Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Хламидиозная инфекция широко распространена среди всех видов млекопитающих и птиц, наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств. Распространенность возбудителей хламидиоза в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (Покровский В.И., 1982; 1983; А.З. Равилов с соавт., 1984; Ю.Д. Караваев, 1987; J.Storz, 1988; ААШаткин, 1990; D.Vanrompay et al., 1995; А. Meijeretal., 1998).
Особенностью хламидийной инфекции, значительно усложняющей
эпизоотологический контроль за ней, является часто хроническое, со
стертой клинической картиной или латентное течение. Поэтому, в системе
проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной
специфической профилактике, а также лечению хламидиоза животных и
людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное
обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью
на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных
методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов. В настоящее
время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала и необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени (Вяянанен П., 1987; A.J.Herring, 1993; D.Vanrompay et al., 1995; CM. Black, 1997; R.S. Stephens, 1999).
В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое распространение получил иммунологический метод, основанный на выявлении антигенов хламидий непосредственно в клиническом материале с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. Данный метод не требует много времени для исследования, а также наличия живого возбудителя в пробе и позволяет выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях (А..В.Кутлин с соавт.,1990; A.Andersen, 1991; A.J.Herring, 1993; M.Domeika et al., 1994;
H.T.Daugharty et al., 1997; CM. Black, 1997; R.S. Stephens, 1999). Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к C.psittaci и разработка на их основе диагностикума для внедрения в практику - является актуальной задачей отечественной ветеринарии.
Однако общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих штаммов (K.D.E. Everett et al., 1999; F.R. Rurangirwa et al., 1999).
В настоящее время в микробиологии получили широкое применение молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний,по особенностям их генетической структуры. Их применение для характеристики хламидий позволяет устанавливать внутривидовые различия между штаммами микроорганизмов по особенностям нуклеотидного состава ДНК, характеризовать штаммовый состав популяции и следить за распространением инфекции (R.G.Hewinson et al., 1991; S.M.Holland et al., 1992; A. Meijeret al., 1997; S.Morre et al., 1998; K.D.E:Everett et al., 1999).
> Одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации — метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий (D.R. Pollard et al., 1989; J.D.Corcish, B.J. Bevan, 1991; Rasmussen S.J., Timms P., 1992; B.Kaltenboeck et al., 1992; 1993; T.O.Messmer et al., 1997; K.D.E. Everett et al., 1999; F.R. Rurangirwa et al., 1999). Дополнительная информация о разновидности возбудителя, получаемая методом ПЦР, позволяет проводить эпизоотологическии контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий. Однако завышенная стоимость импортных ПЦР-наборов не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения хламидий является актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить биологические свойства хламидий, разработать тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза и определить внутривидовые различия между штаммами хламидий.
Основные задачи исследования:
Выделить штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучить их биологические свойства;
Провести электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучить характер взаимодействия
возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами;
Получить моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам C.psittaci и изучить их биологические свойства;
Разработать на основе моноклональных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом экспериментальный диагностический препарат для выявления хламидии методом прямой иммунофлюоресценции;
Сравнить эффективность полученного диагностикума с аналогичным коммерческим препаратом зарубежного производства;
Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики хламидиоза у животных;
Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.psittaci в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;
Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.pecorum в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных;
Адаптировать метод генотипирования - рестрикционный анализ и изучить возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидии.
1.3. Научная новизна работы. Впервые в РФ выделены и идентифицированы штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак (К-1; С-1), изучены их биологические свойства. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.
Получены лимфоцитарные гибридомы, стабильно секретирующие моноклональные антитела, направленные к родоспецифическим детерминантам C.psittaci, являющиеся основой для создания в РФ современной иммунодиагностики хламидиозов животных.
Выявлены моноклональные антитела, обладающие наибольшей эффективностью при обнаружении хламидийных антигенов в биологическом материале - Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам основного белка внешней мембраны хламидии (МОМР) и обладающие высокой чувствительностью (100 м.к./мл) и 100% специфичностью.
На «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L, используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia» получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.
