Введение к работе
Актуальность темы.
Чума плотоядных (ЧП) - высоко контагиозная вирусная болезнь, [сражающая многие виды семейств собачьих, куньих, енотовидных, ;арактеризующаяся весьма разнообразными клиническими признаками. Іатологоанатомические изменения не характерны. Восприимчивость и ровень смертности у различных видов животных варьируют в широких [ределах. В популяциях неимунных собак и пушных зверей смертность реди взрослых животных может достигать до 30-40 %, а среди молодняка до 80-100 %. Переболевшие особи часто месяцами остаются скрытыми іирусоносителями, являясь источником инфекции. Они отстают в росте, у ізросльїх особей снижаются воспроизводительные способности. Как >тмечают многие исследователи, чума является одной из самых опасных їолезней плотоядных, причиняющей огромный экономический ущерб.
Решающее значение в борьбе с болезнью имеет своевременное іроведение эффективных противоэпизоотических мероприятий. Одним из >сновных мероприятий в борьбе против болезни является ранняя ірижизненная диагностика - обнаружение антигенов вируса в выделениях юльного животного в начальной стадии заболевания (в слюне, моче, гале, в смывах из глаз, выделениях из носовой полости). Многие ісследователи отмечают, что эффективность профилактической іакцинации при ЧП зависит от иммунного состояния животных в момент шмунизации. В связи с этим возникает необходимость определения уровня специфических антител перед вакцинацией. Не менее важен юпрос определения посгвакцинального иммунитета.
Для этого необходимо иметь высокочувствительные, специфичные и жспрессные методы обнаружения антигенов и антител.
До последнего времени для лабораторной диагностики ЧП и шределения специфических антител в сыворотках крови в нашей стране іспользовали РДП, РСК, МФА, РН. В затруднительных случаях
проводили биопробу на щенках восприимчивых животных, с последующей идентификацией вируса в реакции нейтрализации.
Основным недостатком РДП и РСК является низкая чувствительность методов.
РН чувствительна и специфична, но требует длительного времени постановки и больших трудовых и материальных затрат.
МФА чувствителен, специфичен и прост в постановке. Метод с успехом применяется для обнаружения антигенов вируса в пробах органов павших или вынужденно убитых животных. Но для исследований проб выделений больного животного, а следовательно, ранней прижизненной диагностики болезни, метод не пригоден.
Указанные причины обусловили необходимость разработки средств и методов, обеспечивающих обнаружение вируса в выделениях больного животного в начальной стадии болезни и определения антител в сыворотках крови животных.
Методы ИФА специфичны, экспрессны, не сложны в постановке, позволяют проводить количественную оценку результатов. Чувствительность метода обеспечивает обнаружение минимальных количеств антигена в исследуемом материале, что гарантирует раннюю диагностику болезни.
В нашей стране методы ТФ ИФА еще не нашли широкого практического применения при диагностике ЧП. В научной литературе имеется одно сообщение о разработке и использованию метода Дот -ИФА для диагностики данной болезни.
Цель работы Разработка и усовершенствование средств и методов диагностики чумы плотоядных.
Задачи исследования.
1. Получить активные антигены ВЧП, пригодные для иммунизации
животных и использования в серологических реакциях.
2. Получить специфичные к ВЧП сыворотки крови животных,
пригодные для изготовления диагностических иммунореагентов.
-
Изготовить иммунореагенты для методов ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА, определить оптимальные условия постановки реакций для выявления специфических антигенов вируса и антител к нему.
-
Определить пригодность разработанных средств и методов для диагностики ЧП и определения специфических антител в сыворотках крови больных, переболевших и вакцинированных животных.
Научная новизна Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:
- адаптирован ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" к культуре клеток почки
сайги. На основе адаптированного вируса и культуры клеток ПС
получены активные культуральные антигены ВЧП, пригодные для
использования в лабораторной диагностике болезни;
- разработан "Сендвич" вариант ТФ ИФА, пригодный для
обнаружения антигенов вируса. Метод позволяет выявлять антигены
ВЧП в пробах из секретов глаз и ротовой полости, полученных в первые
сутки появления клинических признаков, т.е. проводить раннюю,
прижизненную диагностику болезни;
- разработан вариант ингибирования ТФ ИФА, пригодный для
определения специфических к ВЧП антител в сыворотках крови
животных;
- отработан ГХ ИФА, пригодный для обнаружения антигенов ВЧП в
зараженных культурах клеток и в мазках-отпечатках проб внутренних
органов.
Практическая значимость На основании экспериментальных исследований разработаны и
рекомендованы для лабораторной диагностики ЧП чувствительные,
специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ
ИФА и МФА. Разработанные методы позволяют выявлять антигены ВЧП
в выделениях больных животных в начальной стадии болезни (в день
появления клинических признаков), в органах и тканях павших животных
и в вируссодержащих культуральных материалах. Метод ИТФ ИФА
позволяет обнаруживать специфичные к ВЧП антитела в сыворотках
крови инфицированных и вакцинированных животных.
Сконструирован "Набор препаратов по выявлению специфических
антигенов и антител при чуме плотоядных твердофазным
иммуноферментным анализом", и оформлена нормативно-техническая
документация на набор, утвержденная директором ВНИИВВиМ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1994, 1996 гг), и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г.Покров 1994-1996гг).
Публикации По теме диссертации опубликовано 4 научных работы.
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту 1. Результаты экспериментов по определению оптимальных условий получения специфических культуральных антигенов ВЧП, пригодных для применения в лабораторной диагностике болезни.
-
Результаты исследований по разработке "Сэндвич" варианта ТФ ИФА, позволяющего обнаруживать антигены ВЧП в пробах из глаз и ротовой полости инфицированных животных, т.е. проводить раннюю, прижизненную диагностику болезни, в пробах органов павших животных и в культуральных вируссодержащих материалах.
-
Результаты исследований по разработке варианта ИТФ ИФА, позволяющего обнаруживать антитела специфичные к ВЧП в сыворотках крови вакцинированных, больных и переболевших животных.
-
Результаты исследований по разработке прямых вариантов ГХ ИФА и МФА, позволяющих обнаруживать антигены ВЧП в цитоплазме клеток внутренних органов павших животных и зараженных культур клеток.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (115 источника, в том числе 26 отечественных). Работа иллюстрирована 24 таблицами и дополнена приложениями.