Разработка, усовершенствование и оптимизацияпромышленных технологий производства диагностикумов и противобактериальных вакцин Мельник, Николай Васильевич

Введение к работе

І..

1.1 Актуальность проблемы. Основными задачами ветеринарной науки и практики является улучшение качества продуктов питания и животного сырья , решение проблем диагностики и профилактики болезней животных , а также охрана страны от заноса возбудителей особо опасных болезней и защита внешней среды. Биологическая промышленность является старейшей отраслью агробиологического комплекса России и представлена биопредприятиями , расположенными в различных регионах страны . Основное направление в работе биопредприятий - производство ветеринарных препаратов . На предприятиях отрасли производится более 170 препаратов , в том числе противобактериальные , противовирусные и ассоциированные вакцины , диагностикумы , лечебные сыворотки и глобулины, бактериофаги, анатоксины и различные растворы для животноводства.

В связи со складывающимися экономическими отношениями в сфере производства и потребления, возрастающей конкуренцией зарубежных и отечественных производителей , перед учеными и практиками биологической промышленности стоят задачи от успешного решения которых зависит эффективность работы ветеринарной службы России и биопредприятий.

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными лечебно-профилактическими препаратами - одна из главных задач в экономике и экологии страны. Система программных мероприятий для обеспечения ветеринарной службы России высокоэффективными конкурентноспособны-ми отечественными препаратами предусматривает проведение работ по технологическому и техническому переоснащению их производств на основе достижений биотехнологии.

Общие концепции и принципы биотехнологии представлены в трудах отечественной и зарубежной ученых : M.J. Raulin, 1969; A J. Kluyver , L.H.Perquin, 1933; В.Н. Шапошников, 1947; J. Monod,1950; А.И. Работнова, 1957; Н.Д. Иерусалимский 1949; Ш. Аиба, А.Ф. Хемфи, Н. Миллис, 1975; Э. Уэбб, 1966; 1969; М. Диксон, 1966; G.L.Solomons, 1969; S.J. Kit, 1975; R.Y. Stanier , E.A. Adelberg, M. Doudoroff, 1975, 1979; Дж. Уотсон, 1978; И.В. Березин, 1979, В.В. Кафаров, 1979; Д. Уонг, Ч. Кооней, А. Демайн, Р.Дунни, М. Лилли, 1983; В.В. Бирюков, В.М. Кантере, 1985; К.А. Калу-нянц, Л.И. Голгер, В.Е. Балашов, 1987; Дж. Бейли, Д. Оллис, 1989; С.Д. Варфоломеев, 1990; И.А. Баснакьян и др., 1983, 1992; ,Е.А. Рубан А.Я. Са-муйленко, 1971,1996; Н.Д. Скичко, 1990,1996.

Вопросам промышленной технологии производства вакцины против рожи свиней посвящены работы Луи Пастера, 1882; Т. Леффлера, 1886; Д.Ф. Конева, 1904-1908; В.П. Меркулова и др.,1970-1972; О.Б. Дьяконова и

др. , 1972; Н.Т. Татаринцева, П. Васильєва, 1975; А. Воробьева, 1986. Однако создание высокоиммунногенной вакцины против рожи свиней в условиях современного промышленного производства требует новых технологических подходов к системам управления глубинного культивирования, оценке ростовых свойств питательных средств, биохимическим показателям сред высушивания.

Большое количество работ посвящено проблеме технологий производства антигенов и вакцин против бруцеллеза из различных штаммов: Брюс , 1887; П.Ф. Здродовский, 1927 ; Huddleson, 1929; П.А. Триленко, 1957; Е.С. Орлов, 1964; Н.П. Иванов, 1984; К.В. Шумилов и др., 1987.

Сохраняет актуальность проблема получения высокоэффективных эритроцитарных диагностикумов для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Первым формалинизированные эритроциты в серодиагностике использовал R.A. Fleck, 1962. Данные о консервации эритроцитов формалином приведены также в работах Ю.А. Белой, 1984, 1996 и В.В. Зайцева, 1987. Различные методы формалинизации эритроцитов барана описаны в многочисленных работах отечественных и зарубежных авторов: J.M. Singer (1956); В. Smit (1960); М.И. Леви и др. (1962); S. Winblad (1960); U. Hammerlino (1967); И.В. Шур (1970); R.B. Bankert (1974); Ю.Я.Тендетник и др. (1975); H.R. Ling (1977); N.S. Wang (1984); N.A. Сох и др. (1990); В.Е. Ефремов и др. (1996); С.Н. Тимчук и др. (1996); Б.В. Каральник и др. (1996).

