Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
2.1. Таксономическое положение, распространение и биологические свойства Staphylococcus hyicus 7
2.2. Роль Staphylococcus hyicus в патологии сельскохозяйственных животных и птиц 23
2.3. ПЦР - метод как способ идентификации Staphylococcus hyicus...
III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
3.1. Материалы и методы исследований 33
3.2. Выделение Staphylococcus hyicus из различных источников 58
3.3. Биологические свойства выделенных культур Staphylococcus hyicus 60
3.3.1. Морфологические и культурально - биохимические свойства Staphylococcus hyicus 60
3.3.2. Изучение факторов патогенности Staphylococcus hyicus 64
3.3.3. Исследование патогенности Staphylococcus hyicus для поросят и лабораторных животных 69
3.3.4. Чувствительность культур Staphylococcus hyicus к антимикробным препаратам 76
3.4. Результаты полимеразной цепной реакции при разработке
метода идентификации S. hyicus по обнаружению гена sodA видо-
спицифичной супероксиддисмутазы 78
IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 84
V. ВЫВОДЫ 94
VI. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 96
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97
- Таксономическое положение, распространение и биологические свойства Staphylococcus hyicus
- Роль Staphylococcus hyicus в патологии сельскохозяйственных животных и птиц
- Выделение Staphylococcus hyicus из различных источников
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время повышение эффективности свиноводства сдерживается наличием инфекционных болезней, многие из которых являются ещё недостаточно изученными.
В свиноводческих хозяйствах не редко встречается заболевание с признаками экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) - болезни, Г наносящей существенный экономический ущерб отрасли из - за высокой летальности поросят, снижения прироста массы тела у переболевших животных, значительных затрат на лечебно - профилактические мероприятия. Заболевание протекает в генерализованной форме преимущественно в виде острой или подострой инфекции, чаще у поросят - сосунов или поросят -отъемышей; локализованная форма встречается реже и проявляется в основном у поросят более старшего возраста, а также у подсвинков и откормочных свиней (Э. - Г. Гельвиг, 2003; Е. Sleverding, 1988).
В Европе экссудативный эпидермит свиней ещё в 60 - 70 - х г.г. прошлого века приводил к достаточно большим экономическим потерям в свиноводстве (Е. Sieverding, 1988), хотя и сегодня проблема всё ещё является не решенной.
Возбудителем болезни является Staphylococcus hyicus, который впервые был выделен, описан и назван D. Sompolynsky в 1953 году как Micrococcus epidermidis, а в конце 70-х годов прошлого века стал официально признанным отдельным видом семейства стафилококков (L. Devriese et al., 1978).
Комплексное изучение биологических свойств стафилококков и продуцируемых ими биологически активных веществ лежит в основе представления о патогенезе вызываемых ими заболеваний и является базой, на которой в дальнейшем строится диагностика и разрабатываются схемы профилактики и терапии.
В Определителе бактерий Берджи 1974 года упомянуты только три вида стафилококков: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus epidermidis. С развитием микробиологии, усовер шенствованием традиционных методик лабораторных исследований, появлением иммуно - ферментного анализа и полимеразной цепной реакции в издании того же Определителя 1986 года были описаны 19 видов (W. Kloos и К. Schleifer, 1986), а в издании 1997 года - 23 вида в семействе Staphylococcus. В генном банке NCBI (www.ncbi.nih.gov) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ GmbH, www.dsmz.de) на сегодняшний день представлены 50 видов и подвидов стафилококков.
В нашей стране исследования биологических свойств Staphylococcus hyicus в достаточной мере не проводились, а его роль в этиологии инфекционных заболеваний свиней полностью не изучена.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение биологических свойств Staphylococcus hyicus и его роли в патологии свиней. Исходя из этого, перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить экологию, биологические свойства и чувствительность выделенных культур Staphylococcus hyicus к антимикробным препаратам.
2. Изучить патогенные свойства Staphylococcus hyicus для поросят.
3. Изучить факторы патогенности выделенных культур Staphylococcus hyicus.
4. Разработать метод идентификации Staphylococcus hyicus полимеразной цепной реакцией.
1.3. Научная новизна. Проведены исследования по выделению Staphylococcus hyicus из различных источников, в том числе с кожи здоровых и больных экссудативным эпидермитом поросят, а также от других видов животных.
Изучены биологические свойства и определена in vitro чувствительность 40 штаммов Staphylococcus hyicus к 17 антимикробным препаратам.
Изучены факторы патогенности данных бактерий.
