Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Сворачивание и агрегация белков .9
1.2. Структура амилоидных агрегатов и их функциональное значение 17
1.3. Кинетика амилоидообразования 23
1.4. Факторы, влияющие на амилоидную агрегацию 27
1.5. Сворачивание и агрегация апомиоглобина .31
ГЛАВА 2. Материалы и методы .39
2.1. Материалы 39
2.2. Биохимические методы
2.2.1. Экспрессия генов 40
2.2.2. Выделение и очистка белков 41
2.2.3. Белковый электрофорез
2.3. Физические методы исследования 43
2.4. Теоретические основы методов, применяемых для исследования белковой агрегации 48
2.4.1. Абсорбционная спектроскопия 48
2.4.2. Круговой дихроизм 50
2.4.3. Флуоресцентная спектроскопия .51
2.4.4. Дифракция рентгеновских лучей .53
2.4.5. Масс-спектрометрия .53
2.4.6. Электронная микроскопия .56
2.4.7. Электрофорез 56
2.4.8. Аналитическое ультрацентрифугирование 57
2.5. Методы, используемые при обсчете экспериментальных результатов 58
2.5.1. Расчет доли промежуточного и нативного состояний 58
2.5.2. Расчет погрешности экспериментально измеряемых параметров 60
Результаты и обсуждения .61
3.1. Характеристика агрегатов апомиоглобина 61
3.1.1. Экспрессия и выделение апомиоглобина и его мутантных форм .61
3.1.2. Выбор условий для исследования амилоидообразования .64
3.1.3. Характеристика агрегатов, формируемых мутантной формой апомиоглобина V10F при температуре 40С 70
3.2. Влияние аминокислотных замен в апомиоглобине на его способность к амилоидной агрегации .76
3.2.1. Исследование стабильности мутантных форм апомиоглобина 77
3.2.2. Исследование способности мутантных форм апомиоглобина формировать агрегаты .84
3.2.3. Исследование способности мутантных форм апомиоглобина формировать амилоиды 88
3.3. Определение участка апомиоглобина, образующего межмолекулярные взаимодействия в структуре амилоидов .93
3.4. Исследование кинетики амилоидной агрегации апомиоглобина
3.4.1. Стадии амилоидной агрегации апомиоглобина 100
3.4.2. Влияние аминокислотных замен на скорость амилоидной агрегации апомиоглобина .103
Заключение .109
Выводы 111
Список цитируемой литературы .
- Кинетика амилоидообразования
- Белковый электрофорез
- Экспрессия и выделение апомиоглобина и его мутантных форм
- Определение участка апомиоглобина, образующего межмолекулярные взаимодействия в структуре амилоидов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Для выполнения своей функции
белок должен приобрести уникальную пространственную структуру в процессе
сворачивания. Однако в клетке возможны условия, при которых белок не
способен свернуться в нативную конформацию. Это приводит к утрате им
функциональной активности и образованию белковых агрегатов,
разновидностью которых являются амилоиды. Амилоиды представляют собой
высокоупорядоченные фибриллярные агрегаты, содержащие кросс--
структуру. Формирование амилоидов в клетке приводит к развитию серьёзных заболеваний человека, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, диабет второго типа и других. К настоящему времени не разработано эффективных способов лечения амилоидных заболеваний. Поэтому изучение механизма формирования амилоидных фибрилл является одним из важных направлений современных исследований молекулярной биологии и медицины.
Степень разработанности научной проблемы. В ранних работах, посвященных изучению амилоидной агрегации, было показано, что для формирования амилоидов необходимо дестабилизировать нативное состояние белка. В результате большинство последующих исследований механизма амилоидообразования было проведено в денатурирующих условиях, при которых происходит разворачивание полипептидной цепи. Однако механизм агрегации структурированных белков в условиях клетки может в значительной степени отличаться от агрегации развернутой полипептидной цепи. Тем не менее, к настоящему времени агрегация белков из структурированного состояния остается недостаточно изученной, что не позволяет выявить общие закономерности амилоидообразования глобулярными белками в клетке.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было исследование механизма амилоидной агрегации глобулярного белка в условиях, близких к физиологическим.
В качестве модели для данной работы был выбран апомиоглобин кашалота, так как процесс сворачивания этого белка к настоящему времени подробно исследован.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать агрегаты, образуемые апомиоглобином дикого типа и его мутантными формами.
-
Исследовать влияние аминокислотных замен на способность апомиоглобина формировать амилоидные структуры.
