Введение к работе
Актуальность темы. Интерес к бзюлогии микоплазы сегодня объясняется, с одной стороны, уникальностьс структурной организации этих кикроорганиэчов, а с другой, - практической необходимостью так как микоплазмы имеет большое негативное значение для медицины, сельскохозяйственного производства и биотехнологии.
Болезни микоплазменной этиологии сельскохозяйственных животных широко распространены во всем мире и наносят значительный а териальный ущерб скотоводческим фермам и птицефабрикам. В 70-е rw-. ды отечественные исследователи уделяли большое внимание изучение этиологической роли мнкоплазм при респираторных заболеваниях телят, маститах и других поражениях гешггальной смете ы крупного рогатого скота СГаффаров Х.З., Митрофанов П. М., 1959;. Коваленко Я. Г. и др., 1971; Курбанов И. А., 1973; Митрофанов П.М., 1977 и др.:. Оказалось, что возникновение микоплазмозов связано с нарушением природного равновесия во взі шодеиствии симбиотической системы "микоплазма-органиэм хозяина" с факторам- окружающей среды, которое неизбежно происходит в процессе интенсификации животноводства.
Сложность и трудоемкость бактериологических исследований, отсутствие серологических методов диагностики мнкопяаэмозов сельскохозяйственных животных, а также то обстоятельство, что в антигенной структуре, помимо компонентов, обладагцих строгой специфичностью, содержатся и общие антигены, присущие другим видам чш:м--лазм, ориентирует на поиск современных диагностических методов надежных средств, обладаниях высокой чувствительностью и специфичностью.
Достижения молекулярной биологии и генной инжвнерайі создали предпосылки для разработки новых биотехнологий, которые могут оып-успевно применимы для получения более эффективных диагноствкуиоь.
8 этом плаке кммунофврментай анализ СИФА) предст&вя&уг сооо*-, уникальную комбинаций высокой чувствительности при индикации антигенов и выявлении гктатея. Популярностъо этет «««год пользуется і при диагностике микоплазмозов животных и птщ. Прочей, не чугетвп-тельЕости и специфичности ИМ, как правило, превосходит такие серо -иикунологичєскгг кетоя» ках РСК, РИГА, РДП и ВФ CLaEbert К. t
Cabasse E., 1987; Schaeren W., Nicolet J., 1983 и др.). Однако ИФА также не гарантирует точного типирования различных видов, сероти-пов микоплазм, ахолеплаэм и уреоплазм, ввделяемых от животных с различными формами клинического проявления заболевания.
Несовершенство диагностических методов затрудняет своевременное выявление микоплаэменной инфекции, изучение механизмов взаимодействия микоплазм с клетками и организмом хозяина и разработку специфичных методов подавления инфекции.
В настоящее время решение проблемы диагностики микоплазменных инфекций связывают . применением метода ДНК-ДНК-гибридизацки с использованием специфичных ДНК-зондов.
В изучении взаимодействия микоплазм с клетками и организмом хозяина сделаны лишь первые шаги, - показана роль микоплазм в возникновении того или иного заболевания и описаны симптомы болезни. Молекулярные механизмы взаимодействия микоплазм с клетками животных до сих пор не выяснены. Имеющиеся данные позволяют предположить возможность обмена между взаимодействующими организмами не только низкомолекулярными веществами, но и биополимерами, включая нуклеиновые кислоты.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей ра^ты является сравнительное изучение структурной организации геномов микоплазм, наиболее часто инфицирующих крупный рогатый скот и создание специфичных ДНК-эондов для обнаружения и идентификации этих микоплазм. В связи с поставленной целью в задаче настоящего исследования входило:
-
определение степени гомологии разных видов микоплазм;
-
оп,еделение уровня гомологии между ДНК микоплазм и некоторых бактерая;
-
конструирование специфичных ДНК-зондов для обнаружения и идентификации микоплазм, наиболее часто инфицирующих крупный рогатый скот.
Научная новизна работы. Вле. зые установлено, что гомология между Mycoplasma bovis и большинства других микоплазм " ахолеплазм по ДНК касается отдельных фрагментов генома, соответствующих генам рРНК.
