Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. История культуры и классификация современных сортов флокса метельчатого 10
1.2. Традиционные способы вегетативного размножения растений флокса метельчатого 15
1.3. Использование методов биотехнологии в системе воспроизводства растений флокса метельчатого 20
1.3.1. Этап введения в культуру 24
1.3.2. Этап мультипликации 32
1.3.3. Этап ризогенеза 36
1.3.4. Этап адаптации к нестерильным условиям 38
1.4. Методы длительного хранения in vitro растений в состоянии замедленного роста 42
2. Экспериментальная часть 46
2.1. Место проведения, условия и объекты исследований 46
2.2. Методика исследований 47
2.2.1. Этап введения в культуру 47
2.2.2. Депонирование 50
2.2.3. Этап мультипликации 51
2.2.4. Этап ризогенеза 53
2.2.5. Этап адаптации к нестерильным условиям 55
2.2.6. Морфологические и фенологические особенности при выращивании 56
2.3. Результаты исследований 58
2.3.1. Совершенствование способов введения флокса метельчатого в культуру in vitro 58
2.3.1.1. Влияние способов стерилизации на приживаемость эксплантов 58
2.3.1.2. Определение оптимального места выращивания исходного материала для введения флокса метельчатого в культуру in vitro 60
2.3.1.3. Влияние БАВ с цитокининовой активностью на приживаемость эксплантов на этапе введения в культуру 65
2.3.2. Выявление условий длительного депонирования флокса метельчатого в условиях замедленного роста при низких положительных температурах. 68
2.3.3 Совершенствование элементов технологии клонального микроразмножения флокса метельчатого на этапе мультипликации 72
2.3.3.1. Подбор минерального состава питательной среды 73
2.3.3.2. Выявление оптимальной длительности субкультивирования 77
2.3.4. Совершенствование элементов технологии клонального микроразмножения флокса метельчатого на этапе ризогенеза 80
2.3.4.1. Разработка элементов трехэтапной, энерго- и ресурсосберегающей технологии клонального микроразмножения с использованием синтетических цитокининов 84
2.3.4.2. Разработка элементов трехэтапной, энерго- и ресурсосберегающей технологии клонального микроразмножения с применением синтетических цитокининов и ауксинов 97
2.3.5 Этап адаптации регенерантов к нестерильным условиям 106
2.3.5.1. Влияние состава субстрата на приживаемость микрорастений флокса метельчатого на этапе адаптации 106
2.3.6. Морфологические и фенологические особенности развития флокса метельчатого в зависимости от способов вегетативного размножения 111
3. Экономическая оценка клонального микроразмножения флокса метельчатого по трехэтапной технологии 123
Заключение 127
Список использованной литературы 133
Приложения 160
- История культуры и классификация современных сортов флокса метельчатого
- Методы длительного хранения in vitro растений в состоянии замедленного роста
- Подбор минерального состава питательной среды
- Экономическая оценка клонального микроразмножения флокса метельчатого по трехэтапной технологии
История культуры и классификация современных сортов флокса метельчатого
Флокс метельчатый (Phlox paniculata L.) относится к семейству Синюховые (Polemmoniaceae Juss), роду Флокс (Phlox L.). В настоящее время насчитывает порядка 70 видов и межвидовых гибридов [77, 80].
Существует несколько версий происхождения названия этого растения. Флокс, в переводе с греческого - «пламя». Скорее всего, такое название растение получило за яркую окраску, а также связано с древнегреческими мифами и странствиями Одиссея, у большинства видов окраска цветков разной насыщенности как теплых, так и холодных тонов и напоминает пламя [28]. Вторая версия немецкого происхождения, в переводе «flocken» – хлопья (снега). Окраска цветов может быть белой, розовой, красной, фиолетовой, зеленой, а также сочетать в себе несколько цветов одновременно (сорта Мишенька, Наташа, Твистер).
