Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна результатов исследования 8
1.4. Практическая значимость 8
1.5. Апробация работы 9
1.6. Структура и объем работы 9
2. Обзор литературы 10
2.1. Депо-формы нуклеозидов и нуклеотидов как протвовирусные агенты 10
2.2. Применение «ProTide» - подхода к противовирусным нуклеозидным препаратам 14
2.3. Применение «ProTide» - подхода к ациклическим нуклеозидным соединениям 31
2.4. Фосфодиамидатные производные 41
2.5. Арилфосфорамидатные производные нуклеозидов как антимикобактериальные агенты 55
2.6. Примеры создания фосфорамидатных соединений 57
3. Материалы и методы 64
3.1. Методики к разделу 4.1 64
3.2. Методики к разделу 4.2 76
3.3. Методики к разделу 4.3 80
3.4. Методики к разделу 4.4 84
3.5. Методики к разделу 4.5.1 85
3.6. Методики к разделу 4.5.2.1 86
3.7. Методики к разделу 4.5.2.2 87
4. Результаты и обсуждение 89
4.1. Синтез нуклеозидных и нуклеотидных аналогов, содержащих дигидроксипропильный остаток 89
4.2. Фосфорамидатных производных ацикловира 98
4.3. Синтез фосфорамидатных производных ненасыщенных ациклических нуклеозидов 105
4.4. Химическая стабильность 109
4.5. Противовирусные свойства синтезированных соединений 111
4.5.1. Ациклические аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, содержащие дигидроксипропионовый остаток 111
4.5.2. Фосфорамидатные производные ACV 113
4.5.2.1.Исследования анти-HSV активности in vitro 113
4.5.2.2.Исследования анти-HIV активности in vitro и ex vivo 114
5. Выводы 117
6. Список литературы
- Научная новизна результатов исследования
- Применение «ProTide» - подхода к ациклическим нуклеозидным соединениям
- Арилфосфорамидатные производные нуклеозидов как антимикобактериальные агенты
- Синтез фосфорамидатных производных ненасыщенных ациклических нуклеозидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания, вызванные вирусными инфекциями, трудно поддаются лечению. При создании антивирусных препаратов необходимо учитывать их способность воздействовать на различные стадии развития вируса. Успех в создании таких препаратов напрямую зависит от накопленной информации о строении вируса и его жизненном цикле, а также от знаний о механизме действия, метаболизме и биодоступности будущего препарата.
Механизм действия антивирусного препарата нуклеозидной природы, как правило, заключается в проникновении в инфицированную клетку, трифосфорилировании клеточными киназами и последующей утилизации аналога нуклеозидтрифосфата вирусной ДНК- или РНК-полимеразой, что приводит к ингибированию либо ферментативной активности, либо роста цепи вирусной НК. Очень часто при создании таких препаратов сталкиваются с потерей их активности в клеточных культурах или in vivo, хотя при проведении испытаний на ферменте препарат ингибирует вирусную полимеразу при низких концентрациях. Потеря активности может быть обусловлена рядом факторов, таких как низкая биодоступность, плохое проникновение через клеточные мембраны, низкая эффективность фосфорилирования препарата клеточными киназами. Чтобы избежать негативного влияния этих факторов, была развита стратегия создания депо-форм препаратов, то есть таких их производных, которые после проникновения в клетку и ряда химических и/или ферментативных реакций приводили бы к образованию нуклеозидмонофосфата. Данный подход сокращает путь превращения аналога нуклеозида до соответствующего нуклеозидтрифосфата, а главное, позволяет избежать стадии первого фосфорилирования, которое, как правило, происходит с наименьшей эффективностью. Создание латентных форм нуклеотидов способствует повышению биодоступности, что позволяет снизить концентрацию вводимого препарата (зачастую обладающего значительной токсичностью), и, тем самым, уменьшает вероятность возникновении у вируса резистентности к данному препарату.
Цель работы заключалась в создании фосфонатов и фосфорамидатов ациклических производных пуриновых нуклеозидов, обладающих потенциальной антивирусной активностью против возбудителей социально-значимых заболеваний (СПИД, герпес и оспа).
