Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
І.І.Таксономическое положение и номенклатура возбудителя актинобациллезной плевропневмонии-свиней 13
1.2. Биологические свойства возбудителя 14
1.2.1. Культурально-морфологические свойства 14
1.2.2. Биохимические свойства 17
1.2.3. Антигенные свойства 17
1.2.4. Патогенные свойства 18
І.3. Зпизоотологические особенности актинобациллезной плевропневмонии 22
1.4. Клиническое проявление и патологоанатомические изменения при актинобациллезной плевропневмонии 24
1.5. Диагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней 26
1.5.1. Выделение и идентификация возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней 26
1.5.2. Дифференциальная диагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней 29
І.6. Основные- требования предъявляемые к контрольно-производственным штаммам используемым для изготовления инактивированных вакцин 30'
1.7. Заключение по обзору литературы 32
2. Собственные исследования 33
2:1. Материалы 33
2.1.1. Штаммы и изоляты микроорганизмов 33
2.1.2. Подопытные животные 33
2.1.3. Питательные среды 34
2.1.4. Химреактивы и растворы 36
2.1.5. Краски для микроскопических исследований 38
2.1 .6. Оборудование 38
2.2. Методы 39
2.2.1. Отбор проб патологического материала для бактериологического исследования на актинобациллезную плевропневмонию свиней 39
2.2.2. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 40'
2.2.3. Определение концентрации микробных клеток 43
2.2.4. Получение, бактериальных антигенов, нормальных и специфических сывороток крови лабораторных животных 43
2.2.5. Определение серовариантной принадлежности изолятов бактерий A.pleuropneumoniae 44
2.2.6. Хранение бактерий в лабораторных условиях 45
2.2.7. Культивирование микроорганизмов 45
2.2.8. Инактивация-микроорганизмов 47
2.2.9. Приготовление опытных образцов инактивированных вакцин 48
2.2.10. Изучение антигенных свойств опытных образцов вакцин 48
2.2.11. Оценка иммуногенности опытных образцоввакцин 49
2.2.12. Световая и электронная микроскопия 49
2.2.13. Статистическая обработка результатов 50
2.31 Результаты собственных исследований 51
2.3.1. Выделение и идентификация возбудителя, актинобациллезной плевропневмонии свиней 51
2.3.2. Изучение биологических свойств изолятов A.pleuropnewnoniae 53
2.3.2.1. Культурально-морфологические свойства 54
2.3.2.2. Биохимические свойства A.pleuropneumoniae 57
2.3.2.3. Антибиотикочувствительность A.pleuropneumoniae 58
2.3.2.4. Патогенность бактерий A.pleuropneumoniae 59
2.3.3. Определение серовариантной, принадлежности изолятов A.pleuropneumoniae по капсульному антигену 69
2.3.4. Определение способов и сроков хранения бактерий A.pleuropneumoniae 71
2.3.5. Подбор условий культивирования бактерий A.pleuropneumoniae 77
2.3.5.1. Подбор питательной среды 78
2.3.5.2. Влияние процентного содержания дрожжевого экстракта на рост бактерий A.pleuropneumoniae 81
2.3.5.3. Влияние концентрации гемина на рост бактерий A.pleuropneumoniae 83
2.3.5.4. Определение процентного содержания сыворотки крови крупного рогатого скота в питательной среде 84
2.3.6. Инактивация бактерий A.pleuropneumoniae 85
2.3.6.1. Изучение инактивирующей активности формальдегида, аминоэтилэтиленимина и бета-пропиолактона на бактерии A.pleuropneumoniae 86
2.3.6.2. Инактивация формальдегидом 88
2.3.6.3. Инактивация аминоэтилэтиленимином 90
2.3.6А. Инактивация бета-пропиолактоном 91
2.3.7. Изготовление опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии свиней и изучение их антигенных и иммуногенных свойств 92
2.3.7.1. Определение антигенной активности инактивированных вакцин на лабораторных животных 93
2.3.7.2. Изучение антигенных и иммуногенных свойств опытных образцов инактивированных противоактинобациллезных вакцин на свиньях 95
3. Обсуждение результатов исследований 99
Выводы 111
Практические предложения 112
Список литературы 114
Приложения 136
- Патогенные свойства
- Патогенность бактерий A.pleuropneumoniae
- Подбор питательной среды
- Изучение антигенных и иммуногенных свойств опытных образцов инактивированных противоактинобациллезных вакцин на свиньях
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы все больший интерес ветеринарных врачей вызывает актинобациллезная плевропневмония свиней.
