Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Таксономическое положение хламидии 10
1.2. Биологические свойства хламидии 13
1.2.1. Фенотипическая характеристика 13
1.2.2. Геномика хламидии 17
1.3. Бактериоскопические, вирусологические и иммунологические методы
диагностики хламидиоза 20
1.4. Молекулярно-генетическая диагностика хламидиоза 28
1.4.1. ПЦР-диагностика хламидийных инфекций 36
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1. Штаммы хламидии, подопытные животные и клинический материал 44
2.2. Очистка и концентрирование хламидии, выделение ДНК 45
2.3. Полимеразная цепная реакция 50
2.4. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов амплификации фрагментов ДНК хламидии 51
2.5. Секвенирование участков генома хламидии и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 52
2.6. Выделение и идентификация нового штамма хламидии 53
2.7. Изучение биологических свойств изолированного штамма хламидии 55
2.7.1. Патогенность 55
2.7.2. Токсичность 56
2.7.3. Антигенность 56
2.7.4. Иммуногенность 57
2.8. Серологические реакции 57
2.9. Статистическая обработка результатов исследований 60
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61
3.1. Молекулярно-генетические исследования штаммов хламидии 61
3.1.1. Индикация хламидии в ПЦР по л оку су ompl-гена с праймерами 5GPF и 3GPB и их идентификация путем анализа ПДРФ 63
3.1.2. Индикация хламидии в ПЦР по локусу отр2-гена с праймерами Chi и Ch2 и их идентификация методом анализа ПДРФ 65
3.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов 67
3.3. Выделение нового штамма хламидий от кошек 72
3.4. Биологические свойства вновь выделенного штамма хламидий 75
3.4.1. Патогенность изолята хламидий для куриных эмбрионов, лабораторных животных и кошек 75
3.4.2. Токсичность штамма хламидий изолированного от кошек 81
3.4.3. Антигенные свойства изолята хламидий 81
3.4.4. Иммуногенные свойства изолята хламидий 82
3.5. Молекулярно-генетические исследования нового штамма хламидий 83
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 85
5. ВЫВОДЫ 96
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 98
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 100
Ссылки на сайты Internet 123
- Биологические свойства хламидии
- Секвенирование участков генома хламидии и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей
- Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов
Введение к работе
Актуальность темы. Хламидиоз - контагиозная болезнь человека и животных, которая характеризуется широким спектром клинических проявлений заболевания - абортами, мертворождениями, рождением нежизнеспособного приплода, пневмониями, конъюнктивитами, энтеритами, артритами, энцефалитами, уретритами и другими клиническими признаками. Частое латентное, стертое или хроническое течение инфекционного процесса при хламидиозе, значительно усложняет контроль хламидийных энзоотии. Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Кроме того, возбудитель хламидиоза -внутриклеточный паразит со своеобразным циклом развития, геномика которого в настоящее время является перспективным объектом исследований микробиологов [187].
Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий - ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, секвенирование ДНК и другие [117,135,147, 148,149, 150,151, 152].
На сегодняшний день таксономия и классификация хламидий постоянно совершенствуется, главным образом благодаря анализу генома микроорганизма [117, 135, 147]. По мнению некоторых исследователей в настоящее время изучаются штаммы, которые являются кандидатами на регистрацию новых видов хламидий.
Современная таксономия хламидий базируется на нуклеотидной последовательности консервативных видоспецифичных генетических маркеров - 16S и 23 S фрагментов РНК, хотя для классификации видов хламидий также
пригодны гены, кодирующие белки наружной мембраны (ompl и отр2) хламидий[117, 135, 147, 151, 208], что позволяет более точно характеризовать виды хламидии по генетическому признаку.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлись молекулярно-генетические исследования штаммов хламидии на предмет их таксономической принадлежности, на основании сравнительного анализа участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и отр2) возбудителя.
В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:
протестировать протоколы ПЦР-амплификации фрагментов ompl- и отр2-генов хламидии с использованием электрофоретического анализа продуктов реакции, при выделении ДНК возбудителя из клинических образцов;
определить нуклеотидную последовательность амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидии штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;
произвести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и отр2) у разных штаммов хламидии;
провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков генома хламидии штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;
изолировать новый штамм хламидии от кошек, изучить его биологические свойства.
Научная новизна. Подобран регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидии для праймеров: Chi и Ch2, 5GPF H3GPB.
Показана возможность дифференциации хламидии внутри вида путем электрофоретического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле.
Впервые определены нуклеотидные последовательности
амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидии штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93».
Впервые проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов хламидии («Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»).
Изолирован новый штамм хламидии от кошек при конъюнктивите, а также изучены его биологические свойства.