В ходе настоящего исследования решались следующие задачи: 1) разработать схему синтеза оптически активных соединений с заведомо известной конфигурацией при С-2’ атоме углерода ((S)- и (R)-рядов) и синтезировать ряд нуклеозидных и нуклеотидных производных на базе полученных соединений; 2) разработать удобный способ получения
депо-форм ациклических пуриновых нуклеозидов; 3) исследовать химическую стабильность синтезированных ациклических нуклеотидных производных и 4) изучить противовирусные свойства и токсичность синтезированных соединений.
Научная новизна. Разработан подход, позволяющий получать оптически активные
соединения (S)- и (R)-рядов нуклеозидной и нуклеотидной природы с высокими выходами
из коммерчески доступных исходных веществ. Оптимизирована схема получения
фосфорамидатных производных ACV, позволяющая получать целевые соединения с
удовлетворительными выходами. Разработаны методы синтеза ациклических
ненасыщенных нуклеозидов у которых двойная связь сопряжена с нуклеиновым основанием (аденином или гуанином) и синтезированы их фосфорамидатные аналоги. В рамках выполнения работы было синтезировано и охарактеризовано 29 новых соединений, а также проведены испытания их противовирусной активности.
Практическая значимость. Полученные в данной работе результаты открывают возможности для создания в будущем новых лекарственных препаратов против социально-значимых заболеваний, в том числе СПИДа, герпеса и оспы. Кроме этого полученные данные позволяют по-новому оценить применение широко известного противогерпетического препарата ACV.
Апробация работы. Отдельные части диссертационной работы были
представлены на «XIX International Roundtable of Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (France, Lyon, 2010), «XVth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components» (Prague, esk Krumlov, 2011) и Первой Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia – 2013)» (Россия, Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, 3 тезисов докладов и 1 патент.
Объем диссертации. Диссертация изложена на ____ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ____ таблицами, ____ рисунками и ____ схемами. Список цитированной литературы включает ____ наименований.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований 10-04-00914-а и 13-04-00829-а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология, а также Международного Научно-Технического центра (проект № 1989).
Научная новизна результатов исследования
Нуклеозидные аналоги применяются в противовирусной и противораковой терапии уже более 40 лет. Нуклеозидные аналоги, как правило, являются гидрофильными молекулами и поэтому их способность проходить через клеточную мембрану весьма ограничена. Для проникновения в клетку им требуется опосредованный эндоцитоз, который является активным транспортным механизмом и требует для своей реализации энергии, специфических рецепторов и белков-транспортеров на поверхности клетки. Попадая внутрь клетки, нуклеозидные аналоги должны пройти каскад последовательных реакций фосфорилирования, протекающих под действием как вирусных, так и клеточных киназ, чтобы трансформироваться в активную форму – нуклеозидтрифосфат, который может выступать как конкурентный ингибитор вирусных или клеточных ДНК- или РНК-полимераз, или напротив, в качестве субстрата встраиваться в растущую цепь нуклеиновой кислоты, вызывая ее терминацию. [6] Для большинства нуклеозидных аналогов скорость-лимитирующей стадией является первое фосфорилирование, катализируемое нуклеозидкиназами, приводящее к образованию нуклеозидмонофосфата. Однако многие нуклеозидные аналоги не могут эффективно фосфорилироваться in vivo, вследствие чего снижается их потенциальный терапевтический эффект. Обойти скорость-лимитирующую стадию первого фосфорилирования могло бы способствовать прямое введение нуклеотидов, модифицированных по фосфатному остатку, однако в физиологических условиях нуклеозидмонофосфаты являются заряженными молекулами, что еще более критично сказывается на их способности проникать через клеточные мембраны.