Процесс сенсибилизации эритроцитов сенситином является наиболее важным этапом при изготовлении пуллорного антигена и других диагностикумов. Механизм взаимодействия эритроцитов и сенситинов сложен, в нем принимают участие как физическая адсорбция, так и химическое взаимодействие (А.Т. Кравченко, М.И. Соколов, 1946; W.P. Havens и др., 1949 ИВ.; Шур, 1970; Е. Wohfarth, 1971; Е.Н. Битная, А.С. Зайцев, Ф.Д. Любич, Ю.А. Малахов, B.C. Соловьев, 1978; Ф.С. Киржаев и др.,1975; Ю.Я. Тендетник и др.,1975; C.R. Parish и др.,1980; TJ. Humphrey и др.,1991; СЕ. Hormalche и др.,1992; Б.В. Каральник, Т.Г. Денисова, 1996).

В настоящее время в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота важное место занимает некробактериоз, получивший широкое распространение во многих регионах России.

Описание возбудителя некробактериоза и болезней, вызываемых у различных животных, даны в работах. J.D. Stovell (1969); Н. Павловский, (1909); С.Н. Вышелесский, (1917); Г.Ф. Панин, (1930); П.Н. Андреев, П.В. Тавельский, (1931); А.Г. Ревнивых, (1932,1935,1940); Н.Х. Глебов, (1947); К.И. Вертинский, Н.Г. Нахлунин, (1956); Н.И. Писаренко, (1973); F.N. Johnson, (1969); А.Г. Санин, (1974); Н.С. Островский, (1977); Г.Н. Васин, (1983); СИ. Братюха, (1985); R.B. Gupta, (1964);F.C Wilkinson, (1970); E.A. Lainq and J.R. Eqerton, (1978); R.B. Richards, (1980); B.L. Clark, (1985).

В течение длительного времени ведутся работы по созданию вакцин для иммунизации животных разных видов против некробактериоза. Разработкой их занимались В.Г. Попов, 1956; Н.Х. Глебов, 1957 ; П.И. Ребров, 1962; Р.С. Simon, P.L. Stovell, 1969; А.А. Пилипенксі и М.Н. Борисова, 1983; М. Turpin et.al., 1983; B.L. Clark et. al., 1986; Г.Ф. Коромыслов, Г.И. Устинова , Ю.Д. Караваев, А.А. Сидорчук , С.Д. Панасюк, 1987г.

Практически отсутствуют данные о промышленной технологии производства вакцин против некробактериоза сельскохозяйственных животных. До настоящего времени промышленным способом не получено эффективных специфических препаратов.

Решение задач совершенствования промышленной технологии производства ветеринарных препаратов потребовало научного обоснования и разработки основ промышленного производства оптимизации данных процессов с использованием современных методов исследований .

1. Цель работы - изучить процессы промышленного производства вакцин против рожи свиней и некробактериоза животных, единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА , РСК и РДСК, эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц, дать научное обоснование, разработать , усовершенствовать и оптимизировать эти процессы с использованием современных методов исследования , технологий и оборудования.

2. Основные задачи исследований.

1. Проанализировать и определить пути совершенствования про
мышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма
Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 ;

- вакцины против некробактериоза крупного рогатого инактивиро-
ванной эмульгированной из штамма Bacterium necrophoram (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза
крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus 19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-
тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-puUorum.

2. Научно обосновать методы усовершенствования и оптимизации промышленной технологии производства вакцин и диагностикумов.

3. Разработать или усовершенствовать и оптимизировать промышленную технологию производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма
Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 ;

- инактивированной эмульгированной вакцины против некробакте
риоза животных из штамма Bacterium necrophoram (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза
крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus 19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-
тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-pullorum.

4. Провести сравнительные испытания существующих, разработанных или усовершенствованных и оптимизированных технологий производства вакцин и диагностикумов и дать оценку эффективности полученных препаратов.

5. Изучить санитарные и экологические аспекты промышленного производства биопрепаратов и дать практические предложения по решению существующих проблем в этих областях.

6. Провести сравнительный экономический анализ существующих и предлагаемых промышленных технологий с точки зрения их экономической эффективности.

7. Сформулировать практические предложения по совершенствованию технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов на предприятиях агробиологического комплекса России.

1.4. Научная новизна. Впервые в ветеринарной биотехнологии с использованием современных научных методов исследований:

1. Усовершенствована и оптимизирована промышленная технология
производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма
Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2:

разработан и испытан с положительными результатами новый состав питательной среды с улучшенными ростовыми свойствами для глубинного периодического культивирования штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 при промышленном производстве живой сухой вакцины против рожи свиней;

разработана и проверена в условиях промышленного производства, новая рецептура среды высушивания для лиофилязации при производстве вакцины против рожи свиней ;

2. Разработана я оптимизирована промышленная технология произ
водства вакцины против некробактериоза животных инактивированной
эмульгированной из штамма Bacterium necrophorum (ВЙЭВ):

- метод разрушения микроорганизмов с использованием ультразву
ка заменен на метод замораживания-оттаивания для получения внутрикле
точных эндотоксинов (антигенов);