Обусловлено это, с одной стороны, скудностью информации о данном заболевании, а с другой, практическим отсутствием средств и методов ее диагностики и специфической профилактики (38, 50).
' Возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней является первичным патогеном, вызывающим пневмонии у свиней (38).
Актинобациллезная плевропневмония - инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами (1, 52, 54, 65, 68, 96, 151, 168, 180, Возбудителем болезни являются бактерии семейства Pasteurellaceae, рода Actinobacillus, вида Actinobacillus pleuropneumoniae (19).
Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована' в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг., а возбудитель болезни был выделен в 1963 году (131, 163). В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством (85, 165, Экономический ущерб от этой инфекции складывается из затрат от падежа и вынужденного убоя, снижения продуктивности животных, качества получаемой продукции, затрат, связанных с проведением профилактических и оздоровительных мероприятий. Ежегодно страны Евросоюза тратят один миллиард евро на проведение лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с данным заболеванием (180, 192).
В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в: Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки (34, 68, 85, 165, 173).
Актинобациллезная плевропневмония может встречаться в ассоциации с вирусными (РРСС, парвовирусная болезнь свиней и др.) и бактериальными (гемофилезный полисерозит, легочной пастереллез, сальмонеллез и др.) болезнями (95, 130).
Заболеваемость свиней в стаде при актинобациллезной плевропневмонии может достигать от 15 до 90%, а летальность 40% в зависимости от формы течения болезни (151).
Для специфической профилактики > данного заболевания во многих странах мира разработаны и используются различные вакцинные препараты В России возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней впервые был выделен М.А. Сидоровым и Д.И. Скородумовым в 1977 г. (151, 166). В настоящее время болезнь регистрируется в различных регионах страны. Данная ситуация связана с множеством причин, одна из которых - недостаточный контроль за перемещением животных внутри страны и импорт свинопоголовья из-за рубежа, и это при том условии, что среди свиней возможно длительное бактерионосительство после переболевания (125,127,129,155).
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что актинобациллезная плевропневмония свиней является одной из актуальных проблем ветеринарии.
Цель и задачи исследований. Целью данных исследований было выделение, идентификация и изучение основных биологических свойств изолятов A.pleuropneumoniae, а также оценка возможности их использования для приготовления вакцин.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: • выделить- возбудителя* болезни: из патологического материала; в хозяйствах, неблагополучных;, по, актинобациллезной плевропневмонии свиней и провести его, идентификацию;
• •; .. изучить биологические свойства полевых изолятов A.pleuropneumoniae;
• определить- серовариантную: принадлежность • изолятов A.pleuropneumoniae по капсульному антигену;: [
• определить . способы и- сроки- . хранения; возбудителя актинобациллезной плевропневмонии'свиней в лабораторных условиях;'.'
•подобрать питательную среду для культивирования бактерийj A.pleuropneumoniae; . . ' . ; • ' - .
• • изучить! динамику инактивации бактерий: A.pleuropneumoniae формальдегидом,: аминоэтилэтйленимином и;бета-пропиолактоном;,',. •
• изучить; ...иммунобиологические свойства^ опытных образцов инактивированных вакцин * против актинобациллезной. плевропневмонии свиней;; • ''• \ • \ Научная новизна исследований. Научная новизна работы состоит в том; что в<результате проведенных исследований:
• ; выделены и идентифицированы полевые изоляты бактерий A.pleuropneumoniae; [. •.
• изучены биологические свойства изолятов A.pleuropneumoniae; •
•J определена, серовариантная принадлежность изолятов A.pleuropneumoniae по капсульному антигену;
• : изучены|; способы; т\ определены сроки хранения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней; .; .
• . подобрана питательная среда для культивирования: бактерий? i • i - ' I ' • i .