Впервые в Российской Федерации проведено исследование выделенных изолятов S. hyicus полимеразной цепной реакцией на наличие генов, детерминирующих синтез эксфолиативных токсинов exhA, exhB, exhC и exhD.
Обнаружили, что штаммы Staphylococcus hyicus, выделенные от свиней с признаками экссудативного эпидермита в хозяйствах Белгородской области, содержат ген exhD, детерминирующий синтез эксфолиативного токсина D.
Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению полимеразной цепной реакцией гена sodA видоспецифичной супероксиддисмутазы.
Практическая ценность работы. Показано носительство Staphylococcus hyicus несколькими видами сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот, а также птицей), доказана роль Staphylococcus hyicus в патологии свиней.
Разработан метод идентификации Staphylococcus hyicus по обнаружению полимеразной цепной реакцией гена sodA видоспецифичной супероксиддисмутазы.
По материалам работы разработаны «Методические рекомендации по идентификации и определению факторов патогенности Staphylococcus hyicus - возбудителя экссудативного эпидермита (мокнущей экземы) свиней», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30 марта 2006 г. протокол № 1.
1.5. Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на:
- IX и X Международной научно - производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (г. Белгород, 2005 г., 2006 г.);
- Международной научно - практической конференции «Повышение эффективности лечения и профилактики акушерско - гинекологических заболеваний и биотехники размножения животных» (г. Киров, 2005 г.);
- Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (г. Москва, 2006);
( XVIII Международной межвузовской научно - практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2006 г.).
1.6. Публикация. По проведенным исследованиям и материалам настоящей диссертации опубликовано 8 научных статей.
1.7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована одним графиком, одной дентрограммой, четырьмя рисунками, 10 таблицами и 8 фотографиями. Список использованной литературы включает 193 источника, из которых 175 иностранных.
Таксономическое положение, распространение и биологические свойства Staphylococcus hyicus
Род Staphylococcus наряду с родами Micrococcus, Planococcus и Stomatococcus ранее входил в семейство Micrrococcaceae. Все представители , данного семейства являются каталазоположительными (кроме некоторых стоматококков) грампозитивными кокками различного размера (К. Schleifer, 1986; Д.И. Скородумов с соавт., 2004).
С развитием современных методик дифференциации бактерий на основании анализа строения бактериальной клетки и нуклеотидной последовательности ДНК, таксономическое положение стафилококков изменилось. Как известно, пептидогликан клеточной стенки стафилококков содержит тейхоевые кислоты, которых нет у микрококков, а ДНК содержит 30-39 mol% гуанина и цитозина (у микрококков этот показатель значительно выше - 65-75 mol%), есть значительные отличия и в нуклеотидной последовательности 16S - рибосомальной ДНК (G. Alderson, 1985; М. Goodfellow, 1985). Следует отметить, что по трем последним критериям род Staphylococcus был отнесен ближе к группе Bacillus - Lactobacillus -Streptococcus, чем к семейству Micrococcaceae (К. Schleifer, 1986; R. Novick, 1990), а сами микрококки - к группе Arthrobacter (R. Keddie, 1974; Е. Stackebrandt et al, 1980).
В настоящее время род Staphylococcus вместе с другими, менее известными,
родами: Gamella, Macrococcus и Salinococcus, образует семейство Staphylococcaceae (Bergey s Manual, 2001; Todar s Online Textbook of Bacteriology, 2005). Филогенетически наиболее близкими ему являются хорошо известные представители рода Bacillus из семейства Bacillaceae, а также представители семейства Listeriaceae. (Todar s Online Textbook of Bacteriology; http://textbookofbacteriology.net/staph.htlm) Род Staphylococcus
Стафилококки - это неподвижные, каталазоположительные, грампо-зитивные кокки, размером от 0,6 до 1,3 мкм, в мазках располагаются беспорядочно парами, тетрадами или скоплениями в форме виноградных гроздей, являются аэробами и факультативными анаэробами (R. Killper -Baelz и К. Schleifer, 1981; R. De la Fuente et al., 1985; K. Schleifer, 1986).
На данный момент номенклатура бактерий рода Staphylococcus (таблица 1) представлена 50 видами и подвидами, 8 из которых (S. aureus, S. aureus subsp. anaerobicus, S. intermedius, S. pseudintermedius, S. hyicus, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans и S. lutrae) следует относить к коагулазоположительным (или коагулазовариабельным), а остальные 42 вида - к коагулазоотрицательным стафилококкам (G. Foster et al., 1997).
Стафилококки как возбудители болезней животных
Долгое время считалось, что только коагулазопозитивные стафилококки являются патогенными и способны вызывать заболевания, в то время, как коагулазонегативные - сапрофитными и не вызывающими заболевания (С. Annemueller, 1999).
