Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. Международно-правовые аспекты применения анаболических агентов в животноводстве 17
1.2. Стероидные гормоны и производные стильбена: общая характеристика, метаболизм, фармакокинентика и токсикологическая оценка 24
1.3. Общая характеристика, метаболизм и фармакокинетика р-адреностимуляторов 59
1.4. Методы определения анаболических агентов 67
1.5. Заключение 96
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 98
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 98
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 155
2.2.1. Получение иммуногенов для определения анаболических агентов иммунохимическими методами 155
2.2.1,1. Синтез гаптенов анаболиков с функциональными карбоксильными группами 155
2.2.1.1.1. Синтез карбоксипроизводного ДЭС - диэтилстильбэстрол-о-карбоксиметила 155
2.2.1.1.2. Синтез карбоксипроизводных ЭТЭ - 17а-этинилэстрадиол-3-гемисукцината и 3-о-карбоксиметилэтинилэстрадиола 157
2.2.1.1.3. Синтез карбоксипроизводных ТБ - тренболон-17-гемисукцината и 17(3-тренболон-3-о-карбоксиметилоксима 161
2.2.1.1.4. Синтез карбоксипроизводных 19-НТ- 19-нортестостерон-17-гемисукцината и 17р-19-нортестостерон-З-о-карбоксиметилоксима 164
2.2.1.1.5. Синтез карбоксипроизводного МТ~ 17-метилтестостерон-З-о-карбоксиметилоксима 166
2.2.1.2. Коньюгирование карбоксипроизводныхДЭС и синтетических анаболических стероидов с белками-ностителями 167
2.2.1.3. Коньюгирование кленбутерола с белками-носителями 170
2.2.2. Оптимизация условий экспрессного определения анаболических агентов иммунохимическнми методами 171
2.2.2.1. Скрининг активности и специфичности иммунных сывороток 171 2.2.2.2.Выбор твердофазного антигена и оптимизация условий его иммобилизации на носителе 172
2.2.2.3. Проверка чувствительности и специфичности ИФА тест-систем 178
2.2.2.4. Разработка способов подготовки проб биосубстратов для экспрессного определения анаболиков методом ИФА 184
2.2.2.4.1. Определение анаболиков в моче животных методом ИФА 184
2.2.2.4.1.1. Оптимизация условий гидролиза коньюгированных форм анаболических стероидов и производных стильбена в моче животных 185
2.2.2.4.1.2. Экстракция свободных форм стероидов и производных стильбена из мочи животных методом ИФА 188
2.2.2.4.1.3. Определение кленбутерола в моче животных методом ИФА 193
2.2.2.4.2. Определение анаболических стероидов и производных стильбена в мышечной ткани животных методом ИФА 194
2.2.2.4.3. Определение анаболических стероидов и производных стильбена в печени животных методом ИФА 200
2.2.2.4.4. Определение ДЭС в кормах методом ИФА 201
2.2.2.4.5. Определение кленбутерола в мышечной ткани и печени животных методом ИФА 201
2.2.2.4.6. Определение кленбутерола в шерсти животных методом ИФА 202
2.2.2.4.7. Определение кленбутерола в сетчатой оболочке глаза животных методом ИФА 204
2.2.2.4.8. Определение кленбутерола в кормах методом ИФА 205
2.2.3» Разработка подтверждающих (арбитражных) методик определения анаболических агентов в биосубстратах с помощью ГХ-МС 206
2.2.3.1. Извлечение и очистка стероидов, производных стильбена из
биосубстратов для определения методом ГХ-МС 206
2.2.3.1.1. Оптимизация условий экстракции стероидов и производных стильбена из мышечной ткани животных для определения методом ГХ-МС 206
2.2.3.1.2. Экстракция стероидов и производных стильбена из печени и почек животных для определения методом ГХ-МС 210
2.2.3.1.3. Экстракция стероидов и производных стильбена из биоологических жидкостей животных, жировой ткани и кормов для определения методом ГХ-МС 210
2.2.3.1.4. Очистка экстрактов анаболических стероидов и производных стильбена методами ТФЭ и ВЭЖХ 213
2.2.3.2.Разработка способов извлечения и очистки Р-адреностимуляторов из биосубстратов для определения методом ГХ-МС 215
2.2.3.2.1. Экстракция р-адреностимуляторов из мышечной ткани, печени и почек животных для определения методом ГХ-МС 215
2.2.3.2.2. Извлечение р-адреностимуляторов из мочи животных для определения методом ГХ-МС 218
2.2.3.2.3. Извлечение р-адреностимуляторов из сетчатки глаза животных для определения методом ГХ-МС 220
2.2.3.2.4. Извлечение р-адреностимуляторов из шерсти животных и кормов для определения методом ГХ-МС 221