A.pleuropneumoniae;
• . изучена инактивация возбудителя актинобациллезной плевропневмоний свиней использованием . формальдегида, аминоэт илэтиленимина и бета-пропиолактона;
• изучены иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии.
Практическая значимость исследований. Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативных документов: "Методические рекомендации по идентификации изолятов Actinobacillus pleuropneumoniae" (2007г.);
• "Методические рекомендации по серологическому типированию бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в реакции преципитации в агаровом5 геле" (2007г.); ,
• "Методические рекомендации по хранению штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae" (2007г.);
• "Методические рекомендации по инактивации бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae формальдегидом" (2007г.); Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Материалы исследований использованы при оформлении паспортов на штаммы A.pleuropneumoniae "Ш-1", "К-2" и разработке НД на "Вакцину против актинобациллезной плевропневмонии свиней полиштаммовую инактивированную эмульсионную".
Основные положения, выносимые на защиту:
•результаты выделения и идентификации полевых изолятов A.pleuropneumoniae;
• биологические свойства полевых изолятов A.pleuropneumoniae;
•результаты серологического типирования изолятов A.pleuropneumoniae по капсульному антигену;
•способы сохранения возбудителя актинобациллезной* плевропневмонии свиней в лабораторных условиях;
• питательная среда для культивирования бактерий A.pleuropneumoniae;
•результаты инактивации бактерий A.pleuropneumoniae формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном;
•иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии в опытах на лабораторных животных и свиньях.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах XV Московского международного ветеринарного конгресса по болезням мелких домашних животных (Москва, 2007г.),- а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2004-2007 гг.
Публикация научных, исследований. По теме диссертации опубликовано, 4 научные работы, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ. Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В'выполнении»отдельных этапов работы принимали участие доктор биологических наук О.В. Прунтова (разделы 2.3.1, 2.3.4), кандидат биологических наук О.В. Бородина (раздел 2.3.1), кандидат ветеринарных наук В.М. Гневашев (раздел 2.3.4), кандидат биологических наук Г.М. Семенова (раздел 2.3.4),'кандидат ветеринарных наук О.И. Ручнова (раздел 213.1), ветеринарный врач Д:А. Бирюченков (разделы 2.3.1, 2.3.2.4), за что автор приносит им сердечную благодарность.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 листах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 203 источников, в том числе 64 работы* отечественных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 16 рисунками. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Патогенные свойства
Возбудитель актинобациллезной плевропневмонии, является патогенным как! для свиней, так и для лабораторных животных: белых мышей, морских свинок, хлопковых крыс и кроликов (55, 55, 59, 97, 124, 143, 145, 170).
Патогенность бактерий A.pleuropneumoniae обусловлена наличием капсулы, липополисахаридов, Арх-токсинов, белков внешней мембраны, протеаз и трансферрин переносящих протеинов (117, 145).
Вирулентность возбудителя колеблется в широком диапазоне: от невирулентных и слабовирулентных до высоковирулентных вариантов, способных вызывать заболевание у свиней независимо от условий содержания (55, 80, 94, 104, 117, 119, 124, 143, 170, 202).
Вирулентность бактерий A.pleuropneumoniae зависит от потребности в V-факторе роста. Так, при тяжелых вспышках плевропневмонии свиней НАД-независимые штаммы бактерий второго биотипа выделяют редко. Данный факт можно объяснить тем, что НАД-независимые штаммы менее вирулентны по сравнению с НАД-зависимыми штаммами первого биотипа (94).
Вирулентность различных серотипов в пределах первого биотипа также варьирует (80, 104, 115). Вспышки болезни, вызванные 1, 5, 9, 10 и 11 серотипами, характеризуются высокой смертностью и обширными поражениями легких у свиней (104, 166). Экспериментальное заражение естественновосприимчивых животных и мышей культурами референтных штаммов 1, 5, 9 и 11 серотипов подтвердило исключительную вирулентность последних (124).
Слабовирулентные серотипы 2-4, 6-8 и 12 вызывают меньшую смертность животных, однако поражения в легких схожи с поражениями от высоковирулентных серотипов (104, 179).
Ряд исследователей указывают на тот факт, что вирулентность культуры, используемой для заражения животных, зависит от ее возраста. Результаты исследований свидетельствуют, что при заражении свиней культурами 6-8-часового возраста заболевание протекает в острой форме с тяжелым поражением легочной ткани и летальным исходом (59).