Доказано, что ведущую роль в патологии животных играют три основных коагулазопозитивных вида стафилококков: S. aureus, S. intermedius и S. hyicus.
S. aureus является причиной кожных поражений у разных видов животных, вызывая различного рода пиодермиты и флегмоны. Нередко золотистый стафилококк вызывает у мелкого и крупного рогатого скота острые и хронические маститы, доходящие иногда до гангренозной формы.
S. intermedius чаще выделяется от собак, являясь этиологическим агентом, вызывающим у них отиты, циститы, воспаления кожного покрова и конъюнктивиты (Н. Bloebel и J. Brueckler, 1984; R. Terauchi et al., 2003; К. Yamashita et al., 2005). Но и другие виды стафилококков способны вызывать заболевания животных.
Например, P. Varaldo et. al. (1988) изолировал с пораженной кожи двух дельфинов гемолитически - активный и коагулирующий плазму S. delphini. G. Foster et al. (1997) описал коагулазоположительный стафилококк, выделенный им в большом количестве из трех мертвых выдр и позднее названный S. lutrae.
Не следует пренебрегать и коагулазоотрицательными стафилококками. Давно доказано, что многие виды коагулазоотрицательных стафилококков (чаще всего это S. epidermidis, S. saprophyticus) играют этиологическую роль в развитии у человека эндокардитов, септицемии, циститов и инфекций, развивающихся после установки контаминированных полимерных имплантантов (G. Pulverer и R. Halswick, 1967; W. Noble, 1969; P. Leighton и J. Little, 1986; G. Pulverer et al., 1987; J. Beuth et al., 1992).
В ветеринарии стоит отметить роль коагулазоотрицательных стафилококков в возникновении мастита коров, овец и коз (S. cohnii subsp. cohnii, S. haemolyticus, S. -warned, S. caprae, S. auricularis, S. epidermidis, S. chromogenes и др.), патологий кожи (S. chromogenes, S. saprophyticus, S. sciuri, S. simulans, S. epidermidis), урогенитальных инфекций, респираторных болезней (S. xylosus, S. epidermidis), отитов, раневых инфекций и циститов у кошек (S.felis и S. simulans) и других заболеваний (Н. Сох et al., 1984; R. Brown et al., 1967; 0. Holmberg, 1973; J. Watts и P. Washburn, 1991; G. Martin и A. Bergmann, 1993; L. Devriese et al., 1994; 0. Chesneau et al., 1993; G. Fthenakis et al, 1994; S. Igimi et al., 1989).
Роль Staphylococcus hyicus в патологии сельскохозяйственных животных и птиц
Впервые в мире указания об экссудативном эпидермите (мокнущей экземе) свиней приведены в книге Е. Viborg (1806) «Руководство по откорму и использованию свиней». Немногим позже вышло издание Е. Hering (1842), в котором также отмечена данная патологии. Этиология этого заболевания долгое время была не известна и описывалась только в виде характерных клинических проявлений. Название болезни употреблялось различными авторами как поросячья сажа или мокнущая экзема (по Е. Sieverding, 1988). Дальнейшие исследования были проанализированы и обобщены W. Schulz (1970). В качестве причины данного заболевания автор приводит в пример несколько теорий, существовавших на тот момент: это гормональные нарушения, алиментарная недостаточность, авитаминозы, аллергическая реакция, паразитарный или вирусный факторы, а также совместное воздействие бактериальных и вирусных агентов. Первые достоверные предположения по этому вопросу высказал D. Sompolynsky (1953), описав выделенные им с кожи больных экссудативным эпидермитом поросят бактерии Micrococcus hyicus. Позднее данные предположения были подтверждены N. Undredahl et al., (1965), С. L ecuyer и Н. Jericho (1966), D. Hunter et al. (1970) и W. Bollwahn et al. (1970, 1972). D. Sompolynsky (1953) также обратил внимание на важный факт, что бактерия не проявляет патогенность в отношении лабораторных животных. Эти данные легли в основу теории N. Markham и J. Markham (1966) о том, что большинство стафилококков являются видоспецифичными возбудителями кожных заболеваний.
Стоит также отметить то, что в последнее время в зарубежной научной литературе появились данные о том, что не только S. hyicus может вызывать эксфолиацию кожного покрова поросят. В 2005 году исследователи из Дании (L. Andresen et al.) обнаружили наличие гена, детерминирующго синтез эксфолиативного токсина ехИВ (аналогичного гену ехИВ у S. hyicus) у штамма S. chromogenes VA 654, выделенного в Бельгии в 1979 году с кожи поросенка, у которого наблюдались поражения, схожие с таковыми при экссудативном эпидермите. Экспериментальная инфекция, воспроизведенная авторами данным штаммом на поросятах - отъемышах, также не оставила никаких сомнений, что бактерия обладает токсином, способным вызывать эксфолиацию кожи у данного вида животных.
