Введение к работе
Актуальность темы. Заболевания респираторного тракта одна из основных причин,препятствующих интенсивному развитию овцеводства: повышению продуктивности и улучшению сохранности полноценного взрослого поголовья и молодняка. Ущерб может быть прямо связан с гибелью овец вследствие развития пневмонии или косвенно обусловливаться медленным ростом .замедленным развитием и затратами на лечение (Lea Master 1983) [86]. Залогом успешного ведения отрасли является своевременная постановка диагноза. Трудности дифференциальной диагностики респираторных заболеваний заключаются в полиэтиологичности последних. На характер проявления респираторных заболеваний,вызываемых бактериями, вирусами, (Сюрин В.Н. и др.1974, Соколов М.Н.1978,1980,Караваев Ю.Д. и др.1980,Писаренко Н.И. и др.1982,Мурзалиев И.Д.1990,Gilmor N.S.et.al. 1979,Howard D.et.al.1979) влияют также и стрессовые факторы:нарушение санитарных норм содержания,неполноценное кормление,перевозки на большие расстояния. Среди других респираторных заболеваний,относительно хорошо изученных у человека,а в ветеринарной практике у крупного рогатого скота,респираторно-синцитиальная инфекция имеет важное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Обнаружение у овец антител к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) крупного рогатого скота (Berthlaume et.al. в 1973 и Smith et.al. в 1975 гг) позволили сделать предположение о циркуляции у овец вируса, антигенно родственного,но отличного от РСВ крупного рогатого скота. Дальнейшие исследования ряда зарубежных ученых позволили выявить серопозитивное поголовье овец и коз в Канаде (31%).Великобритании (55%),в США (84,5%), Болгарии (83,3%). В нашей стране,за исключением единственного сообщения Глухова М.с соавт.(1988) об обнаружении титров антител к РСВ у овец в РДП,данных о циркуляции и диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции среди овец доступной нам литературе не обнаружено.В целом респираторно-синцитиальная инфекция остается недостаточно изученной,что связано со сложностью выделения и культивирования РСВ. Особенности культивирования ,в свою очередь,затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изговления диагностических препаратов и средств специфической профилактики. Возможность диагностики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и установление роли РСВ в респираторной патологии овец позво-тяет дифференцировать сложный комплекс заболеваний респираторного ракта.
Цель и задачи исследований. Цель нашей работы заключалась в разработке метода ретроспективной диагностики респираторно-синцитиальной инфекции овец.
В соответствии с этим, в наши исследования входило решение следующих задач:
і. Отработать параметры и условия постановки реакции непрямой ге-магглютинации (РИГА) для диагностики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции (РСВИ) у овец.
-
Изучить широту циркуляции РСВИ в ряде овцехозяйств Ставропольского края и Молдавии,используя разработанный серологический метод .
-
Изучить патогенные свойства штамма "ШМГ'РСВ крупного рогатогс скота для овец различных возрастных групп при экспериментальном заражении.
Научная новизна. Разработана методика постановки РИГА для диагностики РСВИ у овец. Впервые в овцехозяйствах Ставропольского края и Молдавии изучена широта циркуляции РСВИ среди овец и течение РСВИ в экспериментальных и полевых условиях.
Практическая ценность работы. Разработаны и утверждены ГУЕ (20.09.91 г)"Методические указания по выявлению антител к респиратор-но-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в реакции непрямой гемагглютииации" и "Временное наставление по применению набора эритроцитарного диагностикума для выявления антител к РС-вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в РИГА" совместно с сотрудниками MB А.
Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции молодых ученых ВИЭВ (1988 г.),межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (28 июня 1993 г) и опубликованы в трех научных работах .
Объем работы. Диссертация изложена на л (/страницах машинописного текста и состоит из введения .обзора литературы,собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована ? рисунками и 35" таблицами. Список цитируемой литературы содержит 7& источников,в том числе 4Ч0 иностранных.
Работа выполнялась в лаборатории эпизоотологии.диагностики и профилактики вирусных и анаэробных болезней овец ВИЭВ,на опытной базе ВИЭВ ( г.Вышний Волочек), лаборатории вирусологии МВД,лаборатории вирусологии Молдавского НИИ животноводства и ветеринарии,овцеводческих хозяйствах Молдавии и Ставропольского края.
Для выполнения поставленных задач использованы материалы отчет-
ности ветеринарной службы Туркменского района Ставропольского края.
Для проведения опытов и серологических исследований использовали овцепоголовье остфриэской,цигайской пород и их помесей .каракульской, романовской, мериносов из Ставропольского края,Центрального Нечерноземья,Молдавии.