Капсула обнаружена практически у всех штаммов бактерий A.pleuropneumoniae и состоит главным образом из повторяющихся цепочек кислых олигосахаридов (75, 185). Она защищает возбудителя болезни от воздействия фагоцитов и лизиса комплементом (71, 88, 141, 202).
Бескапсульные мутанты 1 и 5а серотипов A.pleuropneumoniae, полученные путем химического мутагенеза (125) или серийных пассажей in vitro (126,143), оказались менее вирулентными для свиней.
Липополисахариды являются главными компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий и состоят из полисахаридов и липида А (25).
Липополисахариды усиливают воздействие Арх-токсинов на фагоциты (102), участвуют в адгезии бактерий на слизистой оболочке трахеи (69, 111, 164, 167), связывают гемоглобин свиней (149, 162), вызывают воспаление тканей и способствуют выработке цитокинов, таких как интерлейкин-1, интерлейкин-6 и а-фактор (103, 115, 118).
- Бактерии A.pleuropneumoniae продуцируют четыре типа экзотоксинов -АрхІ, АрхІІ, АрхШ и ApxIV (66, 87, 89, 114). Данные экзотоксины принадлежат к семейству RTX-протеин-токсинов и широко распространены среди патогенных грамотрицательных бактерий (106).
Необходимо отметить, что не все штаммы и полевые изоляты бактерий A.pleuropneumoniae продуцируют АрхІ, АрхІІ, АрхШ токсины (132,159,166). К тому же они не являются видоспецифичными для A.pleuropneumoniae и обнаружены у других видов семейства Pasteurellaceae (73).
Некоторые исследователи полагают, что экзотоксины играют доминирующую роль в патогенности бактерий A.pleuropneumoniae, и их присутствие определяет вирулентность штаммов (66, 97, 104, 105, 142, 172, 194). Токсины возбудителя губительно действуют на альвеолярные макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты свиней, а также вызывают коагуляционный некроз тканей (97, 160, 197, 198, 199).
Установлено, что серотипы актинобацилл, продуцирующие АрхІ и/или АрхІІ токсины, более вирулентны, чем серотипы, продуцирующие только Арх III токсин (45, 104, 105). Роль Арх-токсинов в вирулентности бактерий A.pleuropneumoniae была продемонстрирована в эксперименте с негемолитичным штаммом-мутантом 5 серотипа, который не продуцировал АрхІ и АрхП токсины и оказался непатогенным для свиней.
АрхІ токсин (гемолизин I или цитолизин I) является гемолитическим и цитолитическим протеином с молекулярной массой 105 кДа. Данный токсин идентичен а-гемолизину E.coli и в меньшей степени похож на лейкотоксин P.haemolytica. АрхІ токсин продуцируют 1, 5а, 56, 9, 10, 11 и 14 серотипы бактерий A.pleuropneumoniae и A.suis (159).
Токсин АрхП (гемолизин II или цитолизин II) с молекулярной массой 103 кДа обладает слабыми гемолитическими и цитотоксическими свойствами. Данный экзотоксин продуцируют A.suis и все серотипы бактерий A.pleuropneumoniae кроме 10 и 14 (159). Установлено, что АрхП токсин идентичен лейкотоксину P.haemolytica.
Цитотоксическим эффектом на альвеолярные макрофаги и нейтрофилы обладает ApxIII токсин, или плевротоксин с молекулярной массой 120 кДа. Штаммы 2, 3, 4, 6, 8 и 15 серотипов первого биотипа продуцируют этот токсин.
Токсин ApxIV продуцируют все серотипы бактерий A.pleuropneumoniae (82, 84, 113).
На основании результатов изучения токсинообразования штаммов A.pleuropneumoniae, принадлежащих к первому биотипу, они были разделены на 5 групп: в состав первой входят высокопатогенные серотипы - 1, 5а, 56, 9 и 11; во вторую группу входят штаммы 2, 4, 6, 8 серотипов, имеющих широкое географическое распространение, но менее патогенных. К третьей группе относятся штаммы 3 серотипа, а к пятой - серотип 10. Штаммы 7 и 12 серотипов, характеризующиеся средней патогенностью, объединены в четвертую группу (158).