Родиной флоксов считают Северную Америку. В Европу флокс попал благодаря британскому ботанику Джеймсу Шерарду в 1732 году. Существуют данные, что примерно в этот же отрезок времени 1732-1740 Джон Бартрам, американский натуралист, отправлял найденные в Северной Америке образцы флоксов британскому ботанику Питеру Коллинсону.
В 1737 году, шведский ученый-естествоиспытатель, Карл Линней, впервые описал род Флокс (Phlox L.) в своих работах «Роды растений» («General plantarum» 1737) [77].
В конце XIX начале XX вв. во многих странах активно развивалась селекционная работа с флоксами.
Флокс метельчатый занимает ведущее место среди представителей рода Флокса (Phlox L.). Высота растений от 35-60 до 150-180 см являются родоначальниками большей части современных сортов и гибридов (57, 38). За последние 100 лет в нашей стране создано более 1600 сортов флокса метельчатого. В России массовая популярность к флоксам метельчатым приходит на 30 годы XX века. В этот период времени отечественными селекционерами создана большая коллекция сортов флокса метельчатого (Гаганов П.Г. 1930; Квасников Б.В. 1947; Краснова Н.С. 1950; Харченко Е.Д. 1950; Берлизов Н.И. 1954; Репрев Ю.А. 1969).
Неоценимый вклад в селекционное развитие флоксов метельчатых вложил Гаганов Павел Гаврилович. Гаганов П. Г. не только сотрудничал с зарубежными селекционерами, такими как Карл Форстер 1943, но и заложил генетическую базу современных сортов флокса метельчатого, новые направления в селекции (появление таких окрасок цветков как голубые синие и дымчатые). Репрев Юрий Андреевич в 70-80 годах XX века пополнил отечественный ассортимент флоксов метельчатых крупноцветковыми, голубыми и синими сортами (Сандро Ботичелли, Моя Любовь, Голубая Отрада), дымчатыми сортами (Врубель, Старина и т.д.).
Современный ассортимент включает порядка 500 сортов и с каждым годом селекционеры увеличивают этот список (Колоколенковы Т.Н и А.В 2007; Марковский Ю.Б. 2010; Кудрявцева О.К. 2010; Калугина А.В. 2012; Зверев Д.С. 2013; Кругловы И.Н и Г.В. 2014) (рисунок 1-4). В последние несколько лет основными направлениями, в селекции флокса метельчатого, является создание сортов с причудливой формой лепестков цветка, с дымчатой окраской и с контрастными штрихами на лепестках и листьях, пестролистные сорта с различным градиентом, а также мелкоцветковые махровые формы и сорта [79, 63].
Высота растений флокса метельчатого варьируется от 35 до 150 см. наиболее распространённой высотой растений принято считать 60-70 или 80-100 см [7, 8, 17]. Различают следующие группы флоксов метельчатых: высокие (выше 100 см); средние (50-100 см); низкорослые (25-50 см) [58, 59]. Классификация флоксов по срокам цветения: ранний (III декада июня -I декада июля); среднеранний (I декада июля - II декада июля); средний (III декада июля - I декада августа); среднепоздний (I декада августа – II декада августа); поздний (III декада августа - I декада сентября) [40, 55].
Плод коробочка, в котором образуется два или три семени. Цветок обоеполый. Венчик состоит из пяти лепестков, сросшихся в длинную трубку. Внутри трубки находится пестик, который не достигает поверхности лепестков, внутри пять нитевидных тычинок. Цветки собраны в соцветие метелку или щиток. Листья сидячие, узколанцетные, ланцетовидные или заостренно-эллиптические, супротивные, диной 5-15 см и шириной 1,5-4,0 см, расположены крестообразно, может присутствовать опушенность. Листья так же могут быть пестролистными с белой и желтой окраской. Окраска может быть не только одноцветной, но и двухцветной и трехцветной. У некоторых сортов в окраске присутствуют пятна, штрихи, точки, мазки, ободки, колечки и тени (рисунок 1-4). Основная окраска венчика: белая, светло-розовая, розовая, лососево-розовая, оранжево-красная, малиново-красная, малиновая, пурпурная, голубая, синяя, сиреневая, лиловая, фиолетовая. Лепестки не соприкасаются, слабо перекрываются почти по всей длине или сильно перекрываются. Корневая система мочковатого типа [73, 81, 82, 83]. Флоксы требовательны к влажности и насыщенности почвы питательными веществами, так как тонкие разветвленные корни располагаются в поверхностных слоях почвы на глубине от 5 до 20 см [114]. Стебли у флокса метельчатого прямые, прочные, к концу вегетации одревесневающие. Одной из особенностей метельчатого флокса являются соцветия. Соцветия флокса метельчатого может плотным, средней плотности или рыхлым.