- процесс концентрирования экзотоксинов (внеклеточных антиге
нов) осуществлен с использованием метода ультрафильтрации ;

3. Усовершенствована и оптимизирована технология промышленно
го производства единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцел
леза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК:

- изучен , предложен и апробирован в условиях промышленного
производства метод холодной стерилизации питательных сред при изго-

товлении вакцины против рожи свиней и единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК;

разработана и испытана бессывороточная питательная среда для культивирования штамма Brucella abortus 19;

исследован и внедрен метод суспензионного глубинного культивирования штамма Brucella abortus 19 с целью получения максимального количества жизнеспособных бактерий на стадии логарифмического роста;

исследован и апробирован в условиях производства метод концентрирования ультрафильтрацией культуральной жидкости Brucella abortus шт. 19 при производстве единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК;

4. Усовершенствована и оптимизирована технология промышленного производства пуллорного эршроцитарного антигена из штамма Salmonella qalunarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц:

теоретически обоснован и апробирован в условиях производства новый метод ресуспендирования , экстрагирования , осветления бактериальной массы Salmonella qallinarum-pullorum при производстве пуллорного эритроцитарного антигена с использованием поверхностно-активного вещества ( ПАВ ), с добавлением двууглекислого натрия или раствора щелочи с последующим экстрагированием и сенсибилизацией эритроцитов по-липептидно-полисахаридной фракцией ( бесспиртовый метод);

теоретически обоснован и апробирован метод осветления сенсибилизированных эритроцитов в фосфатно-буферном растворе .

1.5. Научная новизна работы подтверждена авторскими свиде
тельствами на изобретения и патентами:

1. Авторское свидетельство № 1725904 " Способ получения бруцеллезной вакцины из шт. 82 ".

2. Патент № 2085211 " Способ изготовления вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней " .

3. Положительное решение о выдачи патента № 97108391 на " Способ изготовления инактивированной, эмульгированной вакцины против некробактериоза животных " .

4. Патент № 2085212 " Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК".

5. Патент № 2085949 " Способ изготовления пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц ".

1.6. Практическая значимость. На основе теоретических исследо
ваний и практической апробации в условиях промышленного производства
разработаны или усовершенствованы и оптимизированы следующие тех
нологии :

- технология производства вакцины живой сухой из штамма ВР-2
против рожи свиней;

- технология производства инактивированной эмульгированной
вакцины против некробактериоза животных ;

технология производства единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК;

технология производства пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц.

1.7. Материалы исследований включены в следующие норма
тивно-технические документы:

6. Инструкция по приготовлению и контролю вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней.

7. Временная инструкция по изготовлению и контролю инактивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных.

8. Изменения и дополнения к инструкции по изготовлению и контролю единого бруцеллезного антигена для диагностики сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК.

9. Регламент производства пуллорного эритроцитарного антигена.

10. Методика использования ультрафильтрации для осветвления и концентрирования бактериальной суспензии и антигенов при производстве диагностикумов и противобактериальных вакцин .

Указанная нормативная документация согласована и утверждена в установленном порядке.

1.8. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и об
суждены на:

Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем", г. Велигож, 1990 г.

Всесоюзной научно-технической конференции "Современные проблемы иммунологии , биотехнологии , генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине", г. Нижний Новгород, 1990 г.

V Всероссийской конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов", Щелково, 1996г.

Научно-производственной конференции, "100-лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России", г Курск, 1996 г.

По материалам диссертации опубликовано 2jt работы, в том числе одно авторское свидетельство и четыре патента на изобретения.

1.9. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1.Результаты изучения существующей промышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма
Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- вакцины против некробактериоза животных инактивированной
эмульгированной из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для
диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА , РСК и РДСК;

- пуллорного эритроцитарного антигена из штамма Salmonella
qallinarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц.

2. Теоретическое обоснование методов разработки , усовершенствования и оптимизации промышленных технологий производства вакцин и диагностикумов для ветеринарии.

3. Разработка или усовершенствование и оптимизация промышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма
Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

инактивированной эмульгированной вакцины из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ) против некробактериоза животных;

единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК;

- пуллорного эритроцитарного антигена из штамма Salmonella
qallinarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц.

4. Результаты сравнительных испытаний вакцин и диагностикумов, полученных по оптимизированным и ранее существующим технологиям производства.

5. Санитарные и экологические требования к производству биопрепаратов и практические предложения по решению существующих проблем в этих областях.

6. Сравнительный экономический анализ существующих и предлагаемых оптимизированных технологий.

7. Данные анализа по экономической эффективности оптимизированных технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов для ветеринарии.

8. Практические предложения по усовершенствованию технологий промышленного производства вакцин , диагностикумов на биологических предприятиях агробиологического комплекса России.

1.10. Объем и структура диссертации.