Возбудитель заболевания продуцирует набор протеолитических ферментов, которые понижают синтез Ig А и гемоглобина в организме свиней (184).
Патогенность бактерий A.pleuropneumoniae
Патогенные свойства возбудителя актинобациллезной плевропневмоний изучали1 в; опытах на: свиньях и; лабораторных животных, определяя минимальные дозы, . вызывающие гибель или заболевание животных в опыте.
На первом этапе работы было проведено экспериментальное заражение поросят с целью; выбора; оптимального способа- заражения. В опыте использовали 3 группы животных,по 6 поросят в каждой., серонегативных в отношении актинобациллезной плевропневмонии.. Для, заражения использовали суспензию 15?16 часовой- агаровой культуры изолята A.pleuropneumoniae СІШ-1". р см3,
Поросят первой группы- заражали интравенозно в объеме 1,0; второй - интраназально в объеме 2,0 см3, а третьей группы:интратрахеально в объеме 5,0 см3. После заражения за животными вели.наблюдение в течение 10 суток. Результаты экспериментального заражения поросят изолятом "Ш-1" приведены в таблице 3.
Как видно; из таблицы; 3, при. экспериментальном интравенозном заражении характерную для актинобациллезной плевропневмонии клиническую- и ііатологоанатомическую картину, а также гибель одного из двух поросят удалось воспроизвести только при заражающей дозе 2,0x10 м.к.. При этом у поросят наблюдали угнетение, одышку, кашель, анорексию и непродолжительную гипертермию.
После интраназального заражения изолятом "Ш-1" наблюдали гибель всех животных через 12-15 часов. Типичную для болезни клиническую картину и патологоанатомические изменения: геморрагическая пневмония, геморрагический лимфаденит бронхиальных и средостенных узлов, наличие геморрагической жидкости в грудной полости наблюдали при заражении поросят в дозе 1,0x109 м.к..
При интратрахеальном заражении у поросят наблюдали угнетение, кратковременную гипертермию, одышку и кашель. У павших и вынужденно убитых животных при патологоанатомическом вскрытии наблюдали геморрагическую пневмонию, геморрагическое воспаление бронхиальных и средостенных лимфатических узлов и геморрагическую жидкость в грудной полости.
Как видно из результатов опыта актинобациллезную плевропневмонию удалось воспроизвести при всех способах заражения животных. Однако в дальнейших экспериментах по изучению патогенности A.pleuropneumoniae нами был использован интраназальный способ заражения, как наиболее удобный и максимально приближенный к естественному пути заражения животных в свиноводческих хозяйствах.
Эксперименты по изучению патогенности проводили на поросятах, используя по 5 животных на изолят и штамм. Поросят заражали суспензией актинобацилл объеме 2,0 см концентрацией 0,5x10 м.к./см . После заражения в течение 21 суток ежедневно проводили общее клиническое обследование поросят. При этом оценивали степень повышения температуры тела, выраженность одышки и кашлевого рефлекса, наличие отклонений в общем состоянии животных.
Для бактериологического исследования с целью подтверждения специфичности заболевания и определения диссеминации возбудителя в организме отбирали пробы легких на границе здоровой и пораженной ткани, лимфатических узлов, миндалин, селезенки, печени, экссудата, слизи из носовой полости и трахеи, гноя из абсцессов, синовиальной жидкости пораженных суставов, крови из сердца.
Патологический материал высевали на СДА-ГЭБ и инкубировали при 37G в течение 24 ч.
Результаты определения патогенности изолятов и штаммов A.pleuropneumoniae представлены в таблице 4.
Наблюдение за экспериментально зараженными поросятами показало, что все изоляты и штаммы, независимо от серовариантной принадлежности, вызывают однотипные клинические и патологоанатомические изменения, характерные для сверхострого, острого и подострого течения болезни.
При заражении поросят изолятами "Ш-1", "К-2" и "К-1" у большинства животных наблюдали сверхострую форму болезни с гибелью в течение 8-12 часов после появления первых клинических признаков. У других поросят данных групп регистрировали острую форму болезни с летальным исходом через 48-56 часов после заражения.