Практическая ценность. Апробированы молекулярно-генетические методы, позволяющие дифференцировать хламидии как внутри рода, так и внутри вида.
Полученные результаты могут быть использованы для определения видовой принадлежности штаммов хламидии в медицинских и ветеринарных лабораториях. Данные опубликованы в глобальной электронной базе данных European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия; GenBank (NCBI), США; DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония.
Результаты исследований позволили подтвердить хламидийную природу коньюнктивитов среди поголовья кошек в г. Казани. Изолированый при этом штамм возбудителя хламидиоза обладает выраженными антигенными и иммуногеными свойствами.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина домашних животных" (Казань, 2005 и 2006 гг.);
Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (2004-2006 гг.);
Научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (Казань, 2006 г.);
XIV Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2006 г.).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.
Основные положения, выдвигаемые для защиты;
протоколы полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами для эффективной индикации и идентификации хламидий;
рестрикционная картина и нуклеотидная последовательность фрагментов генома хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»; филограммы хламидий, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ompl- и отр2-генов;
характерные биологические свойства нового штамма хламидий,
изолированного от кошек. Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2003", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 220 источников, в том числе 118 иностранных и 12 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую ценность работы.
Биологические свойства хламидии
Впервые морфологию возбудителя и его цикл развития описали Bedson S.P. и Bland J.O. [98], изучая хламидий при помощи светового микроскопа. Позже для исследования стали применять микрокиносъемку и электронный микроскоп [40,41,94, 140,143].
Хламидий существуют в двух формах: элементарные и ретикулярные тельца. Элементарные тельца (ЭТ) - внеклеточные формы, обладающие инфекционностью и не способные на этой стадии к размножению; ретикулярные тельца (РТ) - внутриклеточные формы, не обладающие инфекционностью, но способные к размножению.
Элементарное тельце имеет вид сферы диаметром 0,15-0,2 мкм. Снаружи они ограничены двумя трехслойными мембранами (толщина каждой равна 8 нм). Клеточная стенка ответственна за ригидность телец, сохранения формы сферы внутри и вне клеток хозяина. В центре элементарных телец находится плотный непрозрачный нуклеоид и менее плотная структура по периферии. Нуклеоид располагается эксцентрично; остальная часть телец состоит из плотного вещества, в котором содержатся рибосомы [52, 161, 208, 209, 210].
ЭТ окрашиваются в красный цвет по модифицированному методу Стемпа и Маккиавелли, в фиолетово-красный - по Романовскому-Гимзе и синий - по Костанедо. При окраске по Граму они отрицательны.
Ретикулярное тельце имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий размером около 1 мкм. Они отличаются полиморфизмом, не имеют оформленного нуклеоида. Внутри их имеются сложная система мембран, которая составляет единое целое с внешними мембранами, представляющие завитки сетчатой структуры; авторы считают их лизосомами [111,184].
По Романовскому-Гимзе и Маккиавелло РТ окрашиваются в синий и голубой цвет, что говорит об их выраженной базофильности [120, 121].
Процесс размножения хламидии начинается после проникновения элементарного тельца в клетку. По данным Friis R.R. [127] возбудитель сам стимулирует фагоцитоз.
Проникновение элементарных телец хламидии в клетку происходит в две стадии. Первая - адсорбция на поверхности клетки-хозяина, вторая - эндоцитоз. В составе хламидии обнаружены такие компоненты, которые способствуют эндоцитозу их в клетку и выживанию там [115, 169]. В клетке хламидии подавляют защитный механизм, проявляя специфическую активность, направленную против слияния лизосом с фагоцитарной вакуолью [106]. Из поверхностной мембраны клетки-хозяина вокруг элементарной частицы образуется вакуоль, которую от воздействия лизоцимов защищает дериватная мембрана. Здесь элементарные тельца, увеличиваясь, преобразуются в ретикулярные тельца [12, 185, 186]. Armstrong J.A. [91] наблюдал их репликацию бинарным способом, при чем перетяжка при делении напоминает процесс простого отщепления. После окончания начальной фазы цикла развития ретикулярные тельца путем почкования или фрагментации материнской клетки реорганизуются в элементарные.
Выход инфекционного потомства составляет от 200 до 1000 на одно элементарное тельце. Для этого ретикулярное тельце должно поделиться от 8 до 10 раз, т.е. пройти 10 клеточных циклов во время одного цикла развития [56].