-
Определить участок апомиоглобина, образующий межмолекулярные взаимодействия в структуре амилоидных агрегатов.
-
Исследовать влияние аминокислотных замен на скорость амилоидной агрегации апомиоглобина.
Методы исследования. Для получения и выделения апомиоглобина
дикого типа и его мутантных форм использовали следующие биохимические
методы: трансформация бактериальных клеток, экспрессия белков в клетках
Escherichia coli BL21(DЕ3), электрофорез в ПААГ и высокоэффективная
жидкостная хроматография. Исследование белковых агрегатов проводили с
применением методов нативного электрофореза, кругового дихроизма,
инфракрасной спектроскопии, поглощения конго красного, флуоресценции тиофлавина Т, аналитического ультрацентрифугирования, электронной микроскопии и дифракции рентгеновских лучей. Для определения участка белка, образующего межмолекулярные взаимодействия в структуре амилоидов, использовали метод ограниченного протеолиза агрегатов и последующий анализ полученных пептидов с применением масс-спектрометрии. Кинетику амилоидообразования исследовали методами флуоресценции тиофлавина Т, инфракрасной спектроскопии и электронной микроскопии.
Научная новизна работы. В диссертации впервые проведено исследование влияния аминокислотных замен на амилоидообразование -спирального белка в неденатурирующих условиях.
1. В работе показано, что апомиоглобин кашалота и его мутантные
формы образуют амилоиды при температуре 40С и рН 5,5.
2. Особенность данной работы заключается в исследовании
амилоидообразования, как частного случая агрегации белка. Поэтому в работе
было отдельно изучено влияние аминокислотных замен в апомиоглобине на его
способность к агрегации и на способность к формированию амилоидов. Такой
подход позволил обнаружить наличие двух различных путей агрегации
апомиоглобина в одних и тех же условиях растворителя.
3. С помощью методов ограниченного протеолиза и масс-спектрометрии
определены участки апомиоглобина, образующие межмолекулярные
взаимодействия в структуре амилоидов.
4. Исследованы стадии амилоидообразования апомиоглобина, а также
влияние аминокислотных замен на кинетику агрегации. Непрерывная
регистрация кинетических кривых агрегации позволила достоверно рассчитать
скорости двух стадий амилоидообразования апомиоглобина и определить
факторы, влияющие на первую и вторую видимые стадии агрегации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в данной работе, позволили на примере апомиоглобина обнаружить особенности амилоидной агрегации глобулярного белка в неденатурирующих условиях и определить факторы, влияющие как на способность белка формировать амилоиды, так и на скорость этого процесса. Получение такой информации представляет собой необходимый этап на пути выяснения причин развития амилоидных заболеваний и разработки подходов к их лечению.
Апробация результатов исследования. Основные положения
диссертации были представлены на международных и всероссийских
конференциях. Результаты диссертационной работы отражены в 26 печатных
работах, в том числе 7 статьях в рецензируемых отечественных и
международных научных журналах, среди которых журналы «Молекулярная
биология», «Биохимия», «Protein Science», «Biophysical Journal» и
«Macromolecular Symposia».
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждений, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работу иллюстрируют 32 рисунка и 4 таблицы. Объем диссертации составляет 134 страницы.
Кинетика амилоидообразования
Белки – это высокомолекулярные азотосодержащие органические вещества, молекулы которых построены из аминокислотных остатков. Все биологические процессы осуществляются при их непременном участии. Они служат регуляторами экспрессии генов, в качестве ферментов участвуют во всех стадиях биосинтеза полипептидов, полинуклеотидов, полисахаридов, липидов и других соединений, катализируют все метаболические процессы [Шульц, 1982].
В основе биологических процессов, их высокой эффективности и строгой избирательности лежат тонкие структурные соответствия взаимодействующих соединений, которые определяются спецификой пространственной организации и динамическими конформационными свойствами белковых молекул. Поэтому решение практически любой биологической проблемы неминуемо сталкивается с необходимостью изучения трехмерных структур белков.
Образование уникальной структуры белка происходит при биосинтезе in vivо в многокомпонентном окружении. В живой клетке белок синтезируется на рибосоме, причем сворачивание полипептидной цепи в ее нативную структуру идет либо котрансляционно, либо почти мгновенно после биосинтеза. Такие данные были получены при работе с люциферазой, блокирование биосинтеза которой немедленно прекращает выход активного белка, что свидетельствует о том, что уже синтезированных, но еще не свернувшихся цепей белка практически нет [Kolb, 1994].