В виду отсутствия возможности использования для исследований рес-пираторно-синцитиального вируса (РСВ) выделенного от овец (LeaMaster D.R.,1983) в работе были использованы антигеннородственгше штамм "RANDALL" РСВ человека из "Набора по диагностике РСВИ крупного рогатого скота в РСК.РДП.ИФ" Приволжской биофабрики и штамм "NOMI'TCB крупного рогатого скота, любезно предоставленный нам доктором биологических наук Осидзе Н.Г.
Для культивирования РСВ и идентификации выделенного вируса в реакции нейтрализации (РН) использовали первично-трипсинизированные культуры и субкультуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) и почки эмбриона коровы (ПЭК), полученные в отделе культур тканей, питательных сред и клеточной биотехнологии ВИЭВ.
Серологические исследования проводили в реакциях непрямой гемагг-лютинации (РИГА) с эритроцитарным диагностикумом в нашей модификации (РНГА-1) и в модификации МВД (РНГА-2), иммунодиффузии (РИД), агглютинации целлюлозы (РАЦ) по методу Макаряна Э.с сотр.(ин-т иммунологии, г. Москва), ИФА по методу Бостанджиевой Р.(ЦНИВМИ, София.Болгария). Иммунологические исследования проводили в РИД в лаборатории иммунологии и биотехнологии ЕИЗВ.
Патологоморфологические исследования проводили в лаборатории па-томорфологии ВИЭВ .
Для проведения ИФА использовали набор для иммуноферментного анализа, разработанный и любезно предоставленный нам научным сотрудником ЦНИВМИ P.M.Бостанджиевой для обнаружения антител к РСВ. Для постановки реакции использовали клеточно-культуральный антиген РСВ крупного рогатого скота и реагенты гамма-глобулин против РСВ и коньюгат (антивидовые антитела меченые пероксидазой). В лунки 96-луночных полистеро-ловых микропанелей вносили по 100 мкл раствора гамма-глобулина против РСВ в концентрации 10 мкг/мл в 0,01 М фосфатно буферном растворе рН 7,2 (ФБ). Затем проводили инкубацию 18 часов при температуре +4С,после чего промывали фосфатно-буферным раствором содержащим 0,05 X твин-20.
Исследуемые и контрольные сыворотки перед внесением в подготовленные таким образом планшеты титровали на больших планшетах ( предназначенных для РСК) в двукратном разведении с начальным титром 1:10. "" лунки с раститрованными сыворотками вносили 4 ГАЕ антигена РСВ в бъеме 100 мкл. Затем проводили 2-х часовую инкубацию при 37 С.
- б -
После промывки в лунки вносили конъюгат в рабочем разведении и инкубировали 1,5 часа при температуре +37 С. Затем после тщательной отмывки добавляли субстратную смесь (ОФД + перекись водорода). Смесь инкубировали при комнатной температуре до пожелтения раствора в лунках с контролем.
Результаты учитывали по оптической плотности на автоматическом 8-канальном фотометре "Мультискан" (Финляндия) при длине волны 492 нм. За диагностический титр сывороток принимали разведение, в котором оптическая плотность была в 1,5 раза меньше значения отрицательного контроля (фетальная сыворотка) (ОП 0,150) .
При постановке реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ) в модификации сотрудников лаборатории препаративной биохимии института иммунологии антигенов Э. Макаряна с соавт. использовали целлюлозные диагностикумы: антительный /"Вироцелл"-вирус/ и антигенный /"Вироцелл"-антитело/. РАЦ применяли в качественном и количественном вариантах на предметных стеклах.
При постановке качественной РАЦ на обезжиренные сухожаром предметное стекло наносили 40-50 мкл исследуемого и контрольного образцов с последующим добавлением антигенного или антительного диагностикума в равном объеме.Положительные результаты РАЦ учитывали через 3-5 минут по морфологии агглютината в крестах по 3-х бальной системе.
При проведении количественной РАЦ титрование исследуемых образцов на предметных стеклах проводили поэтапно:
1.Нанесение фосфатно-буфферного раствора( ФБР 7,2-7,4 ) на шесть предметных стекол по две капли объемом 40-50 мкл на одно предметное стекло;
2.Разведение в ФБР исследуемого образца в объеме 40-50 мкл с первой капли по шестую в log2 ;
3.Внесение антигенного или антительного диагностикума в объеме 40-50 мкл во все разведения и тщательное их перемешивание;
4.Учет результатов РАЦ :
по максимальному разведению образца в котором отмечали агглютинацию.