Наиболее сложны по химической структуре оболочки хламидии. При их частичном растворении высвобождается материал, идентифицированный как белково-углеводно-липидный комплекс с молекулярной массой от 400 до 500кД. Содержание белка в этом соединении достигает 50%, углеводов - 40%, липидов - 9%. В составе белков присутствуют все аминокислоты, кроме аргинина и гистидина, фосфолипиды представлены в виде лецитина и нейтральных жиров, углеводы богаты гексозамином [33,132, 147,153].
По результатам исследований Jenkin Н.М [145] в оболочке хламидии имеется мурамовая кислота, что делает их чувствительными к действию пенициллина [185]. Некоторые виды хламидии чувствительны к сульфаниламидам, что обуславливается наличием у них ферментов, участвующих в синтезе фолиевой кислоты [103].
Обращает на себя внимание уникальное семейство белков, расположенных на наружной поверхности внешней мембраны хламидиальной клетки. Сопоставление видов Chi. psittaci, Chi. trachomatis и Chi. pneumoniae обнаруживает большое количество паралогов этих белков, что не вполне логично при маленьком геноме [138].
Генетический аппарат элементарного тельца представлен одной гигантской молекулой ДНК, упакованной в нуклеоид, РНК содержится в рибосомах [135,147,148,149,206].
Длительное время считалось, что хламидии являются облигатными внутриклеточными энергетическими паразитами, использующими метаболическую энергию эукариотической клетки в виде АТФ, ГТФ и других макроэргических соединений [124, 151, 152]. В настоящее время анализ генома показал, что хламидии способны синтезировать АТФ, хотя и в незначительных количествах, путем гликолиза и расщепления гликогена. Некоторые факты, обнаружены в ходе исследований, не нашли своего объяснения в связи с тем, что хламидии в процессе приспособления к внутриклеточному паразитизму выработали уникальные структуры и биосинтетические механизмы, не имеющие аналогов у других бактерий. У хламидии отсутствует пептидогликан - компонент клеточной стенки, существующий как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий, но при этом в геноме содержатся гены, кодирующие белки, которые необходимы для его полного синтеза [187]. В отличие от вирусов хламидии содержат оба типа нуклеиновой кислоты - РНК и ДНК. Количество ДНК является величиной сравнительно постоянной и составляет 3-3,5%; содержание РНК меняется в пределах от 2 до 7% в зависимости от стадии развития хламидии [147].
При изучении полипептидного состава антигенов хламидии исследователи установили от 12 до 20 основных полипептидов с молекулярной массой от 10 до 110 кД [95, 96, 122, 146]. При этом отмечалось, что наиболее важными в дифференциации видов и внутривидовых серовариантов хламидии являются полипептиды с молекулярными массами 14, 21, 31, 45, 66, 92 кД [57,146,181].
Подробного изучения требует открытая у хламидии система секретирования типа III. Эта система не только осуществляет экспорт белков из грамотрицательных бактерий, но и усиливает их проникновение в хозяйскую (эукариотную) клетку, с которой контактирует бактерия. Система экскреции типа III позволяет инвазировать клетку хозяина и разрушать ее защитные механизмы. Эта система известна для многих грамотрицательных патогенов у растений и животных: ее гены консервативны, а субстраты, которые секретируются непосредственно в хозяйскую клетку, по-видимому, уникальны для каждого вида. Исключительно важными, не только в патогенетическом, но и общебиологическом аспекте представляются будущие исследования, направленные на проверку предположения о секретировании системой III в клетку хозяина фактора, ингибирующего апоптоз (запрограммированную гибель) этой клетки [138].
Важную роль в развитии хламидийной инфекции играет Са : было показано, что обработка клеток, инфицированных хламидиями, антагонистами кальция приводит к ингибированию трансформации элементарных телец в ретикулярные. Кроме того, обнаружено, что слияние лизосом с фагосомами, содержащими хламидии, является Са -зависимым событием [195]. Важным патогенетическим фактором хламидийной инфекции является способность возбудителя к персистирующему существованию, что подразумевает длительное сохранение хламидий без выраженного роста и размножения в состоянии равновесия с клеткой-хозяином [15]. Приостанавливаются метаболические процессы, возбудитель становится нечувствителен к антибактериальным препаратам. Считается, что при персистенции исключается передача инфекции половым путем [36]. Проблема состоит в том, что при реверсии в обычные формы у больного в органах в любое время может развиться воспалительный процесс, и он станет источником возбудителя инфекции.
Секвенирование участков генома хламидии и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей
Амплификацию участков генома хламидий проводили в программируемом термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия).