Патогенез. L. Johnes (1956, 1961) и Н. Behrens (1958) описывают экссудативный эпидермит как спонтанно возникающий генерализованный дерматит, заболевают которым поросята в возрасте от 5 до 35 дней. Различают три возможные формы течения болезни:
сверхострую форму, при которой смерть наступает через три - пять дней после начала клинических проявлений;
острую форму, с менее интенсивными клиническими проявлениями и наступлением смерти животного в течение пяти - восьми дней;
подострую форму, длящуюся три - четыре недели и, как правило, не приводящая к смерти поросят (L. Johnes, 1956).
W. Bollwahn et al. (1970) отмечают, что при всех формах течения болезни зуд у поросят отсутствует. Э. - Г. Гельвиг (2003) напротив, обращает внимание на зуд, возникающий вследствие экссудативного эпидермита, как причину возникновения у поросят каннибализма, поскольку пораженные животные охотно терпят покусывание своими соседями.
В начале болезни происходят дегенеративные изменения в Stratum spinosum кожи, приводящие позже к образованию на поверхности везикул, затем происходит клеточная инфильтрацией эпидермиса и образование каверн (пустул). После этого верхние слои эпидермиса некротизируются (К.-Н. Waldmann и М. Wendt, 2001).
Патолого - анатомические изменения. Патологоанатомические изменения при экссудативном эпидермите концентрируются в основном в верхних слоях кожного покрова.
По данным L. Johnes (1956) и N. Underdahl et al. (1965), небольшие розовые пузырьки, появляющиеся на коже вначале заболевания, зачастую располагаются на верхней челюсти поросят, над глазами, около ушей, в паховой области. С развитием болезни они могут появляться на задних конечностях и в области живота.
Позднее появляются сухие, от желто - коричневого до коричневого цвета струпья (корочки), легко отделяющиеся от тела. При гистологическом исследовании пораженной экссудативным эпидермитом кожи L ecuyer и Jericho (1966) обнаружили разрушение межклеточных связей, а также утолщение слоя эпидермиса в шесть - семь раз. Такие патологические изменения схожи с изменениями при паракератозе.
U. Schmidt et al. (1972) отметили изменения в форме лимфогистиоцитарной инфильтрации эпидермиса. В более поздней стадии болезни они описали подобные изменения и в кориуме. Наряду с патологическими процессами кожи, авторы указывают на незначительные изменения в легких, печени и почках, сильную гиперемии и периваскулярную отечность.
Нарушения при экссудативном эпидермите, вызванном S. hyicus, можно найти также в печени, почках, легких, селезенке, центральной нервной системе и суставах (W. Bollwahn et al., 1970; К. Waldmann и М. Wendt, 2001).
Исследования некоторых ученых указывают на развитие у больных экссудативным эпидермитом поросят полиартрита.
Дифференциальный диагноз. В первую очередь экссудативный эпидермит следует дифференцировать от других заболеваний, характеризующихся поражениями кожного покрова, такими как оспа свиней, паракератоз, грибковых поражений кожи.
Кроме того, данную болезнь стоит отличать также от чумы и рожи свиней, патологий, вызванных кожными паразитами и последствиями каннибализма (К. Eich и U. Schmidt, 2000).
Выделение Staphylococcus hyicus из различных источников
Бактериологическому исследованию на предмет выделения S. hyicus подвергли 371 пробу материала от различных животных, как с патологиями, так и без них, в том числе 328 проб от сельскохозяйственных животных (свиней, поросят и коров), 30 проб от птиц (30 куриц в возрасте 360 - 420 дней), 13 проб от собак.
На наличие Staphylococcus hyicus исследовали: соскобы с кожи поросят с признаками экссудативного эпидермита (78 проб) и здоровых поросят (56 проб), смывы с конъюнктивы глаз поросят (43 пробы), мазки из влагалищной полости свиноматок без признаков патологии (33 пробы), смывы с сосков вымени (33 пробы) от больных маститом коров, мазки слизистой носовой полости поросят (24 пробы), пробы из внутренних органов павших и вынужденно убитых поросят с признаками экссудативного эпидермита (11 проб) и пневмонии (6 проб), пробы молока (9 проб) от больных маститом коров, а также пробы гноя (9 проб) от больных эндометритом коров.