Чтобы обойти все эти недостатки и ограничения была разработана стратегия создания депо-форм. Депо-форма маскирует активное вещество таким образом, что позволяет активному веществу обойти физико-химические, фармакокинетические и фармакодинамические барьеры (такие как плохая растворимость в водных средах, химическая нестабильность, недостаточное проникновение в клетки, быстрый метаболизм и неадекватное распределение по тканям при высвобождении в клетки). Кроме этого депо-формы, как нуклеозидов, так и нуклеотидов должны обладать достаточной стабильностью в биологических жидкостях, но при этом после проникновения в клетки обязаны превращаться в соответствующую активную форму. Поэтому, с целью увеличения терапевтической эффективности, а также для предотвращения выработки резистентности был разработан ряд подходов в создании нейтральных и мембрано проницаемых депо-форм нуклеозидных и нуклеотидных аналогов, проявляющих антивирусную активность. [7-11]
Одним из подходов, реализованных при создании депо-форм антивирусных нуклеозидных аналогов, является введение в молекулу активного вещества остатка природной аминокислоты, что положительно влияет на доставку препарата в клетку за счет специфического транспорта L-аминокислот через клеточную мембрану. Данный подход был применен к такому широко известному антигерпетическому препарату как ацикловир (ACV, Zovirax). Было получено большое количество производных ACV, этерифицированных природными аминокислотами, но наилучшую биодоступность показал валиновый эфир ACV — валацикловир (Valtrex, Zelitrex) (Рисунок 2.), который стал широко применяться в лечении HSV- и VZV- инфекций. [12] Позднее данная стратегия создания депо-форм была применена к ганцикловиру (GCV, Cymevene, Cytovene) нашедшему широкое применение в лечении гепрпесвирусных и цитомегаловирусных инфекций, но обладающему низкой оральной биодоступностью. [13] Его валиновый эфир – валганцикловир (Valcyte) обладает лучшей биодоступностью, чем исходный GCV, что положительно сказывается на его использовании как противовирусного препарата (Рисунок 2.). [14] Данный подход был использован также и в отношении бициклического фуро[2,3-d]пиримидинового аналога BVdU (Cf1743, BCNA) который является эффективным препаратом в лечении VZV- инфекций. [15] Полученный валиновый эфир Cf1743 – FV-100 является эффективным и селективным противовирусным соединением в лечении VZV-инфекций и в данный момент проходит II стадию клинических испытаний (Рисунок 2.). [16,17]
Примеры депо-форм противовирусных препаратов на основе валинового эфира. Примером удачной реализации подхода в создании депо-форм лекарственных препаратов является введение в молекулу активного соединения фосфатной или фосфонатной группы, в которых отрицательные заряды «нейтрализованы» посредством введения модифицирующих групп, что позволяет создать достаточно большой набор ингибиторов репликации вирусных полимераз. Данный подход был применен к широко известному противовирусному препарату AZT (Zidovudine, Retrovir), который проявляет высокую токсичность вследствии накопления в клетке монофосфата AZT. [5] Так, созданный анти-HIV препарат «Никавир» (Н-фосфонат AZT, Рисунок 3.) обладает рядом преимуществ перед своим предшественником AZT, а именно: меньшая токсичность, более продолжительное время выведения из организма и меньший спектр побочных действий. [18]
Модификация фосфатной или фосфонатной группы в молекуле активного соединения различными эфирами (как простыми, так и сложными) позволяет повысить гидрофобность соединения, что положительно сказывается на доставке активного соединения в клетку. Введение в молекулу активного соединения сложных эфиров было удачно применено к таким препаратам как тенофовир ((R)-PMPA), проявляющего эффективность в лечении HIV-инфекции и адефовир (PMEA) - потенциального ингибитора репликации HBV. [19,20] Так, при реализации данного подхода создания депо-форм наилучшие результаты были получены для бис-пивалоилоксиметилового эфира адефовира (bis-(POM)-PMEA, Hepsera), принятого для лечения гепатита В в 2002 году [21], а также для диизопропилокси-карбонилоксиметилового эфира тенофовира (bis-(POC)-(R)-PMPA fumarate, Viread), разрешенного в 2001 году для лечения HIV-инфекции [22] и одобренного для лечения хронических HBV-инфекций с 2008 года [23] (Рисунок 4.).
Применение «ProTide» - подхода к ациклическим нуклеозидным соединениям
В процессе исследования антивирусных свойств фосфорамидатных производных тенофовира оказалось, что перспективным соединением в создании депо-форм является монофенил-изопропилаланилил тенофовира (14f), при этом ЕС50 (S)-диастереомера (GS7340) более чем в 10 раз ниже, чем у (R)-диастереомера (Таблица 12.).
