Введение к работе
Актуальность темы. Возбудитель трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) вызывает высоко контагиозное заболевание свиней всех возрастов, однако наиболее восприимчивыми являются поросята до 2-х недельного возраста. Заболевание характеризуется рвотой, изнуряющей диареей и дегидратацией организма. Уровень летальности среди поросят до 10 суточного возраста может достигать 100% (Matishec et al., 1982). Болезнь регистрируют во многих странах мира, в первую очередь в странах с интенсивно развитым свиноводством - США, Канаде, Японии. Болезнь наносит большой экономический ущерб в связи с отсутствием эффективных средств профилактики. Данные статистики показывают, что в США ущерб, причиняемый вирусом ТГС, превосходит убытки от всех, вместе взятых инфекционных болезней свиней. Особую угрозу инфекция представляет для крупных животноводческих комплексов, где на относительно небольших площадях сконцентрировано большое количество восприимчивых животных (Pensaert, 1984).
Вирус ТГС входит в состав рода Coronavirus семейства Coronaviridae. Крс.\:е не. о и этот род входят антигенно родственные вирус эпизоотической диарреи свиней п гемагглютинирующий коронавирус свиней. Биология этих возбудителей изучена достаточно хорошо. В последние годы в свиноводческих хозяйствах некоторых стран Западной Европы обнаружили необычное явление - в отсутствие специфической вакцинопрофилактики и без клинического проявления ТГС резко возросло количество серопози-тивного поголовья (Callebaut, 1988). Двумя независимыми группами исследователей, из респираторного тракта здоровых свиней, был выделен ранее неизвестный коронавирус, с такими характерными свойствами, как пнев-моропность, авирулентность для естественного хозяина и тесное антигенное родство с вирусом ТГС. Выделенный возбудитель получил название респираторный коронавирус свиней (РКС или РКВС). Проникновение указанного вируса в популяцию свиней, по-видимому, способствовало
формированию иммунного фона, достаточной напряженности (Broun et al, 1988; Pensaert et al., 1979). В связи с обнаружением новой нозоединпцы возникла необходимость разработки средств и методов лабораторной диагностики, которые позволили бы обнаруживать и дифференцировать указанные коронавирусы.
Для лабораторной диагностики ТГС в настоящее время разработан-ны следующие методы: биопроба на поросятах, выделение вируса на культуре клеток, метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция нейтрализации и твердофазный им-муноферментный анализ на основе поликлональных сывороточных антител для обнаружения антигенов возбудителя; а также реакция нейтрализации на культуре клеток (РН) и непрямой МФА для обнаружения антител к антигенам возбудителя в сыворотке крови иммунных животных. В виду чрезвычайно тесного антигенного родства возбудителей ТГС и РКВС (Correa at al., 1990; Pensaert at al., 1989) ни один из вышеперечисленных методов не позволяет дифференцировать антигены этих двух возбудителей между собой и дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании РКВС, т.е. ретроспективно дифференцировать ТГС от респираторной коронави-русной инфекции свиней.
Представляется целесообразным проведение работы по получению МА к консервативным и вариабельным участкам антигенов вируса ТГС для разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной корона-вирусной инфекции свиней.
Цель работы. Получение линий гибридных клеток, стабильно секретирующих МА, обладающие специфичностью к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, и совершенствование на их основе средств и методов дифференциальной диагностики
трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавнруснои инфекции свиней.
Задачи исследования I. Получить моноклональные антитела к некоторым консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, для чего разработать схему получения таких моноклональиых антител, включающую:
- изучение эффективности различных схем иммунизации мышей - до
норов иммунных спленоцптов;
- адаптацию некоторых методов лабораторной диагностики для
скрининга моноклональиых антител нужной специфичности;
- стандартизацию моноклональиых иммунореагентов.
-
Экспериментально определить, какие методы лабораторної"! диагностики позволяют использовать и максимально эффективно реализовать свойства моноклональиых антител для обнаружения и дифференцирования антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и респираторного ко-ронавируса свиней, а также, для обнаружения и дифференцирования антител, специфичных к указанным возбудителям в сыворотках крови инфицированных животных.
-
Определить пригодность разработанных методов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавнруснои инфекции свиней.
Научная новизна Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:
- получены девятнадцать клонов гибридных клеток, секретирующие
МА к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса
ТГС и консервативным антигенным детерминантам РКВС;
установлено, что антигенные детерминанты нуклеопротеина (молекулярная масса 47 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональ-ными антителами клонов T1G4.2 и T4D4.1, а также антигенные детерминанты пепломерного гликопротеина (молекулярная масса 200 кД) вируса
ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клонов ТЗА6.2 и ТІ С 12.2, присутствуют на соответствующих белках всех изученных референтных и вакцинных штаммов вируса ТГС и его полевых изолятов. Антигенные детерминанты, распознаваемые перечисленными моноклональными антителами, присутствуют также на соответствующих белках респираторного коронавируса свиней. Таким образом, указанные моноклональ-ные антитела пригодны для обнаружения консервативных антигеных детерминант вируса ТГС к РКВС, а также обнаружения антител, специфичных к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС;
- установлено, что антигенные детерминанты, расположенные на
пепломерном гликопротеине S (молекулярная масса 200 кД) вируса ТГС,
распознаваемые моноклональными антителами клопа Т4В11.1 присут
ствуют на соответствующем белке у всех изученных референтных и вак
цинных штаммов и полевых изолятов вируса ТГС. На пепломерном гли
копротеине респираторного коронавируса свиней антигенные детерми
нанты, распознаваемые указанными моноклональными антителами, отсут
ствуют;
прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клонов T1G4.1 и Т1С12.2 позволяют обнаруживать консервативные антигены вируса ТГС и РКВС;
прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клона Т4В11.1 позволяют обнаружить вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС и дифференцировать их от антигенов РКВС;
- метод ингибпрования ТФ ИФА, разработанный на основе моно
клональных антител клонов T1G4.2, Т1С12.2 и T4D4.1, позволяет обнару
жить в сыворотке крови свиней антитела к консервативным антигенным
детерминантам вируса ТГС и РКВС;
- метод ннгпбирования ТФ ИФА, разработанный на основе моно-клональных антител клонов Т4В11.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, которые отсутствуют у РКВС и пригоден для ретроспективной дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавнрусной инфекции свиней.
Практическая значимость На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для включения в схему дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавнрусной инфекции свиней чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА п МФА на основе моноклональных антител. Разработанные методы позволяют выявлять консервативные антигенные детерминанты вируса транс-мнссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней, а также вариабельные антигенные детерминанты вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, что позволяет дифференцировать вирус ТГС от РКВС в впруссодержащих культуральных материалах, пробах органов и содержимого кишечника инфицированных животных. При ретроспек-
,, Л
тивной дифференциальной диагностике трансмиссивного гастроэнтерита
свиней и респираторной коронавнрусной инфекции свиней данные методы
позволяют обнаружить антитела, специфичные к консервативным анти
генным детерминантам вируса ТГС и РКВС, и вариабельным антигенным
детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных живот
ных, что позволяет дифференцировать иммунный ответ при инфицирова
нии животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании жи
вотных РКВС. J
Разработана нормативно-техническая документация на "Наборпре-паратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавнрусной инфекции свиней гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных анти-
тел" и "Набор препаратов для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю, Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке ТФ и ГХ ИФА), утвержденные директором ВНИИВВиМ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1993, 1994 гг), научно-практической конференции УНИИКЭВМ (г. Харьков 1995 г) и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г Покров, 1993-1995гг).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.