2.2.3.2.5. Оптимизация условий очистки экстрактов р-адреностимуляторов методом ТФЭ 222
2.2.3.3. Оптимизация способов дериватизации анаболических стероидов и производных стильбена для определения методом ГХ-МС 224
2.2.3.4. Оптимизация условий хроматографического разделения анаболических стероидов и производных стильбена 232
2.2.3.5. Оптимизация способов дериватизации р-адреностимуляторов для определения методом ГХ-МС 235
2.2,3,б. Оптимизация условий хроматографического разделения р-адреностимуляторов 242
2.2.4. Метрологическая аттестация арбитражных масс-спектрометри-ческих методик определения анаболических агентов в биосубстратах 245
2.2.4.1. Алгоритм оценивания неопределенности измерения 245
2.2.4.2. Расчетно-эксперименталъное оценивание неопределенности измерения 250 2.2.43. Контроль правильности результатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием международных аттестованных стандартных образцов 258
2.2.4.3.1. Определение а-тренболона в аттестованном стандартном образце BCR 475 (лиофилизированной печени теленка) 259
2.2.4.3.2. Определение ДЭС в аттестованном стандартном образце CRM 389 (лиофилизированной моче теленка) 265
2.2.4.3.3. Определение кленбутерола в аттестованном стандартном образце BCR-649 (лиофилизированной печени теленка) 268
2.2.4.3.4. Определение кленбутерола и сальбутамола в аттестованном стандартном образце BCR-504 (лиофилизированной моче теленка) 271
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 277
4. ВЫВОДЫ 316
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 319
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 322
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 391
Введение к работе
Актуальность темы. В качестве веществ, обладающих анаболическим действием, наиболее широко применяются стероидные гормоны, производные стильбена и р-адреностимуляторы (Р-агонисты). Использование анаболических стимуляторов в животноводстве обусловлено экономическими факторами, но главная опасность заключается в риске воздействия на здоровье человека остаточных количеств этих веществ в животноводческой продукции. За последние 30 лет описано более 10 000 случаев аномального полового развития у детей, вызванного присутствием в продовольствии остаточных количеств анаболических веществ [191, 284, 337,407, 409]. Полученная в последние годы информация об уязвимости эндокринного равновесия на разных этапах жизни, обусловливает необходимость дифференцированного подхода к людям различного пола и возраста, особенно детям, при оценке гормонального воздействия. Действие экзогенных гормонов может нарушить это тонкое равновесие в организме, что подтверждается непредсказуемыми отдаленными последствиями случайного воздействия стероидов в препубертатном возрасте на репродуктивную функцию посредством механизма, названного «гормональный импринтинг» [55,226, 363,436].
Убедительные доказательства канцерогенности природных и синтетических стероидных эстрогенов и производных стильбена позволили Международному агентству по изучению рака (IARC) отнести их к группе признанных канцерогенов для людей [273]. Андрогенные анаболические стероиды классифицированы агентством в качестве вероятных канцерогенов для человека [270]. Установлено, что катехоловые и оксиметаболиты эстрогенов обладают мутагенностью и генотоксичностыо, проявляющимися независимо от гормональных рецепторов [559]. Если в прошлом оценка риска для гормонов была основана на предположении об исключительной связи их канцерогенного потенциала с гормональной активностью, принимая во внимание последние данные о гено-токсичности метаболитов, допустимый уровень для этих веществ в продовольствии не может быть установлен.
Синтетические гормоны медленнее метаболизируются по сравнению с природными аналогами, позволяют добиться значительного повышения продуктивности в животноводстве и снизить себестоимость продукции, что вызвало всплеск их использования в последние годы. В то же время, токсикологическое действие и метаболизм синтетических анаболиков до настоящего времени недостаточно изучены, что существенно усложняет оценку риска, связанную с их применением [436].