Впервые показано, что гомология межчу М. bovis и М. gallisepti-cum составляет более 50'/..
В геномах следующих п .р микоплазм: М. bovis и Н. gallisepticum.
- 5 -M. mycoides capri и M. fermentans, М. mycoides capri и H.ba.j dnls обнаружены гомологичные повторяющиеся последовательности.
Сконструированы видоспецнфичные рекомбинантнне плазмиды рНЫ, рКЬгЭ, рМтсШ, содержание фрагменты геномов И. bovis, М. bovirhinis, М. mycoides capri, которые позволяют обнаружить 1С?"* иикоплазмешгьаг частиц в любом биологическом материала и могут быть нспользоезвн г качестве вияоспецифнчных ДНК-эолдов для обнаружения перечисяеинь.-' микоплаэм.
В геноме микоплаэм обнаружены последовательности нуклеотвдов, гомологичные сайтам посадки эукаряотической топоизомерззы I,
Научно-практическая значимость работы. Отмечена значите~,;г:? гомология между патогенными видами микоплаэм. Наличие гомологичны; повторявшихся нукяеотидных последовательностей в еномах никой' лаэм, возможно свидетельствует о наличие каких-лхбо 'Іелков. или ферментов метаболизма, свойственных всем патогенним михопяаэлкш, или же эти участки ДНК связаны с генами, обеспечмвавдиыи метаболические потенции "минимальноа" '.летки.
Сконструированные рекомбинантные пл?"эмяды, содержание фрагменты геномов Rbovis, М.bovirhinis н М. mycoides capri. является специфичными диагностическими зондами, которые могут быть использованы при диагнос.хке микоплазыенных инфекций скота и идентификации этих видов микоплази.
До настоящего времени последовательности, гомологична сайтам узнавания топоизомераэы I, были идентифицированы только в геномах вирусов и эукариот. Наличие подобных участков в геноме шїкояяеггї может быть аргументом за схожесть механизмов регуляций, эволгошок-но сохранившихся от прокариотических к эукаркотечесшш органкэнаи.
Апробация работы. Основные положения работы додоааки я обсуждены на Международных конференциях ВсемярноЗ организация йикол-лазцологов (3-7 августа 1992г., Аикс, СЖА; 18-27 ввля І9&ІГ., Бордо, Франция). Школе-семинаре по вроблвизы. 5нетрой дкагксстаки &~ ксплазкепкых инфекций С7-І4 августа 1^1 г., Иерусалим, йэраалъ), Отчетной конференции Казанского научного центра Российское Аягд*-мии-Наук С22-29 января, ІЗЗЗ г.. Казань), заседания Ученого Совет-
внши.
Публикации. По катерзалаи диссертация опубликовано 8 научных
работ.
Внедрение. Результаты работа оформлены в виде 1?этод.ччес««лг
У
рекомендаций "Обнаружение и идентификация микоплазменных инфекций крупного рогатого скота методом ДНК-ДНК гибридизации" и используется для диагностики микоплазменных инфекций сельскохозяйственных животных.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Гомология М. bovis и исследованных видов микоплаэы и ахолеп-лаэы по ДНК касаетсл отдельных фрагментов генома, соответствующих генам рРНК.
-
Гомология между М. bovis и М. galiisepticura по ДНК составляет более 50.
-
В геномах не; торых исследованных микоплаэм обнаружены гомологичные повторявшиеся последовательности нуклеотйдов размером 7, 9, 10. S тыс. н.п., соответственно.
-
В геноме М. bovis обнаружены последовательности нуклеотйдов, гомологичные сайтам посадки эукариотической топоизомеразы I.
-
Сконструированные диагностические ДНК-зонды позволяют обнаружить микоплаэменнур инфекцию в любом биологическом материале, вызванную М.bovis, М. bovirhinis, М. roycoides саргі.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включая методы и обсуждения результатов исследования, выводов и заключения, иллюстрирована 7 таблицами и 9 рисунками. Список использованной литературы включает 172 наименования, в том числе 152 иностранные работы.