Для проведения масштабных исследований необходимы большие количества соединений. Между тем все предложенные ранее методы синтеза, и, в особенности, методы разделения смесей диастереоизомеров были ориентированы на малые количества соединений (порядка 100 мг). Поэтому в 2001 году в компании «Gilead Sciences» был разработан эффективный метод синтеза килограммовых количеств фосфорамидатных соединений. Так, в результате этерификации растворимой триэтиламмонийной соли (R)-PMPA фенолом (реакция протекает в кипящем 1-метил-2-пирролидиноне в присутствии DCC) образуется монофениловый эфир (R)-PMPA с выходом 51%. Последовательная обработка монофенилового эфира (R)-PMPA тионилхлоридом и избытком изопропилового эфира L-аланина приводит к образованию диастереоизомеров целевого фосфорамидата (14f) в соотношении 1:1 (Схема 8.). Оптимальные условия разделения диастереоизомерной смеси состоят в использовании носителя «Chiralpak Diacel» и (в качестве элюирующей смеси) 30% метанола в ацетонитриле. [77]
Исследование биологических свойств диастереоизомеров при пероральном введении собакам показало, что соединение (14f, GS-7340) проявляет хорошую биодоступность и эффективно связывается как с мононуклеальными клетками периферийной крови (PBMCs), так и c лимфоидными тканями. [76]
С целью создания депо-форм лекарственных препаратов были получены также симметричные фосфодиамидаты нуклеозидных аналогов, проявляющих противовирусную активность. В данном подходе для маскировки негативного заряда вводят два этерифицированных остатка аминокислот. Следует отметить, что симметричные фосфодиамидаты имеют ряд преимуществ в сравнении с моноамидатными аналогами. Это отсутствие хирального центра у атома фосфора (диастереомеры по-разному взаимодействуют с ферментами, участвующими в активации депо-формы, что приводит к разнице в воздействии на клетку [78]), а также отсутствие необходимости в фенильном или нафтильном остатке для увеличения гидрофобности соединения. Кроме этого, диамидатный мотив несет нетоксичные и природные защитные группы. Предполагаемый механизм активации фосфодиамидатов представлен на Рисунок 14. и подобен механизму активации арилфосфорамидатных соединений. Первая стадия (а) активации состоит в расщеплении эфирных групп эстеразами или карбоксипептидазами. [79] Вторая стадия (б) включает внутримолекулярную атаку карбоксильным анионом атома фосфора с одновременным отщеплением второго аминокислотного остатка, что приводит к образованию смешанного ангидрида, представляющего собой пятичленный цикл, идентичный по структуре интермедиату, образующемуся в процессе активации арильных фосфомоноамидатов (ProTide). Спонтанный гидролиз (с) под действием воды приводит к раскрытию цикла с образованием интермедиата, несущего два отрицательных заряда. И, наконец, последняя стадия механизма активации фосфодиамидатных соединений (д) заключается в ферментативном расщеплении Р-N связи фосфорамидазами с образованием соответствующего нуклеозидмонофосфата.
Как правило, диамидатные депо-формы получают из свободных фосфоновых кислот нуклеозидов, используя 2,2 -дитиодипиридин (AldrithiolTM-2) и активацию трифенилфосфином, с последующей обработкой эфиром аминокислоты. При данном методе синтеза выход целевых бис-амидатов составляет от 11% до 74% и сильно зависит от природы аминокислоты. [80, 81] Другой подход для получения диамидатов, заключающийся в переводе свободного фосфонатного аналога нуклеозида в дихлоридат, используя оксалилхлорид или тионилхлорид с последующей конденсацией с подходящим эфиром аминокислоты, позволяет получить целевые соединения с 20-55% выходами. [82] В работе [76] были получены симметричные диамидаты тенофовира и изучены их противовирусные свойства. Соединения показали значительную активность против HIV-1 в сравнении с самим тенофовиром, но существенно меньшую (до 100 раз) в сравнении с моноамидатами тенофовира (Таблица 12. и Таблица 13.).
Таблица 13. Анти-HIV активность диамидатов тенофовира (14). [76] Соединение R1(аминокислота) R2(эфир) EC50 (iM) Ade 0 R-iI .o. p X Ck NH IIо 14 PMPA 5.0 16a L-Ala Метил 2.5 16b L-Ala изо-пропил 0.25 16c L-Ala Бензил 0.03 I6d L-Phe Метил 0.50 16e L-Leu Метил 0.24 Ранее было показано, что PMEA (15) может эффективно подавлять рост раковых клеток. Так, авторы работ [83, 84] наблюдали заметное уменьшение роста опухолевых клеток при их обработке PMPA (15) в концентрации 25 мг/кг/день уже на 10 день, а при обработке раковых клеток в максимальной концентрации (250 мг/кг/день) наблюдалось полное подавление роста клеток. Поэтому в 2014 году Пертусати и соавторы решили исследовать антипролиферативные свойства ряда арилфосфорамидатных производных адефовира (15) и тенофовира (14). [85]
Для синтеза целевых соединений авторы использовали метод, предложенный для синтеза диамидатных производных ациклических нуклеозидных фосфонатных аналогов. [86] Так, обработка свободного (R)-PMPA (14) или PMEA (15) триметилсилилбромидом в ацетонитриле приводила к образованию интермедиата (III) (первая стадия), который без дополнительной очистки был сконденсирован с эфиром необходимой аминокислоты в присутствии триэтиламина, «Aldrithiol-2» и трифенилфосфина (вторая стадия) (Схема 9.). В результате двухстадийного синтеза были получены целевые диамидаты (16c) и (16f-h) с выходами 22-70%.