При сверхостром течении у животных резко повышалась температура тела до 42С. Поросята были сильно угнетены, дыхание брюшного типа, частое и затрудненное, наблюдалась рвота; кожа ушей, пятачка и живота имела сине-красное окрашивание. В агональной стадии отмечали истечение из носовых отверстий пенистой1 кровянистой жидкости (рис.4). .
При вскрытии трупов наблюдали одно- и, двухстороннее геморрагическое! воспаление ! легких (рис.5) с выраженным отеком, интерстициальной соединительной: ткани. Пораженные участки легких ;были плотной консистенции, вишнево-красного цвета, выступали, над поверхностью окружающей нормальной ткани, при надавливании с поверхности разреза стекала кровянистая: жидкость. Поражения локализовались преимущественно в диафрагмальной и, сердечной; долях легкого
В носовой полости, трахеє и крупных бронхах содержалась пенистая кровянистая жидкость. У павших животных наблюдали скопление жидкости темно-красного цвета в грудной полости в объеме до 200 мл (рис.6). У некоторых поросят были выявлены фибринозный плеврит (рис.7) и перикардит (рис.8), а также серозно-геморрагическое воспаление бронхиальных и средостенных лимфатических узлов. Было отмечено незначительное увеличение селезенки.
При острой форме течения болезни у поросят был выражен респираторный .синдром, проявляющийся одышкой и приступами изнурительного кашля. У животных наблюдали повышение температуры тела до 41С, пенистые истечения из носа. V
На вскрытии наблюдали лобарное одностороннее геморрагическое воспаление легких с выраженным отеком интерстициальной соединительной ткани. Пораженные участки легких были плотные, вишнево-красного цвета, выступали над! поверхностью окружающей нормальной ткани,; при надавливании ; с поверхности х разреза1 стекала кровянистая жидкость.: Отмечали признаки фибринозного плеврита и перикардита, а также серозно-геморрагического воспаления лимфатических узлов
У поросят, зараженных штаммами 27088 и 33377, также наблюдали сверхострую и острую формы течения болезни.
При сверхострой форме у поросят отмечали сильное угнетение, температура тела повышалась до 42С, дыхание частое и затрудненное с хрипами. Кожа ; ушных раковин, пятачка, подчелюстного пространства, подгрудка и нижней стенки-живота имела сине-красное окрашивание.
Смерть наступала в течение 5-12 часов после появления первых клинических признаков болезни. В носовой полости имелись сгустки крови, а в просвете трахеи- и бронхов - пенистая жидкость красного цвета. В грудной полости і обнаруживали скопление жидкости темно-красного цвета в объеме; до- 200; мл. Пораженные доли легкого увеличены в объеме, пораженная ткань с поверхности и на разрезе темно-красного цвета, плотной консистенции, при надавливании с разреза стекает темно-красная жидкость.
У животных с острой формой течения отмечали повышение температуры тела до 41,5С, брюшное дыхание с выраженной одышкой и приступы кашля
На вскрытии у поросят отмечали одно- и двухстороннее геморрагическое воспаление легких, геморрагическое воспаление средостенных и бронхиальных лимфатических узлов, скопление геморрагической жидкости в грудной полости. В трахее, крупных и мелких бронхах обнаруживали пенистую кровянистую жидкость.
Трупы поросят, павших от сверхострой и острой форм болезни, имели упитанность ниже средней.
В результате проведенньгх исследований было установлено, что при сверхостром и остром течении с последующим летальным исходом возбудитель распространяется по всему организму животного и может быть. изолирован из легких, крови, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов, ; миндалин, печени, селезенки, экссудата грудной полости, слизи носовой полости и трахеи. При подостром течении болезни бактерии A.pleuropneumoniae выделяли; только из пораженных участков лёгких, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов.
Исследуемые изоляты и штаммы возбудителя актинобациллезной плевропневмоний вызывали у поросят при интраназальном заражении клиническую и патологоанатомическую картину болезни, характерную для плевропневмонии в естественных условиях.
Подбор питательной среды
При выборе оптимальной питательной среды использовали метод глубинного культивирования. Бактерии A.pleuropneumoniae выращивали на различных питательных средах, при этом изучали динамику роста и основные параметры: удельную скорость роста, время удвоения живых микробных клеток, время культивирования и накопление возбудителя в питательной среде.