Рыхлым соцветие принято считать когда между цветками имеются заметные промежутки; средней плотности – цветки примыкают друг к другу, промежутков нет или они маленькие; плотное – цветки частично перекрывают друг друга, промежутков нет совсем [81, 82, 83].
Форма соцветий может быть: овальной, овально-конической, округлой, округло-конической, цилиндрической, узкоцилиндрической, наклоненно овально-конической, дробно-конической, конической с выступом, плоской, плоскоокруглой [19, 159].
Размер цветков может быть от 2,5 до 4 см. Раскрытие цветков происходит неравномерно. Полного цветения флокс метельчатый достигает спустя неделю после открытия первого бутона. Существуют сорта, которые никогда не раскрывают цветки полностью, например, сорта Бутоник, Midnight Feelings, Pure Feelings, Natural Feelings, Mikes Choice [27].
При выборе места посадки для флокса метельчатого следует учитывать сортовые особенности, так как растение может портится от росы и лепестки соцветий могут сильно или слабо выгорать и терять декоративность.
Методы длительного хранения in vitro растений в состоянии замедленного роста
Методы биотехнологии широко используют для хранения и создания коллекций растений. В основе методов длительного хранения in vitro лежит возможность длительного поддержания жизнеспособности растений или их отдельных органов.
Использование длительного хранения позволяет в значительной степени снизить затраты на оздоровление вегетативно размножаемых растений, обеспечить сохранность их ценных форм, сортов и видов.
Хранение растительного материала in vitro возможно тремя способами:
1. хранение в условиях нормального роста;
2. депонирование, или хранение в условиях замедленного роста.
3. криосохранение.
Криосохранение – замораживание биологического материала и последующее его хранение при сверхнизкой температуре (-196 С). Криоконсервация или заморозка при сверхнизкой температуре является надежной альтернативой для долгосрочного сохранения генетических ресурсов растений, поскольку в этих условиях биохимические и большинство физических процессов полностью прекращаются, клеточные деления при этом полностью исключены. При этом растительный материал можно хранить неограниченное количество лет. Метод криоконсервации основан на удалении воды из тканей растений путем физического или осмотического обезвоживания с последующим сверхбыстрым замораживанием [187]
Однако для применения данной технологии необходимо специализированное оборудование. Поэтому применение этого способа все же ограничено.
Хранение в условиях нормального роста требует регулярной пересадки на свежие питательные среды, обеспечение стабильных условий культивирования (температура, влажность, освещённость, состав питательной среды), что делает этот метод дорогим и трудоёмким. Кроме того, при увеличении числа пассажей возникает риск генетических изменений, поскольку частота мутаций, напрямую зависит от скорости клеточных делений. Депонирование позволяет уменьшить затраты труда и времени, сократить расходы на реактивы, при этом используется относительно простое лабораторное оборудование, вплоть до бытовых холодильников.
К настоящему времени разработаны методики сдерживания роста в культуре in vitro для многих плодовых, овощных и декоративных культур, которые поддерживаются двумя способами: сохранение в условиях нормального роста и депонирование в условиях замедленного роста.
Стандартно для хранения растений используют пробирки с пластиковыми крышками обернутые стрейч пленкой. По литературным данным при таком хранении микрочеренки имеют ограниченный объем питательной среды и их необходимо пересаживать каждые 3 месяца.
