ряд исследований, оценивающих включение радиоактивно меченых аминокислот в de novo синтезируемые полипептидные цепи, позволили наглядно продемонстрировать ингибирование процесса биосинтеза белка при воздействии различных форм стресса (Bouche et al., 1979; Lindquist, 1980). Основным путем, по которому в клетке происходит ингибирование трансляции при стрессе, является фосфорилирование фактора инициации eIF2 (Wek et al., 2006; Sonenberg and Hinnebusch, 2009). Данный механизм может быть запущен пятью различными протеинкиназами: 1) PKR (protein kinase R) при вирусной инфекции, ТШ и воздействии УФ-облучения; 2) PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase) при стрессе эндоплазматического ретикулума (ЭР); 3) GCN2 (general control nonderepressible 2) при аминокислотном голодании; 4) HRI (heme-regulated eIF2 kinase) при окислительном стрессе; а также 5) Z-DNA киназы в ходе антивирусной реакции (Anderson and Kedersha, 2008). Дополнительно стресс может приводить к инактивации белка mTOR (mammalian target of rapamycin), протеинкиназы, которая в норме фосфорилирует eIF4E и стимулирует инициацию трансляции (Sonenberg and Hinnebusch, 2009; Sengupta et al.,2010).
Остановка трансляции стимулирует образование специальных внутриклеточных структур, называемых стресс-гранулами (от англ. stress granules) (Anderson and Kedersha, 2008). В формировании стресс-гранул у млекопитающих участвует РНК-связывающий белок TIA1 (T-cell-restricted intracellular antigen 1) (Gilks et al., 2004; Kedersha et al., 2005). Благодаря прионоподобным свойствам, TIA1 может формировать агрегаты, устойчивые к действию протеолитических ферментов. Стресс-индуцированное фосфорилирование eIF2 и последующее ингибирование трансляции происходит, по-видимому, в результате конкуренции между TIA1 и комплексом eIF2-ГТФ-тРНКiMet за место посадки на рибосоме. В итоге мРНК совместно с 40S рибосомальной субъединицей, а также множеством РНК-связывающих белков и компонентов аппарата трансляции, таких как eIF4G и поли(А)-связывающий белок PABP (poly(A)-binding protein), попадают в состав стресс-гранул, образованных агрегатами TIA1 (Gilks et al., 2004; Anderson and Kedersha, 2008). Таким образом, комплекс инициации трансляции в стресс-гранулах на время стрессового воздействия сохраняется в частично собранном виде, что способствует скорейшему возобновлению трансляции после прекращения стресса.
При стрессе происходит нарушение фолдинга белков и их агрегация, в том числе в просвете ЭР. При стрессе ЭР приводится в действие сложный механизм для сохранения внутриклеточного гомеостаза, известный как “ответ на мисфолдинг” (от англ. unfolded protein response, UPR) (Дедов и др. 2012). С биохимической точки зрения, UPR представляет собой комплекс разнообразных, но тесно взаимосвязанных сигнальных путей, объединенных общим пусковым механизмом. Этот механизм реализуется тремя основными сигнальными белками - PERK, IRE1 и ATF6, каждый из которых имеет регуляторный домен, погруженный в просвет ЭР. В нормальных физиологических условиях этот домен связан шапероном BiP (binding immunoglobulin protein), также известным как GRP-78 (78 kDa glucose-regulated protein). При воздействии стресса нагрузка на аппарат ЭР увеличивается и BiP высвобождается, благодаря более высокой аффинности к несвернутым полипептидным цепям. Таким образом, происходит освобождение PERK, IRE1 и ATF6 от связи с BiP и активация UPR (Дедов и др. 2012; Зверев и Брюханов, 2012).
PERK является серин/треониновой киназой, которая фосфорилирует eIF2 и ингибирует биосинтез белка в клетке. Кроме того, PERK стимулирует транскрипцию шаперонов ЭР путем привлечения фактора ATF4 (activating transcription factor 4), также участвующего в активации транскрипции генов антиоксидантной защиты (Ron and Walter, 2007).