Авторы также использовали Схему 1. и для синтеза арилфосфомоноамидатов, модифицировав методику. Так, на второй стадии синтеза авторы обрабатывали интермедиат (III) смесью эфира аминокислоты и арильного спирта в соотношении 1:1, что позволило им получить целевые арилфосфомоноамидаты 14l-o и 15d-g с выходами 10-30%. Кроме этого, авторы впервые ввели вместо арильной или нафтильной группы 5,6,7,8-тетрагидро-1-нафтильный остаток.
Арилфосфорамидатные производные нуклеозидов как антимикобактериальные агенты
Другим вариантом увеличения эффективности доставки депо-формы внутрь клетки является введение в молекулу ProTide соединения в качестве аминокислотного остатка эфиров аминодиуксусной кислоты (IDA). Ранее было показано, что коньюгат аминодиуксусной кислоты и дезоксиаденозинмонофосфата представляет собой аналог нуклеозид-трифосфата, который выступает субстратом для вирусных полимераз, результатом чего является удлинение растущей цепи ДНК на один нуклеотидный остаток. Данный факт свидетельствует о том, что вирусные ДНК-полимеразы способны расщеплять фосфорамидную связь в диацетиламидофосфате дезоксиаденозина. [114] Было также показано, что коньюгат аминодиуксусной кислоты и d4T выступает терминатором обратной транскриптазы HIV-1 после однократного встраивания молекулы d4TMP в растущую цепь вирусной ДНК. [115]
Основываясь на данных результатах, группа профессора Хердвайна синтезировала ряд «ProTide»-соединений известного противогерпетического препарата BVdU, содержащих остаток IDA, этерифицированный различными спиртами (Рисунок 20.). [116]. Для их синтеза был использован оптимизированный Лехстеном и сотр. фосфохлоридатный метод, ранее разработанный МакГьюгеном. [117] Основным отличием оптимизированного метода является проведение реакции при более высоких температурах (от -10оС до -5оС) чем в исходной методике (-78оС). Авторы также отметили, что в условиях данного метода стало возможным проводить реакцию конденсации арилфосфохлоридата с солями вторичных аминов.
Соединения (44а) и (44Ь) были протестированы в качестве потенциальных ингибиторов ДНК-содержащих вирусов (HSV-1, HSV-2, VZV, HCMV), включая и дефицитные по ТК штаммы HSV-1 и VZV. Авторы показали, что соединение (44а) оказалось неактивным ни в одной тестируемой системе, включая и ТК"-штаммы. В случае соединения (44Ь) наблюдалось падение активности по сравнениию с исходным нуклеозидом, равно как и и с описанным ранее фосфорамидатом NB1011 (в 10 и 3 раза, соответственно). Однако при этом для фосфорамидата (44Ь) сохранялась активность на клетках, дефицитных по тимидинкиназе, в то время как для соединения (44а) была отмечена потеря активности. Данные результаты связаны с худшим проникновением фосфорамидата (44а) через клеточную мембрану, в то время как в случае (44Ь) введение гидрофобной бис-пивалоилоксиметиловой (РОМ) группы способствует лучшему проникновению в клетку. [118] Падение противовирусной активности связано также с медленным внутриклеточным высвобождением исходного нуклеозида или его монофосфата, вследствие низкого содержания фосфорамидаз в использованных клеточных культурах. Ранее было показано, что эти ферменты присутствуют в основном в клетках бактерий, грибов и растений, у человека же обнаруживаются в случае различных новообразований. [119, 1120] Авторы также предполагают, что, встраиваясь в растущую цепь вирусной ДНК, фосфорамидатные производные BVdU (44a) и (44b) проявляют свойства терминаторов ее биосинтеза. [115]
Другим важным фактором, влияющим на проявление биологической активности ProTide соединений, является скорость высвобождения в клетке молекулы нуклеозидмонофосфата. Так, известно, что введение в молекулу препарата S-ацилтиоэфирной (SATE) группы делает соединение стабильным в плазме крови, но, попадая внутрь клетки, оно быстро гидролизуется до нуклеозидмонофосфата. Однако SATE-содержащие соединения имеют существенный недостаток – плохое проникновение в клетки вследствии наличия отрицательного заряда. [121] Чтобы обойти данный недостаток, в 2008 году группой Периго было предложено использование дополнительной функциональной группы (как эфирной, так и амидной), маскирующей отрицательный заряд на атоме фосфора. [122] Данный подход был применен к 2 -С-метилгуанозину (2 -MeG) – эффективному ингибитору РНК-полимеразы HCV (Рисунок 21.). [123]