Однако в экспериментах по наблюдению за образованием белковой структуры in vivо очень трудно увидеть структурные превращения полипептида на фоне клеточных процессов. Поэтому для выяснения механизма сворачивания полипептидной цепи необходимо проводить эксперименты in vitro. Анфинсеном было сделано уникальное открытие явления спонтанной ренатурации белков, которое заключается в том, что после денатурации белок способен к восстановлению своей пространственной структуры и функции in vitro [Anfinsen, 1973]. Это доказывает, что генетически детерминированной последовательности аминокислот достаточно для того, чтобы однозначно предопределить ее сворачивание в свойственную тому или иному белку третичную структуру, а шапероны и ферменты, участвующие в процессе сворачивания, не несут информации о пространственной структуре полипептидной цепи, а просто предохраняют от агрегации в насыщенном макромолекулярном окружении.
Еще одно фундаментальное открытие в области физики белка было сделано Приваловым, который показал, что тепловая денатурация малых белков и доменов больших белков происходит по принципу “всё-или-ничего”. Это означает, что при таком переходе в заметных количествах накапливаются только начальное и конечное состояния, а “полуденатурированных” состояний практически нет. В его работе было показано равенство “эффективной теплоты” плавления белка, которая соответствует количеству тепла, поглощенного одной независимой “единицей плавления”, и “калориметрической теплоты”, т.е. количеством тепла, поглощенным одной молекулой [Privalov, 1974]. Совпадение этих двух независимых величин показывает, что молекула плавится как единое целое. Однако конформационное состояние температурно-денатурированного белка при этом остается неисследованным.
Для детального исследования процесса сворачивания белков необходимо охарактеризовать структурные, кинетические и термодинамические свойства конформаций, доступных полипептидной цепи. К настоящему времени с помощью биофизических методов в комбинации с теоретическими исследованиями удалось изучить различные состояния белка, реализующиеся в процессе его сворачивания.
Развернутое состояние белка впервые было изучено Тэнфордом, который показал, что в высоких концентрациях денатурантов белок представляет собой неупорядоченный клубок. Это понятие охватывает множество конформаций, внутри которых нет специфических взаимодействий, а связи ориентированы случайным образом [Tanford, 1968; Kohn, 2004]. Значительно позже с помощью ЯМР было показано, что в развернутом состоянии некоторых белков даже в растворах с высокими концентрациями денатурантов присутствуют гидрофобные кластеры и элементы вторичной структуры, которые могут как нативоподобными, так и ненативными [Religa, 2005; Klein-Seetharaman, 2002; Logan, 1994]. Результаты экспериментальных и теоретических исследований говорят о том, что нативные контакты, которые присутствуют в развернутом состоянии, могут быть необходимы для сворачивания белка в нативное состояние [Lindorff-Larsen, 2005; Hoffmann, 2007; Jahn, 2008].
В процессе сворачивания большинства белков происходит формирование одного или нескольких промежуточных состояний, которые представляют собой компактные состояния белковой молекулы с частично сформированной нативной вторичной структурой, при этом третичные взаимодействия слабые или отсутствуют. Промежуточные состояния стабильны и соответствуют энергетическому минимуму, благодаря этому они могут накапливаться в процессе сворачивания [Brockwell, 2007; Baldwin, 1999]. Важным является вопрос о роли промежуточных состояний в процессе сворачивания белков. Показано, что наличие промежуточного состояния может привести к ускорению сворачивания белка благодаря тому, что фиксация частично свернутого состояния облегчает для полипептидной цепи поиск нативной конформации полипептидной цепью [Neuweiler, 2005]. Однако если промежуточному состоянию соответствует слишком глубокий энергетический минимум, то оно может выступать в качестве кинетической ловушки и замедлять процесс сворачивания, либо в определенных условиях приводить к агрегации [Brockwell, 2007; Jahn, 2005].
Белковый электрофорез
Белковый электрофорез проводили с использованием источника питания Эльф-8 (ДНК-технология, Россия) и камеры для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra System (Bio-rad, США).
Уровень экспрессии апомиоглобина в клетках E.coli, содержание белка в растворах после каждой стадии очистки, а также чистоту выделенного белка определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 15% полиакриламидном геле по стандартной методике [Laemmli, 1970].