Клонирование и секвенирование библиотек коротких РНК
Система генов ТШ очень быстро реагирует на стрессовые воздействия и в ходе эволюции приобрела множество свойств, благодаря которым геном при ТШ преобразуется в “фабрику” по производству Hsp. Одной из основных характеристик генов hsp (как и всех «стрессовых» генов) является их высокая эволюционная консервативность (Lindquist and Craig, 1988; Akerfelt et al., 2010). В этом плане они напоминают многие гены “домашнего хозяйства” клетки, например, гистоновые гены или гены рибосомальных белков. Так, гены hsp70 млекопитающих и E. coli имеют 50% гомологию по всей длине кодирующей последовательности. Гомология между генами hsp70 человека и D. melanogaster составляет 73%. Другая характерная особенность – мультикопийность hsp, наиболее характерная для генов, кодирующих Hsp70, низкомолекулярных Hsp и Hsp40 (Lindquist and Craig, 1988; Akerfelt et al., 2010). Например, геном D. melanogaster имеет 5 или 6 (в зависимости от линии) генов hsp70, расположенных в двух геномных кластерах 87A и 87B на хромосоме 3R (Evgen ev et al., 2013). Важно отметить, что гомология hsp70 в обоих кластерах составляет более 96%. Другой важной структурно-функциональной характеристикой генов hsp, в частности hsp70, является отсутствие экзон-интронной структуры, свойственной большинству генов эукариот (Lindquist and Craig, 1988). Это позволяет транскрибируемым мРНК быстро поступать из ядра в цитоплазму, минуя стадию сплайсинга, что ускоряет выработку Hsp70 в ответ на стресс. Исключениями являются гены hsp90, имеющие один интрон, гены hsp60, hsp10 и гены hsp70 у C. elegans (Lindquist and Craig, 1988; Heschl and Baillie, 1990; Hansen et al., 2003).
Каждый организм обладает модификационной (фенотипической) изменчивостью, т.е. способностью одного генотипа производить альтернативные варианты морфологии, физиологического состояния или поведения в ответ на внешнее воздействие (Свердлов, 2009). Любая конкретная вариация фенотипа развивается на основе определенной траектории морфогенеза, входящей в норму реакции данного генотипа (Иорданский, 2009). Согласно современному представлению генетическая канализированность обеспечивает устойчивость процессов развития организма к эффектам модификационной изменчивости. Это подразумевает существование определенных “буферных” систем, препятствующих проявлению фенотипической изменчивости (Scharloo, 1991). Множество данных указывает на важнейшую роль Hsp в этом процессе (Angelier et al., 1996; Rutherford and Lindquist, 1998; Luft and Dix, 1999). Показано, что мутация Hsp90 (Hsp83 у дрозофилы), а также действие специфического ингибитора Hsp90 гелданамицина приводит к возникновению широкого спектра морфологических нарушений у D. melanogaster (Rutherford and Lindquist, 1998). Так как Hsp90 является шапероном, ассоциированным с функционированием ряда факторов, участвующих в передаче сигнала, было высказано предположение, что функциональная недостаточность Hsp90 на ранних стадиях онтогенеза приводит к изменению траекторий морфологического развития и появлению новых фенотипов, которые не проявляется при нормальном функционировании Hsp90. Причем данный эффект наблюдался как на лабораторных линиях, так и на дрозофилах, пойманных в дикой природе (Rutherford and Lindquist, 1998). Роль Hsp90 как супрессора фенотипической изменчивости также продемонстрирована у A.thaliana (Queitsch et al., 2002). Примечательно, измененный фенотип может наследоваться будущими поколениями (Rutherford and Lindquist, 1998; Queitsch et al., 2002; Sollars et al., 2003). Таким образом, Hsp90 играет роль “эволюционного конденсатора”, позволяющего нейтрализовать многочисленные варианты развития, входящие в норму реакции генома при нормальных физиологических условиях, а при стрессе выборочно допускать их фенотипическое проявление (Rutherford and Lindquist, 1998; Carey et al., 2006).