Процесс периодического глубинного культивирования осуществляли в аппарате "Фермус" с перемешиванием питательной среды при 700 об/мин и температуре 37С в течение 12 часов.
Для культивирования бактерий A.pleuropneumoniae использовали следующие питательные среды: бульон на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с концентрацией аминного азота 125 мг% и 250 мг% (ТГХ 1 и ТГХ 2), соево-казеиновый бульон (СКБ), бульоны на основе панкреатического и триптического гидролизата казеина (ПГК и ТГК).
В качестве V-фактора роста использовали свежеприготовленный дрожжевой экстракт в количестве 10% от общего объема. В питательные среды дополнительно вносили 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и 0,3% глюкозы в виде 40%-ного раствора
Расплодочным материалом служили 15-16 часовые агаровые культуры бактерий A.pleuropneumoniae "Ш-1" ресуспендированные в стерильном ФБР.
Концентрацию живых микробных клеток определяли сразу после внесения расплодочного материала в питательные среды и через каждые 2 часа в процессе всего культивирования.
Анализ рисунка 9 показал, что наиболее высокие показатели удельной скорости роста в период экспоненциальной фазы были при использовании питательных сред на основе ТГХ 1, ПГК, ТГК и ТГХ 2 - 1,043±0,045, 1,037±0,021, 1,031±0,012 и 1,019±0,024 ч1, а среднее время удвоения концентрации живых микробных клеток у таких культур составляло - 0,66, 0,67, 0,67 и 0,68 ч, соответственно. При культивировании штамма "Ш-1" на данных питательных средах экспоненциальную фазу роста наблюдали на протяжении б часов, а накопление возбудителя составляло - 10,02±0,07, 10,00±0,16,10,00±0,3 и9,98±0,25 lg КОЕ/см3.
При культивировании штамма "Ш-1" на питательной среды СКБ отмечали незначительное снижение показателя удельной скорости роста (i=0,978±0,l ч"1) и увеличение времени удвоения микробных клеток (td=0,72 ч). При использовании СКБ накопление бактерий составляло 9,57±0,21 lg КОЕ/см3, а продолжительность экспоненциальной фазы роста находилась в пределах 6 часов.
Ростовые свойства различных питательных сред были также изучены при культивировании штамма "К-2". Результаты экспериментов показали, что основные параметры роста штамма "К-2" и штамма "Ш-1" существенных различий не имеют (рис.10). Так, при культивировании штамма "К-2" на СКБ отмечали более низкое накопление бактериальной массы (Х=9,5О±0,01 lg КОЕ/см), что видимо обусловлено уменьшением удельной скорости роста (ц=0,955±0,06 ч"1).
При использовании питательных сред на основе ТГХ 1, ТГХ 2, ПГК и ТТК удельная скорость роста была примерно одинакова - 1,054±0Д4, 1,016±0,042, 0,997±0,019 и 1,031±0,04 ч"1, а среднее время удвоения концентрации живых микробных клеток у таких культур составляло - 0,66, 0,68, 0,69 и 0,67 ч, соответственно. При культивировании штамма "Ш-1" на данных питательных средах экспоненциальную фазу роста наблюдали на протяжении 6 часов, а накопление возбудителя увеличивалось до 9,98±0,23, 10,00±0,36, 10,00±0,05 и 9,97±0,32 lg КОЕ/см3, соответственно.
Полученные данные указывают на то, что питательные среды, приготовленные на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру, панкреатического и триптического гидролизата казеина являются наиболее перспективными для наработки бактериальной массы А.ріеигорпеитопіає. Учитывая тот факт, что штаммы "Ш-1" и "К-2" имели одинаковые параметры роста на данных питательных средах в дальнейшей работе нами использована питательная среда на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с концентрацией аминного азота 250 мг%.
Изучение антигенных и иммуногенных свойств опытных образцов инактивированных противоактинобациллезных вакцин на свиньях
Изучение антигенных и. иммуногенных свойств опытных оібразцов инактивированных эмульсионных моновакцин проводили путем однократношиммунизации поросят 35-50 суточного возраста с последующим исследованием сывороток крови на наличие специфических антител и контрольным заражением. Животных иммунизировали внутримышечно, в области шеи моновакцинами, содержащими 6.0 млрд. м.к. и трехкратными последовательными разведениями в плацебо 1:3, 1:9; 1:27 в объеме 0,5 см3. Группу контрольных животных не вакцинировали.