Фрагменты отр2-гена хламидий были амплифицированы в объемах 20 мкл. Реакционные смеси содержали по 1 мкл полученного раствора
Chi и Ch2 обрабатывались 1 U Alul (НПО «СибЭнзим») при температуре 37С в течение 6 часов (10 мкл ПЦР-продукта, 7,0 мкл (ІНгО, 2,0 мкл Юхбуфера, Ш/мкл Alul). ПЦР-продукты, амплифицированные с праймерами GPF5 и GPB3 обрабатывались 10 U НаеШ (НПО «СибЭнзим») при температуре 37С в течение 6 часов (10 мкл ПЦР-продукта, 7,0 мкл dH20, 2,0 мкл Юхбуфера, Юи/мклНаеШ).
Для регистрации результатов молекулярно-генетических исследований из проб удаляли минеральное масло. Продукты амплификации смешивали с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н20) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносили в лунки 2,5% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 15 В/см в течение 1,5-2 часов с последующей визуализацией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (290-3 ЗОнм) и цифровым фотографированием, используя оранжевый светофильтр. Образовавшиеся продукты амплификации идентифицировали относительно положительного контроля и используя ДНК-маркеры 100-1500 п.н.
Секвенирование продуктов амплификации отр2-гена с праймерами Chi и Ch2 и отрі-гена с праймерами 5GPF и 3GPB штаммов хламидий «Ростиново-70», «250» «ПП-87» и «КС-93» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».
Секвенированные последовательности исследованных штаммов хламидий отр2- и ompl генов были проанализированы в сравнении с опубликованными геномами штаммов 6 видов рода Chlamydophila (Chlph. psittaci, Chlph. abortus, Chlph. felis, Chlph. caviae, Chlph. pneumoniae и Chlph. pecorum), используя программу CLUSTAL W (v. 1,83) Multiple Sequence Alignments [220]. При построении филограмм использовали алгоритм NJ. Код входа в базы данных Генбанка (англ. GenBank accession number- A/N): последовательности ompl- гена соответственно- Х56980, М73037, AF269282, NC_000922, М73034; последовательности отр2-гена соответственно - М61116, U76760, AF367407, U41759, U76761, Х53511.
При выделении хламидий первичным инфекционным материалом служили: соскобы с конъюнктивы больной кошки. Из клинического материала готовили 20% суспензии на 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) или на мясопептонном бульоне. С целью предупреждения развития сопутствующей микрофлоры в суспензию добавляли стрептомицин (500 мкг/мл) и гентамицин (150 мкг/мл). Материал для заражения выдерживали с антибиотиками при комнатной температуре 1-2 часа или при температуре 4С в течение 16-18 часов. После чего заражали развивающиеся куриные эмбрионы в желточный мешок в дозе 0,3 мл.
Для инфицирования брали эмбрионы 6-7 дневного возраста, овоскопировали, отмечая при этом границу воздушного пространства (пуги) и расположение зародыша. Непосредственно перед заражением скорлупу в отмеченной области дезинфицировали 70 этиловым спиртом и обжигали. Материал для заражения вводили в желточный мешок через отверстие, проделанное специальным пробойником в центре пуги. Поместив яйцо горизонтально, иглу проводили параллельно его длинной оси на глубину 3-3,5 см, при этом предварительно отмеченный зародыш должен был располагаться в нижней точке от вводимой иглы. Отверстие в скорлупе заливали парафином.
Инкубацию эмбрионов проводили при температуре 37С в термостате с увлажненной атмосферой. На третий день овоскопировали зараженные эмбрионы, отбирали погибшие и уничтожали их (неспецифическая гибель).
Эмбрионы, павшие в последующие дни, выявляемые при ежедневном осмотре, вскрывали, из них извлекали желточные мешки.
Для морфологической идентификации хламидии в инфицированных куриных эмбрионах готовили из кусочков желточных мешков мазки-отпечатки и окрашивали их модифицированным методом Стемпа, который заключается в подсушивании препарата на воздухе, фиксировании его над пламенем спиртовки, нанесении карболфуксина в разведении 1:5 на дистиллированной воде. После 15 минутной выдержки мазок промывали дистиллированной водой. Для дифференциации микроорганизмов мазок обрабатывали 0,05% раствором серной кислоты и после минутной экспозиции снова промывали дистиллированной водой. Затем подсушивали и наносили раствор малахитовой зелени в разведении 1:100, после 25- 30 секунд выдержки краску смывали. Микроскопию осуществляли под иммерсионной системой светового микроскопа (увеличение микроскопа х900). В положительных случаях хламидии выявлялись в виде красно-фиолетовых, мелких образований на зеленовато-синем фоне препарата.