Одним из наиболее удачных примеров реализации данного подхода является ШХ184 -перспективное соединение в лечении гепатита С (Рисунок 21.). Введение в молекулу моно-SATE-2 -MeG остатка бензиламина позволило замаскировать заряд на атоме фосфора, при этом, что важно, полученное соединение не потеряло своих гидрофильных свойств. [124] Исследование противовирусных свойств ШХ184 показало, что соединение в результате ряда внутриклеточных превращений гидролизуется до 2 -метилгуанозин-монофосфата, после чего эффективно фосфорилируется клеточными киназами до своей активной формы - 2 -метилгуанозин-трифосфата. [125]. Авторы также показали, что ШХ184 образует активную трифосфатную форму в 100 раз быстрее, чем 2 -MeG, что свидетельствует о возможности ШХ184 обходить первую, скорость-лимитирующую стадию фосфорилирования.
Таким образом, введение различных аминов вместо природной аминокислоты может рассматриваться как перспективное направление развития фосфорамидатного (ProTide) подхода в создании депо-фом лекарств. В заключение следует отметить, что, несмотря на исследования антивирусных свойств большого ряда как фосфомоноамидатов, так и фосфодиамидатов нуклеотидных аналогов, предклинические испытания прошла лишь их незначительная часть. Это связано с такими параметрами исследуемых соединений, как их стабильность, особенности метаболизма, токсичность и другие побочныме эффекты. Таким образом, создание новых нуклеотидных аналогов с потенциальными противовирусными и противораковыми свойствами остается до сих пор актуальной задачей.
Синтез фосфорамидатных производных ненасыщенных ациклических нуклеозидов
Заболевания, вызванные вирусными инфекциями, трудно поддаются лечению. При создании антивирусных препаратов необходимо учитывать их способность воздействовать на различные стадии развития вируса. Успех в создании таких препаратов напрямую зависит от накопленной информации о строении вируса и его жизненном цикле, а также от знаний о механизме действия, метаболизме и биодоступности будущего препарата.
Очень часто создатели противовирусного препарата нуклеозидной природы сталкиваются с тем, что при проведении испытаний in vitro препарат ингибирует рост вируса при низких концентрациях, но в ходе испытаний in vivo он теряет или существенно снижает свою активность. Потеря активности может быть обусловлена рядом факторов, таких как низкая биодоступность, невозможность фосфорилирования препарата клеточными киназами и быстрый катаболизм препарата. Чтобы избежать негативного влияния этих факторов была развита стратегия создания депо-форм (латентных форм) нуклеозидов или нуклеотидов – таких их производных, которые были бы стабильны в биологических средах организма, но после проникновения в клетку и ряда химических и/или ферментативных реакций приводили бы к образованию активной формы нуклеозида. Данный подход может позволить сократить путь превращения аналога нуклеозида до соответствующего нуклеозид-трифосфата, а главное позволяет избежать стадии первого кинирования, которое происходит при участии вирусспецифических ферментов. Кроме того, противовирусная активность таких соединений может быть заметно выше, чем у исходного соединения, а в ряде случаев активность проявляется и у неактивных нуклеозидов и нуклеотидов. Создание латентных форм нуклеотидов позволяет в ряде случаев повысить их биодоступность, что, в свою очередь, позволяет снизить концентрацию вводимого препарата (зачастую обладающего высокой токсичностью), что уменьшает вероятность возникновении у вируса резистентности к данному препарату.
Важным классом противовирусных препаратов являются ациклические фосфонатные аналоги пуринов и пиримидинов. Селективная антивирусная активность соединений данного типа объясняется тем, что их дифосфорилированные формы имеют большее сродство к вирусным нуклеотидполимеразам, чем к соответствующим клеточным феремнтам. Среди фосфонатных производных ациклических нуклеозидов наиболее широким спектром действия обладает (8)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил)цитозин ((S)-НРМРС, сидофовир, Vistide). Сидофовир проявляет активность против герпес-, полиома-, адено-, папилома- и поксвирусов, а также используется в лечении CMV-инфекций, обладая при этом низкой цитотоксичностью [100].
Известно, что пуриновые производные с 1-(3-гидрокси-2-фосфонометоксипропил)-остатком также обладают противовирусными свойствами. Так например, (R,S)-9-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил)гуанин [(R,S)-HPMPG] проявляет активность против HSV-1, HSV-2, VV, VZV, а также HCMV в концентрациях менее 1М. [126] При этом (R)- изомер HPMPG является более активным противогерпетическим соединением, чем (S)-изомер (IC50 0.10 іМ и 0.66 іМ, соответственно). [127]. Еще одно соединение этого класса, (8)-9-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил)аденин ((S)-HPMPA) на некоторых культурах клеток демонстрирует более высокую активность, чем (S)-HPMPC. В частности на клетках PRK для (S)-HPMPA и (S)-НРМРС IC50 против вируса осповакцины составляет 0.3-0.7j,g/ml и 4j,g/ml соответственно. [61, 128].
Механизм воздействия всех выше перечисленных соединений (после того как они проходят каскад ферментативного кинирования до аналогов трифосфатов), заключается в ингибировании вирусных ДНК-полимераз.
Другой популярной мишенью действия пуриновых противовирусных препаратов является Б-аденозил-Ь-гомоцистеин гидролаза (SAH-гидролаза - ключевой фермент в каскаде реакций метилирования, протекающих с участием S-аденозилметионина. Ингибирование SAH-гидролазы приводит к целому ряду последствий, включая и такие серьезные, как нарушение созревания вирусной мРНК, что делает этот фермент перспективной мишенью в терапии. [129]
Данная часть работы описывает разработанный нами подход, позволяющий получать оптически активные (S)- или (R)- синтоны, пригодные для синтеза ациклических нуклеозидных и нуклеотидных аналогов. Разработанная нами схема синтеза Base Base позволяет получать пуриновые или \ 2 \ \ 2 Y ОН "ОН пиримидиновые основания, алкилированные по N 9 или N-3 положениям, соответственно 3- #f 4 гидрокси-2-окси-(1-метокси-2V 5 . , (ib) он гидроксиэтил)пропил фрагментом, имеющим Рисунок 22. Оптически активные известную конфигурацию при С-2-атоме (1а или ( ) (1b) (Рисунок 22.). Исходными соединениями для синтеза синтонов (1a) и (1b) являются коммерчески доступные L(+)-рибоза (2a) (для синтеза производных (S)-ряда) и D(-)-рибоза (2b) (для (R)-ряда) (Схема 15.).
5-Тозилокси 1-,-метилоксирибозид (4a) был получен в две стадии с выходом более 80%. Так, метилирование исходной L(+)-рибозы (2a) по 1-ому положению метанолом в присутствии HCl, полученным in situ в результате реакции ацетилхлорида с метанолом, приводит к образованию смеси 1-- и 1--метоксирибофуранозидов в соотношении 1:1. Кроме целевых 1-,-метоксирибофуранозидов (3a) в данной реакции получается до 10% 1-,-метоксирибопиранозида. Однако данные примеси не содержат первичных гидроксильных групп, поэтому являются инертными в условиях, используемых на следующей стадии, что позволяет использовать в реакции тозилирования неочищенную реакционную смесь. Обработка 1-,-метоксирибофуранозида (3a) тозилхлоридом в пиридине при +4оС приводит к целевым тозилатам (4a) с 90% выходом. Распределение реакционной смеси между хлороформом и насыщенным раствором NaHCO3 позволяет выделить (4a) с 90% чистотой, что достаточно для дальнейшего использования.