При хранении флокса метельчатого используют низкие положительные температуры (2-5С). Коричная кислота является одним из основных фенилпропаноидов с антиоксидантной активностью, вырабатываемых растениями в ответ на стрессовые условия. Клетки и культуры тканей обычно хранятся в хорошо освещенном помещении при температуре 25 C. Однако это требует периодического переноса растений на свежие питательные среды. Данная процедура сопряжена с опасностями загрязнения, а иногда и с потерей всего материала. Кроме того, в результате длительного хранения может возникнуть генетическая нестабильность (неоднородность). В результате длительного хранения растения могут потерять способность к размножению. Чтобы преодолеть эти проблемы, разрабатываются и совершенствуются методы in vitro как для краткосрочного и долгосрочного хранения [129]. Криоконсервирование культур in vitro в жидком азоте позволило восстановить растения ряда видов размножаемых культур [130].
Существуют различные способы, используемые для ограничения роста растений, например, снижение температуры, использование среды без добавления гормонов. Использование без гормональной, бедной среды и внесение в среду соединений, таких как абсцизовая кислота или маннит замедляли рост картофеля (ретардантов) [178].
Выращивание культур в среде без сахарозы помогает задержать частоту переноса растений на новую среду. Высоцкая О.Н. для хранения земляники садовой предложила использовать маннит в концентрации 4 мг/л.
В 1959 году Caplin использовал масло моркови для обработки каллусной ткани. В последствии каллусная ткань значительно уменьшила скорость роста [140].
При изучении длительного хранения осины (Populus tremula) выявлено, что лучшие результаты получены при предварительном культивировании микрорастений на питательной среде WPM, содержащей 15 г/л сахарозы, 7,5 г/л сорбита и 7,5 г/л маннита. Растения хранили при температуре +4С при 24 – часовом световом дневном цикле при освещенности 8 часов в день и максимальной интенсивностью света – 2000 люкс [232].
По результатам исследований Малаевой Е.В., Коноваловой Л.Н. и Молкановой О.И. для актинидии подобраны оптимальные условия для беспересадочного культивирования меристем в течение 9-12 месяцев при температуре 3-5С. Исследователи предлагают использовать питательную среду MS с минеральных солей с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л [74].
Bridgen и Staby хранили культуры тканей при низком атмосферном давлении и низком содержании кислорода [137]. Хранение культур при незамерзающих температурах (2-8оС) успешно применяется для большинства видов [124]. Из всех этих методов, хранение при низкой температуре используют чаще всего. Хранение клеточных культур лекарственных растений при низких незамерзающих температурах и их влияние на вторичные метаболиты рассмотрены в работе Hiraoka в 1988 году [179]. Растения хризантемы и петунии in vitro, массово размножающиеся и хранящиеся при 4-5С в течение до 6 лет, со случайным воздействием света в культуральной комнате, зацвели после переноса в горшки, и никаких отклонений от растений петунии размноженных традиционным способом не наблюдали.
Подбор минерального состава питательной среды
В научной литературе существует огромное количество рецептов составов питательных сред. Однако соотношение ионов в них часто не сбалансированно, что приводит к дефициту того или иного элемента. Этот эффект несбалансированности может накапливаться в процессе культивирования. Следует отметить, что аналогичное явление отмечают агрохимики при выращивании растений in vivo. Конечно, не реально контролировать солевой состав на протяжении всего цикла размножения. Компромиссом может быть периодическое варьирование содержания
На этапе мультипликации микрорастения флокса метельчатого высаживали на питательные среды с содержанием микросолей по прописи Murashige & Skoog (MS). Макросоли применяли по прописям Murashige & Skoog (MS) (контроль); Woody Plant Medium (WPM); Driver & Kuniyuki (DKW), Кнопа (KN) (рисунок 18-19).