Впервые в РФ на молекулярно-генетическом уровне изучены и типированы штаммы и изоляты хламидии, выделенные от животных. На
основе анализа 26 последовательностей ДНК гена МОМР хламидий выбраны оригинальные праймеры, позволяющие дифференцировать виды C.psittaci и C.pecorum методом ПЦР. Чувствительность реакции составила 10 геномов бактерий в пробе при фоновой нагрузке ДНК быка, взятой в количестве, эквивалентном 100000 клеток.
Адаптирован метод генотипирования - рестрикционный анализ с применением ПЦР и определены возможности его применения для .внутривидовой дифференциации хламидий. Показано, что популяция хламидийной инфекции у животных гетерогенна по генетической структуре.
1.4. Практическая значимость работы. Предложена и внедрена в ветеринарную практику инактивированная культуральная вакцина против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей, изготовленная на основе штаммов, выделенных нами от естественно зараженных кошек и собак (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве "Chlamydia psittaci К-1 ДЕП" № 87/274 от 22.01.1996 г. и "Chlamydia psittaci С-1 ДЕП" № 86/274 от 22.01.1996 г.
Разработан и впервые внедрен в ветеринарную практику отечественный диагностикум для выявления антигенов хламидий методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в патологическом материале от сельскохозяйственных животных и птиц (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. - продуцент моноклональных антител к Chlamydia депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве с присвоением наименования «Штамм гибридомы Хла-К-1-ДЕП» от 15.04.1996 г.
Впервые в РФ разработаны и внедрены в ветеринарную практику ПЦР-тест-системы для диагностики и идентификации разных видов хламидий, обладающие высокой таксономической специфичностью (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.).
Детекция хламидий методом ПЦР в патологическом материале впервые включена в «Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года и «Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года.
Использование методов ПИФ и ПЦР в диагностических ветеринарных лабораториях, дает возможность быстро и надежно установить диагноз на хламидиоз, что приведет к своевременной эффективной терапии и научно обоснованной профилактике этого заболевания.
Метод рестрикционного анализа с применением ПЦР позволяет получать дополнительную информацию о разновидности возбудителя,
проводить эпизоотологический контроль л предотвратить распространение опасных штаммов хламидий на территории РФ.
1.5. Апробация работы. Основные результаты исследований
доложены на: Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы
биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва,
1996); Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни
молодняка сельскохозяйственных животных" (Москва, 1996);
VIII Международном симпозиуме по ветеринарной лабораторной
диагностике (Иерусалим, 1996); 2-ой Международной научно-практической
конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля
сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1997); Всероссийской научной
конференции "Актуальные вопросы ветеринарно-санитарного обеспечения
в мясной отрасли" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции
"Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних
животных" (С.-Петербург, 1997); 2-ой Всероссийской конференции
"Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения
инфекционных заболеваний" (Москва, 1998); 2-ой Международной
конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (С.-Петербург,
1998); Методических советах по вирусологии ВГНКИ (Москва, 1993-1998);
Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 1999);
3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в
современной медицине" (Москва, 2000)
Диагностические препараты экспонировались в павильонах "Ветеринария" и "Микробиология" ВДНХ РФ и отмечены золотыми медалями.
-
Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 47 статей, в том числе монография "Хламидиоз кошек" (Москва, 1994, 5,4 п.л.). Получены один патент и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Разработаны 5 наставлений по применению, 5 технических условий, 8 методических указаний, наставление по диагностике орнитоза и правила по профилактике и борьбе с орнитозом.
-
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту;
-
Выделение штаммов возбудителей хламидиоза кошек и собак в куриных эмбрионах и культуре клеток;
-
Получение гибридомы - продуцента моноклональных антител к антигенам C.psittaci и разработка диагностического набора методом прямой иммунофлюоресценции;
-
Разработка тест-систем для диагностики хламидиоза и идентификации C.psittaci и C.pecorum у разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;
-
Внутривидовое генотипирование хламидий с помощью рестрикционного анализа.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 351 странице машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, указатель литературы (всего 375 источников, в том числе 298 иностранных). Диссертация иллюстрирована 34 таблицами и 32 рисунками. В приложении представлено 22 документа, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую значимость.