Введение к работе
Актуальность проблемы. Туберкулез сельскохозяйственных .„_-
животных занимает особое место среди инфекционных заболеваний
вследствие опасности его возбудителя для человека и значительного
экономического ущерба,-складывающегося из недополучения
продукции и затрат на проведение мероприятий по его ликвидации. -""' Ситуация осложняется широким распространением во внешней среде нетуберкулезных микобактерий различных видов (Лазовская А.Л., Блохина И.Н., 1976; Кадочкин A.M., 1979; Wayn L., 1971; Portales F., 1988 и др.), что приводит к необоснованной сдаче на убой реагирующих на туберкулин животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями.
В комплексе мероприятий по оздоровлению неблагополучных хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота важное место занимает совершенствование методов диагностики. В настоящее время лабораторная диагностика туберкулеза традиционно основывается на комплексе анализов и тестов по изучению патогенных, тинкториальных, биохимических и других свойств выделяемых культур и требует значительных затрат времени и труда (Благодарный Я.А.,1980).
Кроме того, использование в ветеринарной практике химиотерапевтических средств вызвало в ряде регионов изменение биологии возбудитатя, что также может затруднять его идентификацию.
В этой связи весьма актуальными являются разработка и внедрение в ветеринарную практику новых, чувствительных методов биодетекции и идентификации микобактерий, которые совмещают простоту методики и возможность автоматизации.
Особенно перспективным в этом отношении является метод спектроскопии комбинационного рассеяния света (СКР) (Кэри П.,1985), в частности резонансной спектроскопии КР с возбуждением спектров в ультрафиолетовой области спектра (УФ РКР). Это объясняется уникальными возможностями метода для биодетекции клеток и их компонентов, которые позволяют наблюдать спектры в водных растворах - естественной среде микроорганизмов, исследовать живую клетку и получать информацию о хемотаксономических маркерах без ее дополнительной дезинтеграции и использования при анализе дорогостоящих реактивов.
4 _ До недавнего времени из за отсутствия лазерных источников
требуемого спектрального диапазона ультрафиолетовая область
(<250нм) была малодоступна. Полностью отсутствует методическая
информация по изучению патогенных микроорганизмов in vivo.
Все это определило цели и задачи проведенных исследований.
Цель и задачи исследований. Целью работы было разработать методику исследования живых культур микобактерий лазерной спектроскопией ультрафиолетового резонансного комбинационного рассеяния (УФ РКР). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- получить воспроизводимые спектры микобактерий разных
видов с использованием экспериментальной установки на основе
отечественного приборостроения
провести селективное исследование основных хемотаксономических маркеров микобактерий (белкового и нуклеотидного компонентов) in vivo
- выявить характерные линии спектров и видоспецифические
области для создания банка данных с последующей идентификации
микобактерий на ЭВМ ^ і
провести сравнение лазерной спектроскопии с другими методами исследования. Научная новизна.
1. На базе созданной в лаборатории физико-химических
методов исследования ВНИИВТЖ экспериментальной установки -
лазерного спекторметра УФ РКР - разработана методика исследования
микобактерий in vivo.
2. Изучены культуры микобактерий разных видов.
Отработаны подходы применения метода, установлены
высокоспецифичные области спектров для идентификации
микобактерий.
3. Проведено исследование спектров УФ РКР микобактерий на
разных стадиях роста. Установлена закономерность изменений
спектральных характеристик нуклеотидного компонента микобактерий
в зависимости от возраста.
4. По спектрам УФ РКР выявлены внутривидовые отличия
между микобактериями одного вида.
Практическая и теоретическая значимость работы.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности применения лазерной спектроскопии для идентификации
5 микобактерий.
Продемонстрированы уникальные возможности УФ РКР для изучения электронно-конформационных характеристик биомолекул в-составе живой клетки. Использование лазерной спектроскопии (УФ РКР) позволяет изучать микроорганизмы в рааличных физиологических состояниях, оценивать воздействие лекарственных и дезинфекционных средств, напраштенно отбирать штаммы или их фрагменты для создания диапюстикумов и вакцин.
Разработанная методика открывает возможности
использования УФ РКР для идентификации и изучения любых бактериальных культур.
Апробация результатов работы. По материалам диссертации сделаны сообщения на научных конференциях и заседаниях Ученого совета ВНИИВТЖ (Омск, 1989-1993), Всесоюзной научно-теоретической конференции по биотехнологии в животноводстве (Новосибирск, 1991), 1-ом международном конгрессе по биофизике и биотехнологии (Турция, 1991), на Всероссийском координационном совещании по туберкулезу и бруцеллезу животных (Омск, 1992-1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация иачожена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы.