Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
Прямые методы определения анеуплоидий плода. 13
Инвазивный забор материала для исследования 13
Использование циркулирующих клеток плода в кровотоке матери. 14
Непрямые методы скрининга анеуплоидий 15
Скрининг второго триместра 15
Скрининг первого триместра 16
Использование внеклеточной ДНК для определения наличия анеуплоидий 18
Цифровая ПЦР 19
Полногеномное секвенирование 20
Таргетное секвенирование 25
Алгоритмы анализа данных, используемые при полногеномном секвенировании внеклеточной ДНК. 26
Методы GC-коррекции. 30
Локальная линейная регрессия (LOESS) 30
Весовые коэффициенты для отдельных ридов 31
Весовые коэффициенты для фрагментов фиксированной длины. 31
Биологические ограничение НИПC 31
Клинические испытания и применение неинвазивного пренатального скрининга. 34
Определение риска наличия анеуплоидий по половым хромосомам. 36
Определение риска наличия редких анеуплоидий. 37
Доступные решения для НИПС 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
Материалы 39
Характеристика пациенток. 40
Ретроспективная группа 40
Проспективная группа 40
Забор крови и отделение плазмы 41
Выделение свободноциркулирующей ДНК 41
Проведение ПЦР 42
Приготовление библиотек для секвенирования 42
Библиотеки для секвенирования свободноциркулирующая ДНК 42
Библиотеки для таргетного секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов 43
Первичная обработка данных секвенирования. 44
Определение хромосомного статуса плода и матери 49
Использование программных пакетов для анализа данных 49
Глава 3 Результаты и выводы 49
Определение наличия анеуплоидий. 49
Выбор метода определения наличия анеуплоидий по покрытию внутри образца 51
Фильтрация ПЦР дупликатов. 53
Фильтрация неуникальных участков генома. 56
Фильтрация по качеству выравнивания . 58
GC-коррекция 61
Локальная линейная регрессия : 63
Локальная линейная регрессия с использованием весовой функции 63
Весовые коэффициенты 63
Результаты сравнения различных способов GC-коррекции. 64
Определение оптимального размера фрагмента в разбиении генома 69
Определение предела детекции и и минимально необходимого для анализа количества прочтений 70
Результаты валидации 78
Определение материнского и плодового происхождения анеуплоидий 81
Разработка способа определения доли плодовой ДНК 88
Выбор однонуклеотидных полиморфизмов 89
Оценка частоты встречаемости полиморфизмов в российской популяции. 89
Определение доли плодовой ДНК 96
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы 101
- Полногеномное секвенирование
- Фильтрация по качеству выравнивания
- Определение предела детекции и и минимально необходимого для анализа количества прочтений
- Определение материнского и плодового происхождения анеуплоидий
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хромосомные анеуплоидии (ХА) являются частой причиной перинатальной смертности и детской инвалидности. Они являются причиной до 30% неразвивающихся беременностей. У новорожденных ХА встречаются с частотой до 1:300. Чаще всего встречаются трисомии по 21, 18, 13 хромосомам и нарушения числа копий половых хромосомам. Риск наличия у плода анеуплоидий существенно возрастает с возрастом матери.
В настоящее время в России для своевременного обнаружения анеуплоидий-плода проводится комбинированный скрининг, который основывается на результатах УЗИ и биохимических показателях в 1 триместре беременности, что позволяет сформировать группу риска. Скрининг основан на косвенных маркерах и имеет ограничение по чувствительности и специфичности, поскольку колебания биохимических показателей зависят не только от хромосомного статуса плода, но и от гормонального фона беременной женщины и ряда других факторов. Наличие анеуплоидий подтверждается примерно в 1 из 8 случаев высокого риска, по данным скрининга. Для установки хромосомного статуса плода требуется проведение подтверждающей диагностики, сопряженной с взятием материала инвазивными методами (биопсия хориона, амниоцентез или кордоцентез), что может привести к потере беременности в 0,5-2% случаев, а в некоторых случаях противопоказано.
Таким образом, разработка неинвазивных методов оценки генетического статуса плода, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью представляет научный и практический интерес.
Цели и задачи работы
Цель работы заключалась в разработке метода анализа данных высокопроизводительного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови, позволяющего детектировать анеуплоидии плода по крови беременной женщины. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
Выбор статистических методов и критериев для определения анеуплоидий плода по данным высокопроизводительного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины.
Разработка алгоритма анализа данных высокопроизводительного секвенирования, позволяющего определять риск наличия анеуплоидии у плода.
Подбор оптимальных параметров для определения наличия анеуплоидий плода.
Проведение валидации метода на выборке образцов с известным хромосомным статусом плода
Определение особенностей применения метода для различных клинических ситуаций.
Разработка независимого от пола плода метода оценки доли плодовой ДНК.
Разработка метода определения происхождения анеуплоидных клеток (материнское или плодовое).
Научная новизна и практическая значимость
Впервые предложен алгоритм определения риска наличия анеуплоидий с одновременным использованием 2-х статистических критериев, позволяющий увеличить точность скрининга.
Впервые разработана методика определения источника анеуплоидных клеток - мать или плод, позволяющая избежать ложноположительных результатов, связанных с особенностями кариотипа матери.
Разработан оригинальный алгоритм анализа данных высокопроизводительного секвенирования для о пр еделения хромосомного статуса плода по внеклеточно й ДНК плазмы крови беременных женщин. Проведена его валидация на контрольной выборке из 271 образца с известным хромосомным статусом плода и, в рамках проспективного исследования, на выборке из 640 образцов с известными исходами беременности. Определены технические (доля плодовой ДНК) и биологические (материнские анеуплоидии, состояния после трансплантации, мозаицизм плода и плаценты) ограничения метода.
Разработана панель однонуклеотидных полиморфизмов для определения доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода с использованием таргетного секвенирования с учетом частоты встречаемости в российской популяции.
В р ам ках апробации по лучен первичный опыт практического при менения неинвази вного пренатального ДНК-скрининга в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова.
Положения, выносимые на защиту
Разработан алгоритм анализа данных высокопроизводительного секвенирования,
позволяющий определять наличие ане уплоидий у п лода по плазме крови беременной
женщины. Алгоритм валидирован на выборке из 906 образцов, показаны чувствительность
98% и специфичность 99%.
Предложен метод определения происхождения анеуплоидных клеток (материнское или
плодовое), который позволяет значительно снизить количество ложноположительных
результатов.
Разработан метод оценки доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода, основанный
на таргетном секвенировании панели однонуклеотидных полиморфизмов с высокой
степенью гетерозиготности.
Апробация результатов
Результаты работы были представлены на 2 российских и 3 международных конференциях.
Внедрение результатов исследования в практику
На основании проведенных исследований разработаны стандартные операционные процедуры и лабораторный регламент. Разработано программное обеспечение «НИПС» для автоматического проведения анализа данных.
Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отдела клинической и молекулярной генетики в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова. Опубликованы методические рекомендации по применению НИПС, утвержденные обществом акушеров гинекологов.
Получен патент:
Тест-система для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования (RU2636618C1)
Подана заявка на патент:
Способ определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины (заявка на патент RU2016152686A)
Личное участие автора в получении научных результатов
Соискатель принимала непосредственное участие в планировании работы, проведении анализа данных высокопроизводительного секвенирования, подготовке публикаций по результатам исследования. В ходе работы автором был предложен и валидирован алгоритм анализа данных, выбраны оптимальные параметры для каждого из этапов анализа, проведена статистическая обработка данных, подобраны и проверены праймерные пары для выявления ключевых SNP. Подготовлены 2 заявки на патенты. При выполнении работы автор продемонстрировал способность самостоятельно проводить исследования, анализировать и представлять данные.
Публикации
По матери алам рабо ты было опубликовано 7 ст атей в р ецензир уемых на учны х жур на ла х, входящих в список ВАК, 5 тезисов докладов в сборниках трудов конференций и 2 патента.
Структура и объем работы
Полногеномное секвенирование
С появлением и удешевлением методов высокопроизводительного секвенирования большинство исследовательских групп переключилось на разработку методов, основанных на применении высокопроизводительного секвенирования. В отличие от цифровой ПЦР секвенирование не требует априорных знаний об исследуемых последовательностях и позволяет использовать информацию от всех последовательностей ДНК, находящихся в плазме. Первым из использованных методов скрининга анеуплоидий, является прямой подход, основанный на секвенировании всей внеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины с последующим биоинформационным анализом данных [24], [33].
Общая схема, иллюстрирующая этот подход приведена на рисунке 2. Он основан на подсчете секвенированных фрагментов (ридов), которые можно однозначно отнести к одной из хромосом. И сравнении доли фрагментов приходящихся на каждую из хромосом с теми же данными для референсного набора хромосом [37]. При доле плодовой ДНК среди всей ДНК 5%, при трисомии мы увидим увеличение покрытия соответствующей хромосомы на 2.5%. Разбросы доли фрагментов, приходящихся на каждую хромосому для референсных образцов, зависят от хромосомы и ее GC состава (рисунок 3). У 13, 18 и 21 хромосом, для которых наиболее часто наблюдаются трисомии, наблюдается относительно небольшой разброс в значениях покрытия, что позволяет использовать такой подход для определения частых анеуплоидий [33].
Вне зависимости от используемой платформы для секвенирования приготовление библиотек для последующего секвенирования включает в себя этап лигирования адаптеров, предварительного разрушения ДНК не требуется, поскольку свободноциркулирующая ДНК в плазме уже находится в сильно фрагментированном состоянии [18], [24], [34]. Последующую амплификацию ДНК для достижения необходимого для секвенирования количества материала, обычно изначального количества ДНК оказывается недостаточно. И клональную амплификацию ДНК на микросферах/твердой подложке, для получения достаточного сигнала от каждой молекулы [79]. Опубликованы работы, показывающие применимость основных платформ высокопроизводительного секвенирования для неинвазивного пренатального скрининга [24], [33], [105], [53].
Анализ данных обычно состоит из следующих этапов:
Картирование ридов на референсный геном. Обычно из анализа исключаются неуникальные участки генома и участки с вариабельным числом копий.
Подсчет покрытия хромосом\ участков хромосом.
Коррекция покрытия генома с учетом GC состава. Эффективность различных этапов приготовления библиотек для высокопроизводительного секвенирования и самого секвенирования может зависеть от GC состава фрагментов ДНК. В результате возникает значительное искажение величины покрытия в зависимости от GC состава участка хромосомы. Для того чтобы уменьшить вариабельность данных связанных с этим эффектом применяются статистические модели, позволяющие скорректировать полученное покрытие с учетом GC состава фрагмента [89], [13]. Обычно используется локальная регрессионная модель LOESS [53], [103].
Анализ наличия анеуплоидий. Для определения хромосомного статуса плода используются различные статистические методы для сравнения двух выборок и проверки гипотезы о принадлежности значения (Z-score) [24], [53] или совокупности значений (T-score) [105] данной выборке. В качестве референсных, могут использоваться значения покрытия для нормальных образцов [24], для других аутосом внутри образца [105], так же был опубликован подход основанный на поиске на основании выборки референсных образцов наименее вариабельных участков внутри образцов, и последующем нормировании внутри каждого образца на эти участки [87].
Помимо простого подсчета количества фрагментов приходящихся на каждую из хромосом, при секвенировании достаточно длинных фрагментов ДНК или использовании парно-концевых (pair-end) библиотек возможно дополнительно учитывать информацию о размере секвенированного фрагмента ДНК [104], [60]. Tsui и соавторы показали, что распределение длин материнской и плодовой ДНК имеет характерный вид и отличается между собой (рисунок 1) [94]. Длина плодовой ДНК несколько меньше материнской, полагают, что это связано с процессами, происходящими в результате апоптоза. Оценка распределения ридов по длинам, может использоваться для определения доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода [104], кроме того отбор для анализа более коротких ридов помогает увеличить эффективную долю плодовой ДНК и чувствительность метода [60].
Плюсами полногеномного подхода является то, что одновременно исследуется весь геном и теоретически возможно увидеть изменения числа копий любой хромосомы, а также отдельных участков хромосомы достаточно большой протяженности, обычно несколько миллионов п.н. [103], без дополнительных изменений в протоколе пробоподготовки. Иногда с использованием такого подхода удается обнаружить не стандартные анеуплоидии, которые могут являться следствием плацентарного мозаицизма [22] или начальных стадий онкологических заболеваний, которые нередко приводят к крупным хромосомным перестройкам [7].
К недостаткам можно отнести принципиальную невозможность определения триплоидии. Однако нарушения, к который приводят триплоидии не совместимы с жизнью и обычно видны при УЗ-исследовании.
Фильтрация по качеству выравнивания
Для оценки качества выравнивания прочитанных фрагментов на референсный геном используется параметр MAPQ. Теоретически MAPQ=-10log10Pr{wrong}, где Pr{wrong} вероятность того, что местоположение фрагмента определено неверно. То есть если значение MAPQ=20, то вероятность, что фрагмент выровнен правильно 99%. Алгоритм расчета MAPQ зависит от программы для выравнивания и опирается на сравнение параметров наилучшего выравнивания с предыдущими возможными выравниваниями по качеству.
Для выбора оптимального парметра фильтрации качества выравнивания были в одной и той же выборке образцов была проведена фильтрация фрагментов с качеством выравнивания 5, 10, 20 и проведен рассчет без фильтрации по этому параметру.
Фильтрация по качеству выравнивания с одной стороны исключает из рассмотрения фрагменты, в позиционировании которых есть сомнения, с другой стороны она уменьшает количество ридов, для которых проводится дальнейший анализ. На рисунке 10 приведена зависимость доли оставшихся ридов от параметра «качество выравнивания» (MAPQ) выбранного для фильтрации. При отборе фрагментов в качеством выравнивания 5 для дальнейшего анализа остается 94% фрагментов, при отборе фрагментов с качеством выравнивания 20 остается только 87%.
Поскольку уникальность участка хромосомы связана с качеством выравнивания фрагментов на этот участок, для оценки значимости параметра «качество выравнивания» были проведены рассчеты с предварительной фильтрацией неуникальных учатсков генома и без нее. Значения значения стандартного отклонения покрытия хромосом 13, 18 и 21 для референсных образцов приведены в таблице Х. Без предварительной фильтрации не уникальных фрагментов генома значения стандартного отклонения снижаются при увеличении минимально допустимого значения MAPQ до 10, при значении параметра MAPQ 20 значения стандартного отклонения увеличиваются. При наличии предварительной фильтрации не уникальных фрагментов генома фильтрация по качеству выравнивания имеет значительно меньшее влияние на значения стандартного отклонения, для 21 хромосомы минимальное значение стандартного отколнения достигаются при отсутствии фильтрации по качеству выравнивания и наличии фильтрации неуникальных фрагментов генома.
Результаты для значений Z и T приведены в таблице. Влияние фильтрации не уникальных фрагментов генома на значения Z не значительно, при это значение T по 21 хромосоме выше, когда фильтрация проводится. С учетом всех данных был выбран вариант с предварительной фильтрации не уникальных фрагментов и отбором фрагментов со значение параметра MAPQ 5.
Определение предела детекции и и минимально необходимого для анализа количества прочтений
Важным параметром данного теста является доля плодовой ДНК необходимая для надежной детекции анеуплоидии. При использовании значения Z для каждой хромосомы, параметром определяющим предел детекции является стандартное отклонение нормированного покрытия для референсных образцов. Предполагая, что значения стандартного отклонения нормированного покрытия для анеуплоидных образцов совпадает со значением стандартного отклонения для нормальных образцов, можно рассчитать вероятность ошибки второго рода (ложноотрицательного результата) для выбранной доли плодовой ДНК и заданного набора референсных образцов. Графическое представление распределения плотности вероятности для 13, 18 и 21 хромосом приведено на рисунке 19. Вероятность ложноотрицального результата определяется площадью под кривой левее вертикальной линии. С учетом значений стандартных отклонений полученных для размера фрагмента 1 млн п.н. при доле плодовой ДНК 4% вероятность ложноотрицательного результата по 21 хромосоме составляет 8,5%, а по 13 и 18 хромосомам менее 0,1%. С вероятностью ложноотрицательного результата менее 1% трисомию по 21 хромосоме возможно определить при доле плодовой ДНК не менее 5,5%, трисомию по 18 хромосоме при доле плодовой ДНК не менее 3,5%, а трисомию по 13 хромосоме при доле плодовой ДНК не менее 2,9%. Значения стандартного отклонения зависят от покрытия референсных образцов. При увеличении количества прочтений, приходящихся на образец, оно уменьшается (таблица 10), но при этом увеличивается необходимый объем секвенирования и стоимость проведения исследования. Покрытие референсных образцов в данном исследовании было не ниже 5 млн. прочтений/образец.
Nxi покрытие фрагмента i хромосомы Х для исследуемого образца, ЦХІ - среднее значение ХІ - стандартное отклонение покрытия фрагмента i хромосомы Х для набора референсных обрацов. uz - среднее значение Z для исследуемой хромосомы, l zaut - среднее значение Z для остальных аутосом, a2Zx -стандартное отклонение для исследуемой хромосомы, пх - количество неперекрывающихся фрагментов фиксированной длины на исследуемой хромосоме, ?2zaut - стандартное отклонение для остальных аутосом, паШ -количество неперекрывающихся фрагментов фиксированной длины для остальных аутосом для исследуемого образца.
Для достоверного определения наличия анеуплоидии значение Т должно быть выше критического значения для заданного уровня значимости. При р=0,001 Т 3,3.
Предположим, что доля плодовой ДНК равна и в образце имеется трисомия по одной из хромосом. В этом случае Nxi — \ІХІ « /2, а \iZx — l zaut 2—, где oxi среднее значение стандартного отклонения покрытия фрагмента i хромосомы Х для референсных образцов. Параметр дхі зависит от размера фрагмента в разбиении генома и его можно оценить из экспериментальных данных. aZx и JZaut - стандартные отклонения нормированного покрытия для исследуемой хромосомы и для остальных аутосом соответственно. Экспериментальные данные показали, что эти значение можно принять равными между собой oz . Они зависят от размера фрагмента в разбиении генома и количества прочитанных фрагментов. На рисунке 16 приведена зависимость стандартного отклонения нормировонного покрытия от количества прочтений для размера фрагмента 50 т.п.н.
Количество неперекрывающихся фрагментов фиксированной длины приходящихся на исследуемую хромосому и на остальные аутосомы зависит от исследуемой хромосомы, и от размера фрагмента в разбиении генома. Самой маленькой и сложной для детекции трисомии хромосомой по которой требуется наибольшая доля плодовой ДНК и наибольшее покрытие является 21 хромосома. Условие, при котором возможно определение наличия трисомии
Минимальная доля плодовой ДНК необходимая для достоверного определения наличия анеуплоидии линейно зависит от величины az.
Зависимость необходимого количества ридов от доли плодовой ДНК для разных хромосом представлена на рисунке 17.
При доле плодовой ДНК 4% для достоверного определения всех анеуплоидий, необходимо не менее 5 400 000 ридов. Как видно из рисунка достоверное определение риска наличия анеуплоидий возможно и при более низкой доле плодовой ДНК, но для этого необходимо значительно больший объем секвенирования. При доле плодовой ДНК 3% необходимо около 10 000 000 ридов, что почти в 2 раза больше, чем при 4 %. Вместо количества ридов для контроля качества может быть использована величина .
Минимальная доля плодовой ДНК необходимая для детекции анеуплоидии с помощью Z-score зависит от набора референсных образцов и для исследуемой выборки составила 5,5% для 21 хромосомы. Чтобы преодалеть это ограничение был предложен подход с использованием покрытия внутри образца, где референсная выборка в значительно меньшей степени ограничивает предел детекции, минимальная доля плодовой ДНК составляет 4% при покрытии 5 400 000 прочтений/образец, при необходимости детекции анеуплоидии с меньшей долей плодовой ДНК, возможно проведение большего объема секвенирования.
Несмотря на то, что метод с использованием Z-score обладает большим количеством ограничений, и меньшей требует большей доли плодовой ДНК для достоверной детекции анеуплоидий, предлагается одновременное использование обоих критериев, для дополнительного контроля качества процесса анализа данных.
Итоговый алгоритм анализа данных приведен на рисунке 18.
Определение материнского и плодового происхождения анеуплоидий
Как было показано выше материнские анеуплоидии были причиной 4 из 9 (44%) ложноположительных результатов теста. Определение материнской анеуплоидии в полной форме обычно не представляет сложности из-за аномально высокого изменения в покрытии хромосомы. Однако моносомии по Х хромосоме обычно наблюдаются в мозаичной форме, в таких случаях изменения в покрытии Х хромосмы могут быть сопоставимыми с анеуплоидиями плодового происхождения. Известно, что распределение длин плодовой и материнской ДНК отличаются между собой, причем фрагменты ДНК плодового происхождения обычно короче, чем материнского. Обычно размер фрагмента свободноциркулирующей ДНК не превышает 200 п.н. При этом возможная длина прочтения для полупроводникового достигает 400 п.н. Поскольку в процессе приготовления библиотек для секвенирования нет этапов разрушения внеклеточной ДНК и отбора по длине, можно предположить, что распределение прочтений по длине отражает реальные длины фрагментов. На рисунке приведено распределение ридов по длинам для одного из образцов, оно соответствует распределению приведенному на рисунке 4, который авторы получили путем секвенирования парно-концевых библиотек.
Для проверки гипотезы а том, что данные о длине прочитанного фрагмента могут быть использованы для определения происхождения анеуплоидии, был проведен эксперимент, в котором для 2-х образцов с моносомиями (3 и 7) проведен анализ данных с предварительным отбором для анализа фрагментов короче фиксированной длины (194 п.н., 192 п.н и т.д). Дальнейший анализ проводили согласно алгоритму представленному на рисунке 19. Долю плодовой ДНК для каждого фрагмента на Х хромосоме определяли по формуле: ffxi=2 (Nma– Nxi)/ Nma, где Nma – среднее покрытие фрагмента для аутосом, Nxi покрытие фрагмента на Х хромосоме. Долю плодовой ДНК для всей Х хромосомы считали как медиану значений для отдельных фрагментов: ffx=Me(ffxi)
Распределение значений доли плодовой ДНК для Х хромосомы при анализе фрагментов разной длины в исследуемых образцах приведена на рисунке. Видно, что при отборе для анализа фрагментов ДНК меньшей длины, для анеуплоидии плодового происхождения «эффективная» доля плодовой ДНК возрастает, если же анеуплоидия в исследуемом образце материнского происхождения, доля плодовой ДНК остается неизменной рисунок 9.
Учитывая эту информацию, для всех образцов с высоким риском моносомии по Х хромосоме по данным НИПС был проведен анализ с использованием всех секвенированных фрагментов и фрагментов короче 168 п.н. Все последующие этапы анализа были проводились одинаково. В обоих случаях рассчитывали значения доли плодовой ДНК для фрагментов длиной 1 Мб и для всей хромосомы.
Относительное изменение доли плодовой ДНК рассчитывали по формуле: f fSC f fCLll
д= Пх Ц , ffxsc - доля плодовой ДНК после фильтрации по длине; fff1 Jїх - доля плодовой ДНК с использованием всех прочитанных фрагментов.
Статистическую значимость полученных изменений определяли с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой на непрерывность. Результаты приведены в таблице. Данные по материскому кариотипу приведены только для образцов из проспективной группы, поскольку образцы крови пациенток из ретроспективной группы не были доступны для анализа.
Для всех образцов, в которых была подтверждена анеуплоидия материнского происхождения, не наблюдалось роста доли плодовой ДНК. Для 4 случаев при наличии роста доли плодовой ДНК изменения не были статистически значимыми. Во всех случаях исходная доля плодовой ДНК было ниже 5%. В 3 из 4 случаев результат был ложнополоижетльным, в 1 случае у ребенка наблюдалась низкая степень мозаицизма по Х хромосоме.
Сравнение изменения доли плодовой ДНК для подтвержденных и не подтвержденных результатов НИПС приведены на рисунке 23, изменение доли плодовой ДНК в случае ложноположительных результатов неинвазивного скрининга связанных с материнскими анеуплоидиями значительно отличается от изменения доли плодовой ДНК для истинно положительных результатов. По данным полученным в этом исследовании ложноположительные результаты, обусловленные материнским встречались с частотой 1/300, что значительно выше, чем частота 1/3300 приведенная исследователями из компании Natera [76]. Столь значительная разница может быть объяснена разным пределом детекции методов. В исследовании компании Natera не приведена информация о минимальной доле мозаицизма, которую можно детектировать с помощью их метода, однако доля мозаичных клеток, описанная в исследовании находится в диапазоне от 34% до 95%, что выше, чем доля анеуплоидных клеток описанная в данном исследовании от 10% до 28%. С другой стороны мозаичная моносомия по Х хромосоме наблюдается в 16% (3/19) случаев высокого риска моносомии по Х хромосоме, по данным НИПС, что сопоставимо с данными, полученными в исследовании Wang и соавт [100], в исследовании которых предел детекции анеуплоидных клеток был 5%. Сопоставить частоту встречаемости в популяции не возможно, поскольку такие данные не приводятся.
Алгоритм дополнительного анализа для случаев высокого риска моносомии по Х хромосоме по данным НИПС представлен на рисунке. Проведение дополнительного этапа анализа позволяет выявить случаи, когда результаты НИПС обусловлены особенностями кариотипа матери и увеличить положительное предсказательное значение исследования с 58% до 69%.