Для сравнения способности мутантных форм апомиоглобина к агрегации проводили электрофорез в 9% полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Гели готовили по методике [Laemmli, 1970] со следующими модификациями. Электрофорез проводили при рН 5,5 без добавления SDS. В качестве электродного буфера, а также буфера для приготовления гелей использовали MES-буфер рН 5,5. Для приготовления буфера для образцов использовали краситель метиленовый зеленый, который заряжен положительно и используется при проведении электрофореза в кислой среде. В соответствии со стандартной методикой электрофорез проводят в щелочных условиях, при этом происходит движение отрицательно заряженных частиц к аноду. В отличие от этого, в процессе электрофореза в кислой среде наблюдается миграция положительных ионов к катоду. Поэтому перед проведением электрофореза при рН 5,5 осуществляли замену электродов на источнике питания относительно электродов на электрофоретической камере. Расчет интенсивности окраски полосы мономера проводили с помощью программы Total Lab.
Пептиды, присутствующие в растворе после протеолиза мономерного апомиоглобина и его агрегатов, визуализировали с помощью пептидного электрофореза в трис-трициновой системе согласно методике [Schagger, 2006]. Для оценки молекулярных весов полученных пептидов использовали маркеры молекулярных весов 2,5-17кДа (Sigma).
Коэффициенты экстинкции для апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм были рассчитаны по аминокислотной последовательности [Gill, 1989]. Коэффициент экстинкции был принят равным 0,88 для апомиоглобина дикого типа, а также мутантных форм V10A, V10F, E109F, L115A, L115F, M131A, V10AM131A; 0,56 для белков с заменами W14A и W14F; 0,95 для мутантного апомиоглобина E109Y и 1,21 для M131W.
Спектры поглощения конго красного регистрировали в диапазоне 400-600 нм. Концентрация белка составляла 0,1 мг/мл, концентрация красителя была равна 10 мкМ. Измерение проводили в кювете с длиной оптического пути 1 см при температуре 25С.
Для исследования способности апомиоглобина связывать гем, в раствор белка с концентрацией 0,15 мг/мл добавляли гемин в молярном соотношении 1/1 и измеряли спектр поглощения в диапазоне 350-450 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, Австралия). При измерении флуоресценции тиофлавина Т длина волны возбуждения составляла 450 нм. Регистрация спектров флуоресценции проводилась в диапазоне 460-600 нм при температуре 25С. Концентрация белка была равна 0,5 мг/мл, концентрация тиофлавина составляла 50 мкМ. Для измерений использовали кювету с длиной оптического пути 3мм.
Для исследования кинетики агрегации флуоресценцию тиофлавина Т регистрировали на длине волны 480 нм. Концентрация белка составляла 5 мг/мл, конечная концентрация тиофлавина Т была равна 500 мкМ, измерения проводили при температуре 40С в течение 8 часов с перемешиванием. Для измерений использовали кювету с длиной оптического пути 1 см.
Для измерения рассеяния света длина волны возбуждения составляла 600 нм, спектр регистрировали в диапазоне 590–610 нм, концентрация белка составляла 0,1 мг/мл. Измерения проводили в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Измерение кругового дихроизма (КД) проводили на спектрополяриметре Chirascan (Photophysics, Англия). Для измерений использовали кювету с длиной оптического пути 0,01 см, концентрация белка составляла 1 мг/мл. Молярная эллиптичность [] вычислялась по формуле:
Экспрессия и выделение апомиоглобина и его мутантных форм
Агрегацию апомиоглобина исследовали при концентрации белка 5 мг/мл, так как это максимальная концентрация белка, которой можно достигнуть при рН 5,5 для всех исследованных мутантных форм.
Эксперименты проводили в натрий-фосфатном буфере, так как он не содержит летучих компонент, и поэтому поддерживает рН постоянным в течение длительной инкубации раствора при повышении температуры, которое необходимо для амилоидной агрегации апомиоглобина.
Следующей задачей было определить температуру в диапазоне физиологической, при которой при рН 5,5 возможна амилоидная агрегация апомиоглобина. Для регистрации амилоидных агрегатов использовали флуоресцентный краситель тиофлавин Т, который специфически связывается с кросс--структурой. Через определенные интервалы времени инкубации белка при температурах 35С и 40С из раствора отбирали аликвоты, добавляли в раствор тиофлавин Т, и измеряли спектр его флуоресценции. На рисунке 6 представлены кинетические кривые связывания тиофлавина Т с белком дикого типа и мутантной формой V10F при двух исследованных температурах.