При изучении антигенных свойств вакцин у поросят до вакцинации, а также через 20 суток после вакцинации отбирали кровь и определяли титры специфических антител вфеакции агглютинации. Результаты исследования антигенной активности вакцин представлены в таблице 16.
Из данных таблицы 16 видно, что опытные образцы вакцин вызывают выработку специфических антител в организме привитых животных, в то время как у контрольных животных, в ходе проведения исследований, титры антител оставались без изменений. Уровень антител у поросят до вакцинации опытными образцами вакцин составлял в РА 3,53±0Д9 - 4,32±0,24. Следует отметить, что титр специфических антител не имел существенных различий среди групп животных вакцинированных разными образцами вакцин. Уровень антител в среднем составлял для образцов №1, 2 и 3 - 8,41±0,26, 8,53±0,15, 8,5 8±0,27Tog2 соответственно.
Через 21 сутки иммунизированных, и контрольных поросят заражали интраназально \ минимальной смертельной, дозой культуры A.pleuropneumoniae штамма "Ш-1", величина которой; была определена в предварительных опытах.и составляла-1,0х109 м.к. і.
За животными наблюдали в течение 10 суток после заражения. Результаты определения иммуногенности опытных образцов вакцин представлены в таблицах 17, 18 и 19.
Из результатов, представленных в таблицах 17 и 18, видно, что в группах №1 и 2 все животные после заражения минимальной смертельной дозой были живы. Спустя сутки после заражения у поросят наблюдали незначительное угнетение, повышение температуры тела до 41-41,5С и кратковременный отказ от корма. На 3 сутки общее клиническое состояние поросят данных групп нормализовалось, повышение температуры тела не отмечалось.
В группах животных, иммунизированных образцами вакцин с концентрацией антигена 0,7 и 0,2 млрд. м.к. в дозе, наблюдали угнетение, плохое поедание корма и повышение температуры тела до 41,5-42С. Спустя 1-2 суток наблюдали гибель двух поросят в группе №3 и одного в группе №4. При вскрытии павших животных регистрировали серозное и серозно-геморрагическое Боспаление сердечных и диафрагмальных долей легкого. Из проб легких павших поросят была выделена исходная культура штамма "Ш-Г.
Из результатов, представленных в таблице 19 видно, что животные, иммунизированные вакциной с концентрацией антигена 6,0 и 2,0 млрд. м.к. в дозе, были устойчивы к контрольному заражению. У поросят данных групп в течение первых суток после заражения отмечали угнетение, плохое поедание корма и повышение температуры тела до 41,5С. Состояние животных нормализовалось на 2-3 сутки.
В группах № 3 и 4 спустя 1-3 суток наблюдали гибель 2 и 4 поросят соответственно. При вскрытии павших животных регистрировали серозное и серозно-геморрагйческое воспаление сердечных и диафрагмальных долей легкого. Культуру штамма "Ш-1" удалось выделить от всех павших животных.
Анализ результатов опытов по изучению иммуногенной активности моновакцины, содержащей культуру штамма "Ш-1", инактивированную аминоэтилэтиленимином на свиньях показал, что значение ИМД50 составляет 0,05±0,0032 см3 (0,63±0,036) х109 м.к.
По результатам проведенных опытов видно, что доза антигена 2.0 млрд. м.к. каждого образца вакцины обеспечивала защиту всех животных в группах от гибели. В прививном объеме исследуемых вакцин содержалось 4 ИмД50. Контрольные животные погибали в первые сутки после заражения минимальной смертельной дозой возбудителя от сверхострой формы актинобациллезной плевропневмонии. Диагноз был подтвержден результатами патологоанатомического вскрытия и бактериологического анализа.
Таким образом, на основании проведенных исследований установлено, что опытные образцы вакцин, полученные с помощью формальдегида, бета-пропиолактона и аминоэтилэтиленимина обладают высокой антигенной и иммуногенной активностью для свиней.