В работе Sollars и соавт. впервые было высказано предположение об эпигенетическом механизме действия Hsp90, поскольку сниженная активность Hsp90 приводила к наследованию измененного состояния хроматина (Sollars et al., 2003). При мутации Hsp90 ученые наблюдали эктопическую экспрессию гена wingless в глазных имагинальных дисках и развитие аномальной морфологии глаза, соответственно. Причем, измененный фенотип эпигенетически наследовался следующим поколением даже, несмотря, на восстановление функции Hsp90 (Sollars et al., 2003). Позже было установлено, что Hsp90 участвует в биогенезе пиРНК - одного из мощнейших инструментов контроля активности мобильных генетических элементов (МЭ) в герминальной ткани животных (подробно биогенез пиРНК рассмотрен в главе 3.2.4) (Specchia et al. 2010). Нарушение физиологической функции Hsp90 приводит к сильному снижению экспрессии пиРНК, и, как следствие, к дерепрессии МЭ и увеличению частоты их транспозиций (Specchia et al. 2010; Gangaraju et al. 2011).
Важно отметить, что роль hsp в обеспечение устойчивости процессов развития не ограничена одним hsp90. Так, недавно продемонстрирована вовлеченность остальных hsp (hsp22, hsp67 и hsp70) в процессы морфогенеза и устойчивого развития (Takahashi et al., 2010; Takahashi et al., 2011; Gong and Golic, 2006). Эти данные позволяют рассматривать hsp не только как элементы “буферной” системы, необходимые при развитии организма, но и как агенты, обеспечивающие стабильность генома.
Функциональный анализ мишеней термочувствительных миРНК
Последствия стресса на физиологию клетки можно рассматривать как вектор развития патологического процесса. Известно, что сердечно-сосудистые заболевания, а также многие хронические патологии практически всегда сопровождаются нарушением фолдинга белков, одной из главных причин которого является стрессовое воздействие (Minamino et al, 2010). Следует также отметить, что генетические мутации являются факторами риска развития нейродегенеративных заболеваний, но не определяют наличие болезни (Armstrong, 2013). Стимулом к развитию нейродегенеративных процессов могут являться воздействия стрессовых факторов, приводящие к нарушению функционирования генома.
Взаимосвязь между миРНК и нейродегенеративными заболеваниями была обнаружена при изучении влияния нарушений биогенеза миРНК на развитие нервных клеток (Abe and Bonini, 2012). Было показано, что недостаток функции dicer в эмбриональных стволовых клетках снижает способность клеток к дифференцировке в дофаминергические нейроны среднего мозга; истощение популяции данных клеток является одной из главных особенностей болезни Паркинсона (Kim et al., 2007). Дисфункция Dicer в двигательных нейронах спинного мозга имитирует клинические и патологические особенности бокового амиотрофического склероза (БАС) (Haramati et al., 2010). Индивидуально миРНК также оказывают эффект на развитие БАС, в частности, на мышиных моделях показано, что недостаток активности miR-206 ускоряет развитие заболевания (Williams et al., 2009). Также установлено, что miR-29a/b и miR-107 регулируют экспрессию гена BACE1 (Beta-site APP-cleaving enzyme 1), играющего ключевую роль в образовании Ab пептидов при болезни Альцгеймера (Abe and Bonini, 2012).
Важность миРНК для функционирования клеток и тканей проявляется еще и в том, что нарушение их экспрессии может приводить к малигнизации клеток. миРНК, вовлеченные в канцерогенез, выделяют в группу так называемых “онкомиров”, изучение которых представляет целое направление в исследовании канцерогенеза (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). Подробный анализ всех нарушений образования и функционирования миРНК в опухолевых клетках выходит за рамки данного обзора, поэтому остановимся лишь на перечислении основных типов нарушения экспрессии миРНК в опухолях.
Мутации в структуре гена миРНК или ее предшественника может приводить к снижению эффективности процессинга зрелой молекулы, а также к дисфункции данной миРНК (Рязанский и Гвоздев, 2008; Киселев, 2014). Снижение активности миРНК в опухолях может являться результатом эпигенетического выключения транскрипции локуса миРНК вследствие метилирования ДНК или пост-трансляционной модификации гистонов (Рязанский и Гвоздев, 2008; Киселев, 2014). Например, в норме miR-15a и miR-16-1 подавляют экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-2 (Cimmino et al., 2005). Экспрессия данных миРНК при В-клеточном хроническом лимфолейкозе снижается в 68% случаях и сопровождается повышением экспрессии Bcl-2 (Calin et al., 2002; Snchez-Beato et al., 2003). В некоторых случаях у больных хроническим лимфолейкозом кластер miR-15а-16, локализованный на хромосоме 13q14, вообще, может быть делетирован (Calin et al., 2002). В клетках опухолей также может происходить геномная амплификация или транслокация локуса миРНК с последующей активацией его транскрипции, вследствие чего усиливается репрессия опухолевого супрессора – мишени данной миРНК (Рязанский и Гвоздев, 2008; Киселев, 2014). Классическим примером является гиперэкспрессия кластера mir-17 92, наблюдающаяся в различных В-клеточных лимфомах и некоторых других опухолях (He et al., 2005). Таким образом, в зависимости от того, экспрессию какого гена подавляют миРНК, они могут выполнять функции, как онкогена, так и супрессора опухолевого роста (Рязанский и Гвоздев, 2008; Киселев, 2014).