Из рисунка видно, что оба исследованных белка не формируют амилоиды при температуре 35С, тогда как при 40С белки образуют агрегаты, связывающие тиофлавин Т. Кинетические кривые не имеют лаг периода и выходят на плато примерно через 6 часов инкубации. Интенсивность флуоресценции тиофлавина растворов мутантной формы апомиоглобина значительно выше, чем белка дикого типа, что указывает на то, что аминокислотная замена V10F привела к повышению амилоидогенности апомиоглобина. Исходя их полученных результатов, для исследования амилоидообразования апомиоглобина была выбрана температура 40С.
Температура 40С является допустимой для клеток. Однако выбранные условия несколько отличаются от условий, которые обычно рассматриваются как физиологические (37С, рН 7). Поэтому было важно определить, действительно ли в данных условиях не происходит значительных структурных изменений в молекуле апомиоглобина, и белок сохраняет свою функциональную активность. Для ответа на этот вопрос мы исследовали способность апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм при рН 5,5 связывать гемин, который представляет собой аналог гема - простетической группы миоглобина. На рисунке 7 представлены спектры поглощения апомиоглобина дикого типа и его мутантной формы с заменой V10F при добавлении в раствор гемина. Появление пика поглощения в области Соре на длине волны 410 нм свидетельствует о том, что в данных условиях апомиоглобин связывает гемин, то есть сохраняет свою функциональную активность (Рисунок 7). Аналогичные результаты были получены для всех исследованных мутантных форм апомиоглобина.
Ранее было показано, что в широком диапазоне условий, в том числе и в нативных условиях, в растворах апомиоглобина присутствует некоторая доля низкомолекулярных агрегатов, вторичная структура которых близка к вторичной структуре мономерных молекул в конкретных условиях. Поэтому, несмотря на присутствие некоторого количества агрегатов в растворе, мы можем следить за конформационными перестройками белка при его денатурации и делать вывод о процессах сворачивания/разворачивания мономерного апомиоглобина [Chow, 2006]. Однако наличие низкомолекулярных агрегатов до инициации агрегации необходимо учитывать при исследовании процесса амилоидообразования. Для оценки молекулярного веса агрегатов, присутствующих в растворе при комнатной температуре, а также их доли от общего количества белка мы провели аналитическое ультрацентрифугирование растворов апомиоглобина дикого типа и мутантной формы V10F при рН 5,5. Данные были получены для растворов апомиоглобина с концентрацией белка 1,2 мг/мл, при которой проводится аналитическое ультрацентрифугирование.
На рисунке 8а,б представлены графики движения границы, которая перемещается вниз ячейки в процессе центрифугирования. На седиментограмме апомоглобина V10F четко видны две границы, что говорит о том, что в растворе присутствуют частицы разного молекулярного веса. Более быстрое движение границы раствора мутантной формы, позволяет сделать вывод о наличии в растворе частиц более высокого молекулярного веса по сравнению с раствором белка дикого типа. Из полученных седиментограмм с использованием программы SEDFIT были рассчитаны значения коэффициентов седиментации частиц, присутствующих в растворе (Рисунок 11в,г), а также их молекулярные массы (Рисунок 11д,е).
На графиках распределений по константам седиментации и молекулярным массам помимо основного пика, соответствующего мономеру, присутствуют дополнительные пики в области более высоких значений коэффициентов седиментации и молекулярных масс, что говорит о наличии в растворе некоторого количества агрегатов. Анализ площадей пиков показал, что лишь незначительная доля (3%) молекул белка дикого типа находятся в составе агрегатов, молекулярная масса большинства из которых соответствует пентамерам. Введение аминокислотной замены привело к увеличению агрегационной способности апомиоглобина: агрегаты V10F содержат от 5 до 15 мономерных молекул и составляют 10% от общего количества белка. Рисунок 8. Результаты аналитического ультрацентрифугирования для апомиоглобина дикого типа (а,в,д) и мутантной формы V10F (б,г,е): а, б) седиментограммы; в, г) распределения с(s), и д, е) с(Мr).