Кроме того, были исследованы смывы конъюнктивы и мазки ротовой полости (30 проб) от куриц без патологии, гной раневого содержимого от собак (5 проб) и коров (11 проб), соскобы с кожи собак (8 проб) и коров (15 проб) без патологии.
В таблице 4 приведена характеристика исследованных нами штаммов по виду животных, от которых они выделены, источнику выделения и клиническим проявлениям, если таковыми данными мы обладали.
Как видно из таблицы, большинство исследованных нами штаммов (36, или 78 %) были выделены от поросят и свиней, из них от поросят с признаками экссудативного эпидермита - 18 штаммов (42 %). От коров с признаками субклинического и клинического мастита и эндометрита выделено 4 (8,6 %) культуры S. hyicus, от птиц без патологии - 1 (2,2 %), от собак без патологии - 1 штамм (2,2 %). Кроме того, стоит отметить, что при отборе проб патматериала с кожи поросят, больных экссудативным эпидермитом, выделяемость данного стафилококка составляла 100 %.
Патогенетическое значение штаммов, полученных нами для исследования из Германии, к сожалению, было не известно. Из 26 штаммов, изолированных в России, только четыре штамма (15,4 %) были получены от животных без явных клинических проявлений каких - либо заболеваний.
Фотография 1. Внешний вид поросенка в возрасте 12-недель, больного экссудативным эпидермитом (ОАО «Бел город се мена», с. Протопоповка, Шебекинский район Белгородской области, июль 2004 года).
Изучение биологических свойств выделенных культур X hyicus показало то, что они обладают многими свойствами, типичными для других представителей рода Staphylococcus.
В данной работе исследованы биологические свойства 43 культур
S. hyicus, 26 из которых были выделены нами в различных животноводческих /25 штаммов/ и птицеводческом /1 штамм/ хозяйствах Белгородской области, а 17 получены из Лаборатории бактериологии Института гигиены и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных Университета Юстуса Либига (г. Гиссен, Германия).
Культуры S. hyicus, изолированные от различных животных и птиц, по культурально - морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам соответствовали своему роду.
Они хорошо росли как на элективных (ЭСА, ЖСА), так и на обычных (простых) питательных средах при температуре +37 С в течение 18-24 часов. На твердых питательных средах (МПА, ЭСА, ЖСА, кровяном агаре) росли в виде округлых, с ровными краями, слабовыпуклых, блестящих колоний, достигающих через 48 - 74 ч культивирования диаметра от 3 до 5 мм. Колонии в первые сутки роста были более крупными на обычных питательных средах - около 2 мм, и более мелкими на средах с содержанием 7,5% NaCl - около 1-1,5 мм. Нередко обсемененность животных бактериями была очень высокой и вся поверхность чашки со средой полностью покрывалась характерными колониями, особенно это касается посевов с кожи поросят, пораженных экссудативным эпидермитом. При культивировании S. hyicus на обычных жидких питательных средах при температуре + 37 С уже через 4 часа в пробирках происходило равномерное помутнение среды, а через 12-14 часов - выпадение небольшого, легко встряхиваемого белого осадка.
В основном они росли в виде чистых культур, особенно при первичном посеве исследуемого материала на элективные питательные среды (ЖСА, ЭСА), которые оказались более благоприятными, по сравнению с обычными (кровяной агар, МПА) питательными средами. Посевы на последних иногда сопровождались загрязнением и трудностью отвивки чистых стафилококковых культур, иногда требовались дополнительные пересевы на ЭСА или ЖСА. По морфологическим свойствам в мазках, окрашенных по Граму, S. hyicus представлял собой кокки (диаметром 0,6 - 1,2 мкм), располагавшиеся беспорядочными скоплениями, по форме чаще напоминающими гроздья винограда, реже попарно или тетрадами, неподвижные, спор и капсул не образовывали, хорошо красились анилиновыми красителями, грамположительные. На морфологию S. hyicus количество пассажей на средах не влияло.
Не выявлено особых отличий и в культуральной характеристике штаммов S. hyicus, выделенных из различных источников. Стоит лишь отметить, что на агаре с содержанием 15 % NaCl рост либо отсутствовал вовсе, либо был слабо заметным. Удовлетворительным можно было назвать рост только штамма RB-1.
После выделения чистых культур стафилококков определяли их биохимические и культуральные свойства. Результаты данных исследований представлены в таблице 5.
Культуры S. hyicus не были термофильными, то есть не росли при температуре+45 С, слабо и медленно развивались при температуре+15 С.