У сорта Успех достоверные различия с контролем по коэффициенту размножения 5,7 ед. против 4,7 ед. в контроле) и длине побегов (3,0 против 2,7 см в контроле) отмечены в варианте, где микрорастения высажены на питательную среду с содержанием макросолей по прописи DKW (таблица 11).
У сортов И.С. Бах и Конек-Горбунок не выявлено достоверных различий с контролем по коэффициенту размножения микрорастений (4,5-4,6 ед. против 4,5 ед. в контроле).
Дисперсионный анализ данных показал, что питательная среда с макросолями по прописи DKW достоверно отличается от питательных сред WPN и KN и имеет наибольший коэффициент размножения 4,93. Разница между групповыми средними составила WPN=1,42 и KN=1,52, что больше НСР0,5=0,29. Установлено, что все сорта достоверно отличаются друг от друга. Микропобеги на питательной среде DKW имели более здоровый вид и выровненный рост, по сравнению с другими питательными средами (таблица 11, рисунок 20).
В результате проведения двухфакторного дисперсионного анализа установлено, что на коэффициент размножения микрорастений достоверно влияет солевой состав питательной среды (фактор b) и составляет 50%. Доля влияния генотипа сорта (фактора a) - 10%, доля влияния взаимодействия факторов составила всего 6 %, что означает сортовую реакцию на изменение макросолей питательной среды (рисунок 21, приложения Д1-Д2).
Таким образом, для микрочеренкования in vitro флокса метельчатого наиболее оптимальной является питательная среда с содержанием микросолей по прописи Murashige & Skoog и макросолей по прописи Driver & Kuniyuki. Перспективно продолжать исследования в данном направлении и увеличить количество объектов исследований при испытании макросолей по прописи Driver & Kuniyuki, так как в целом можно сказать, что при их применении микрорастения более выровнены.
Экономическая оценка клонального микроразмножения флокса метельчатого по трехэтапной технологии
Экономическая оценка производится для того, чтобы определить себестоимость саженцев и уровень рентабельности производства.
В результате исследований выявлено преимущество модификации технологии клонального микроразмножения и введения в процесс производства трехэтапной, энерго- и ресурсосберегающей технологии.
Чтобы оценить эффективность трехэтапной технологии для флокса метельчатого сорта Успех, рассчитаны технологические карты для одного года работы, исходя из того, что при каждом способе производства исходное количество растений для этапа введения в культуру составляло 100 шт., а на производстве уже имеется необходимое оборудование и инструменты (приложения П1-П2).
Для того чтобы вычислить выход саженцев после этапа адаптации, необходимо учесть потери на этапе укоренения и адаптации (таблица 22). При высоком уровне подготовки сотрудников потери при клональном микроразмножении минимальны и не превышают 5 %. Затраты на расходные материалы, в том числе и на питательные среды различаются по вариантам опыта (таблица 23).
Уровень рентабельности – процентное отношение прибыли к сумме полной себестоимости товарной продукции. Каждый процент рентабельности соответствует получению одной копейки в расчете на рубль затрат. Нормальным уровнем рентабельности считается 130-140%, на предприятиях с использованием клонального микроразмножения растений этот показатель значительно выше. Это связано с высоким коэффициентом размножения, а также большим количеством и высокими ценами реализации посадочного материала.
При экономической оценке целесообразности внедрения разработанной трехэтапной технологии клонального микроразмножения, для массового производства в течение 1 года, учтены такие факторы, как затраты на электроэнергию, стоимость расходных материалов, повышение коэффициента размножения, укореняемости и приживаемости на этапе адаптации.
Экономия средств при применении трехэтапной технологии очевидна, себестоимость 1 саженца при традиционной схеме составляет 23,0 р., при трехэтапной схеме клонального микроразмножения – 15,4 р. Уровень рентабельности повысился с 46 % при традиционной схеме до 257,6 % при применении трехэтапной технологии (таблица 24).
Экономическая оценка применяемых приёмов ещё раз доказывает эффективность применения трехэтапной технологии для клонального микроразмножения флокса метельчатого.