Определение участка апомиоглобина, образующего межмолекулярные взаимодействия в структуре амилоидов
Затем мы сравнили амилоидогенные участки апомиоглобина, определенные экспериментально, с участками, предсказанными с помощью теоретических алгоритмов, в частности алгоритма TANGO, который характеризуется высокой достоверностью предсказаний (Рисунок 26). В качестве амилоидогенных участков данный алгоритм выделяет наиболее гидрофобные области, содержащие наименьшее количество заряженных аминокислотных остатков [Fernandez-Escamilla, 2004]. Согласно алгоритму TANGO в апомиоглобине кашалота присутствуют три амилоидогенных участка, соответствующие A-, E- и G-спиралям. Из рисунка 26 видно, что определенные экспериментально амилоидогенные участки являются более протяженными, чем участки предсказанные теоретически. Разница в длине участков в несколько аминокислотных остатков может быть объяснена тем, что протеаза из-за стерических ограничений в ряде случаев не может расщепить пептидные связи в непосредственной близости к плотноупакованным участкам молекул. Тем не менее, теоретически предсказанные амилоидогенные участки апомиоглобина перекрываются с участками, определенными экспериментально. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что алгоритмы предсказания амилоидогенных участков по аминокислотной последовательности белка могут быть использованы для предсказания агрегации структурированных глобулярных белков.
Результаты, описанные ранее, указывают на то, что предшественником амилоидных агрегатов является промежуточное состояние белка (глава 3.2.2). A-, G- и H-спирали в этом состоянии апомиоглобина сохраняют нативоподобную топологию, тогда как участки, соответствующие B-, C-, D-, E- и F-спиралям нативного состояния нестабильны [Ptitsyn, 1995; Hughson, 1990; Eliezer, 2000]. Важный результат заключается в том, что хотя A- и G-спирали структурированы в условиях агрегации, они участвуют в формировании межмолекулярных взаимодействий и, вероятно, кросс--структуры амилоидных агрегатов. Можно предположить, что из-за высокой динамичности и отсутствия плотной упаковки в промежуточном состоянии апомиоглобина, в его спиралях могут происходить конформационные перестройки с формированием кросс--структуры амилоидов. Таким образом, в процессе амилоидной агрегации апомиоглобина межмолекулярные взаимодействия образуют наиболее гидрофобные участки белка вне зависимости от их структурированности в мономерном белке в условиях агрегации.
К настоящему времени большинство экспериментальных исследований амилоидообразования белков было проведено в денатурирующих условиях. Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение гидрофобности и уменьшение заряда в результате аминокислотных замен в амилоидогенных участках белка ускоряет образование фибрилл. На основании этих данных разработаны теоретические алгоритмы предсказания влияния аминокислотных замен на скорость амилоидоообразования белков из развернутого состояния с учетом аминокислотной последовательности и свойств аминокислотных остатков [Chiti, 2003; DuBay, 2004]. Однако механизм агрегации развернутой полипептидной цепи, в которой большинство остатков экспонированы на растворитель, может отличаться от агрегации в условиях клетки, где молекулы белка содержат выраженную вторичную и третичную структуру. Поэтому важно определить, какие факторы влияют на скорость амилоидообразования структурированными глобулярными белками. Для ответа на этот вопрос в работе были исследованы стадии амилоидной агрегации апомиоглобина, а также влияние аминокислотных замен на кинетику процесса агрегации.
Амилоидообразование – это сложный многостадийный процесс, в ходе которого происходят агрегация мономерных молекул и их конформационные перестройки. Поэтому чтобы сделать вывод о стадиях амилоидной агрегации апомиоглобина мы исследовали кинетику амилоидной агрегации рядом биофизических методов, что позволило проследить как за изменением вторичной структуры, так и за изменением морфологии агрегатов в процессе образования фибрилл.
Изменение вторичной структуры агрегатов в процессе амилоидообразования регистрировали методом инфракрасной спектроскопии. Растворы белка инкубировали при температуре 40С, через определенные интервалы времени отбирали аликвоты растворов и измеряли их инфракрасные спектры. По полученным результатам была построена зависимость отношения поглощения А1620/1650 см-1, которое несет информацию о содержании кросс--структуры в агрегатах (глава 3.2.3), от времени инкубации раствора (Рисунок 27а). Полученная кинетическая кривая не содержит лаг-периода и выходит на плато через 6 часов инкубации.
Помимо инфракрасной спектроскопии, для исследования кинетики амилоидной агрегации широко используется метод флуоресценции тиофлавина Т (ThT). Основное преимущество этого метода заключается в возможности регистрировать флуоресценцию непосредственно в процессе агрегации в кювете, благодаря чему можно получить непрерывные кинетические кривые и достаточно точно рассчитать константы скорости реакции. Кинетическая кривая флуоресценции тиофлавина Т в течение первых 6 часов инкубации мутантной формы апомиоглобина V10F представлена на рисунке 27б.