Одним из наиболее чувствительных к действию стресса белков является p53, белок-супрессор опухолевого роста (Wang et al., 2015). При повреждении ДНК p53 запускает транскрипцию при-миРНК семейства miR-34 (miR-34a, miR-34b и miR-34c) из различных геномных локусов. Впоследствии данные миРНК репрессируют ряд общих мишеней, способствуя остановки клеточного деления и апоптозу (Hermeking, 2007). Кроме того, p53, связываясь с белком DDX5 (DEAD-box RNA helicase p68), который является кофактором Drosha, стимулирует процессинг miR-16, miR-103, miR-143, miR-145, miR-26a и miR-206 в раковых клетках и снижает скорость их пролиферации (Suzuki et al., 2009). Примечательно, что большинство мутаций p53 в раковых клетках находятся в домене, участвующем в процессинге миРНК, а также отвечающем за транскрипционную активность белка (Suzuki et al., 2009). Следует отметить, что экспрессия самого p53 у человека регулируется множеством миРНК (Liao et al., 2014). Например, miR-122, miR-29, а также miR-18b стимулируют активность p53, тогда как miR-125b, miR-33, miR-30, miR-1285, miR-150, miR-138, miR-214 и miR-374 ингибируют экспрессию p53, напрямую связываясь с 3 -НТО его мРНК (Liao et al., 2014). При повреждении ДНК миРНК-опосредованная репрессия p53, по-видимому, ослабевает, однако подробно механизм данной регуляции не изучен. Таким образом, p53 является важным регулятором экспрессии миРНК, недостаток которого ведет к нарушению баланса между миРНК и их генами-мишенями и может стимулировать опухолевый рост. миРНК играют важную роль в регуляции стресса ЭР, оптимизируя уровни экспрессии ключевых белков, участвующих в UPR. Например, miR-30c-2 репрессируют трансляцию XBP1s (Byrd et al., 2012). Примечательно, что уровень miR-30c-2 повышается при стрессе ЭР наряду с XBP1s, свидетельствуя о том, что miR-30c-2 может влиять на уровень XBP1s в ходе развития UPR (Duan et al., 2012). Дополнительным отрицательным регулятором экспрессии XBP1 является miR-214 (Duan et al., 2012). Существует взаимосвязь между активацией UPR и увеличением скорости роста опухолевых клеток при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК), а также резистентностью клеток к апоптозу (Shuda et al., 2003; Byrd and Brewer, 2013). Примечательно, что при ГЦК, уровень экспрессии miR-214 снижаются при стрессе ЭР (Duan et al., 2012). Таким образом, miR-214-опосредованная репрессия XBP1 эффективней осуществляется до активации UPR.
Фактор XBP1s стимулирует повышение уровня экспрессии miR-346 при стрессе ЭР (Bartoszewski et al., 2011). Установлено, что мРНК гена TAP1, необходимого для формирования комплекса MHC I класса (главной комплекс гистосовместимости I класса) с пептидами для последующей презентации антигена, является прямой мишенью miR-346 (Bartoszewski et al., 2011; Lankat-Buttgereit and Tampe, 2002). Исходя из того, что ассоциация молекул комплекса MHC I класса с пептидами нарушается при стрессе ЭР, можно предположить, что miR-346, активируемый XBP1s, репрессирует TAP1 и подавляет сборку комплекса MHC I класса. Таким образом, способствуя активации UPR (Byrd and Brewer, 2013; Granados et al., 2009).