Вскрытые куриные эмбрионы проверяли на отсутствие бактериального загрязнения путем световой микроскопии и посева на питательные среды: МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, среду Сабуро. Кроме последней среды, все посевы выдерживали 10 дней при температуре 37С, а посевы в среду Сабуро оставляли на этот же срок при комнатной температуре. В случае отсутствия элементарных телец хламидии в мазках-отпечатках и гибели эмбрионов, прибегали к двум слепым пассажам. При отрицательных результатах микроскопирования и отсутствия гибели КЭ считали, что исследуемый материал не содержит хламидии.
Инфекционные свойства исследуемых штаммов поддерживали последовательными пассажами их на куриных эмбрионах. Материал для следующего пассажа отбирали методом световой микроскопии мазков, полученных с желточных мешков павших в предыдущем пассаже КЭ. Инфекционный титр штамма хламидий определяли по методу Reed L. и MuenchH. [189].
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов
Нуклеотидные последовательности амплифицированных участков ompl-гена штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» имели между собой 100% гомологию. Поэтому при филогенетическом анализе были использованы полученые нами данные по сиквенированию фрагментов ДНК штамма хламидий «Ростиново-70».
Гетерогенность указанного штамма хламидий с официально зарегистрированным видам рода Chlamydophila по нуклеотидной последовательности фрагментов отр2- и ompl-генов представлены в таблице 6.
Филогенетический анализ выравненных последовательностей фрагментов ompl- и отр2-генов штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - Chlamydophila abortus - составляет соответственно 14 и 1,36%.
Секвенированные продукты амплификации ompl-гена с праймерами 5GPF и 3GPB и отр2-гена с праймерами Chi и Ch2 штаммов хламидий «Ростиново-70», «250» «ПП-84» и «КС-93» были подвергнуты филогенетическому анализу. Нуклеотидные последовательности фрагментов отр2- (длиной 587 пн) и ompl- (длиной 1378 пн) генов указанных штаммов были выравнены с таковыми шести штаммов, представляющих официально зарегистрированные виды рода Chlamydophila, используя программу CLUSTAL W (v. 1,83) Multiple Sequence Alignments [220] (рисунки 4 и 5).
Выделение и идентификация возбудителя заболевания - основной этап в доказательстве наличия инфекции.
Основываясь на позитивных предварительных серологических исследованиях кошек в отношении хламидийных инфекций, проведённых в г. Казани, нами были предприняты попытки выделить новый штамм хламидий, вызывающие у кошек конъюнктивиты. В качестве клинического материала для выделения возбудителя хламидиоза были использованы смывы с конъюнктивы у кошки с признаками острого коньюнктивита.
Из клинического материала готовили 10% суспензию на 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,2) с последующей обработкой стрептомицином (500 мкг/мл) и гентамицином (150 мкг/мл). Контакт с антибиотиками длился 2 часа при комнатной температуре. Инфекционным материалом заражали 6-7-дневные развивающиеся куриные эмбрионы полученные из птицеводческих хозяйств, благополучных по респираторному микоплазмозу и орнитозу, заражение производили в желточный мешок. В первые три дня после заражения, куриные эмбрионы овоскопировали на предмет неспецифической гибели. Овоскопию производили два раза в день утром и вечером.
Хламидии были выделены на развивающихся куриных эмбрионах в первом же пассаже, штамм был назван «КК-05» («Казанский кошачий - 2005 года выделения»), специфическая гибель в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения. Погибшие зараженные КЭ оказались бактериологически стерильными. При вскрытии отмечали гиперемию, отек желточного мешка и ХАО, а также множественные кровоизлияния в области головы и конечностей эмбриона. При микроскопировании мазков-отпечатков, приготовленных из кусочков желточного мешка павших эмбрионов и окрашенных по модифицированному методу Стемпа (увеличение микроскопа 900), выявлялись фиолетово-красные элементарные тельца кокковидной формы на зеленовато-синем фоне препарата (рисунок 7).
При окраске мазков-отпечатков флуоресцирующими иммуноглобулинами в цитоплазме клеток обнаруживали специфическое свечение антигена хламидии.
Приведенные в таблице 7 данные свидетельствуют о принадлежности штамма микроорганизмов «КК-05» к хламидиям.
Учитывая результаты выделения и идентификации в РИФ и РСК, а также данные вирусологических исследований, выделенный штамм микроорганизмов был отнесен к роду Chlamydophila.
В настоящее время штамм адаптирован к размножению в развивающихся куриных эмбрионах, прошел 15 пассажей, для длительного хранения хламидиосодержащий материал указанного штамма был подвергнут лиофилизации. Инфекционный титр нативного материала штамма «КК-05» составил 10"5 5ЭЛД5о/0,3 мл.
Таким образом, нашими исследованиями доказана этиологическая роль хламидий в патологии слизистых оболочек глаз у кошек в г. Казани.