Экспрессия ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты, регулируется гормонами, поэтому анаболические стероиды могут продлевать сроки выведения из организма различных лекарственных средств и повышать их остаточное содержание в животноводческой продукции [371,374,551, 562]. Хотя р-адреностимуляторы не являются стероидными гормонами, по фармакологическим свойствам их можно сравнить со стероидами. Они вызывают ингибирование процессов катаболизма мышечных белков и липогенеза в тканях, что способствует получению постного мяса, пользующегося большим спросом на рынке. В разных странах имели место многочисленные случаи отравления людей мясной продукцией, содержавшей остаточные количества р-адреностимуляторов, сопровождающиеся такими симптомами, как: тахикардия, мышечный тремор, гипокалиемия, тахифилаксия, возбуждение, головные боли, усиленная потливость, сонливость, мышечные спазмы, повышение артериального давления, тошнота [77, 96, 344, 349, 424, 452, 501]. Особую опасность представляет потребление такой продукции людьми с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют в полной мере оценить риск, связанный с применением анаболических стимуляторов роста в животноводстве, поэтому для этих веществ не может быть установлен безопасный уровень суточного потребления.
В связи с вышеизложенным, использование анаболиков в животноводстве запрещено в странах Европейского Союза и Российской Федерации [25, 125, 158].
В ряде стран (США, Канаде и др.) некоторые природные и синтетические гормональные стимуляторы роста сельскохозяйственных животных официально разрешены, а также широко распространено нелегальное использование анаболических препаратов, поэтому необходимо систематически контролировать применение этих веществ при выращивании животных и определять их остаточное содержание в животноводческой продукции. В странах ЕС такой контроль уже систематически осуществляется в соответствии с директивой 96/23/ЕС [126], а введение его в Российской Федерации сдерживает отсутствие методической и законодательной базы.
Анализ имеющихся данных об отрицательном влиянии анаболических агентов на здоровье человека, а также экспорт в Россию пищевых продуктов из стран, где законодательно разрешено применение этих опасных ксенобиотиков, делают актуальными разработку национальной системы контроля безопасности продукции животноводства при их использовании.
В соответствии с рекомендациями Codex Alimentarhts, такая система должна быть построена на многоуровневом контроле, сочетающем преимущества использования экспрессных технологий для скрининга большого массива образцов на начальном этапе исследований с обязательным подтверждением положительных результатов современными физико-химическими методами, позволяющими проводить надежную идентификацию определяемых веществ [118]. Скрининговые методы должны обладать высокой чувствительностью, специфичностью, простотой, экспрессностью и относительно низкой себестоимостью. Всем этим требованиям наиболее полно отвечают иммунохимические методы, в частности ИФА.
Подтверждающие методы должны обеспечивать надежную идентификацию определяемых веществ. Идеальным подтверждающим методом для определения анаболических агентов в биосубстратах является хроматомасс-спектрометрия (ГХ-МС), сочетающая высокую эффективность разделения веществ капиллярной газовой хроматографией с селективным масс-спектрометрическим детектированием.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в создании двухуровневой системы аналитического контроля за использованием анаболических стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и определения остаточного содержания анаболиков в продукции животноводства.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи;
• синтезировать гаптены низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами, получить иммуногены путем конъюгирования их с белками и специфические антитела для определения анаболиков иммунохимическим методом;
• оптимизировать условия эспрессного определения анаболических агентов методом ИФА, оценить чувствительность и специфичность метода;
• разработать нормативную документацию и организовать производство ИФА-наборов для экспрессного определения анаболических агентов в объектах ветеринарно-санитарного надзора;
• разработать подтверждающие (арбитражные) хроматомасс-спектрометрические методики определения анаболических веществ в организме сельскохозяйственных животных, в кормах и продукции животноводства;
• создать оригинальную библиотеку масс-спектров производных анаболиков для идентификации их на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка»;
• провести метрологическую аттестацию арбитражных методик определения анаболических агентов в биосубстратах, оценить правильность получаемых результатов с использованием международных аттестованных стандартных образцов.
Научная новизна работы. Впервые разработаны оригинальные способы синтеза ряда гаптенов низкомолекулярных анаболических агентов с функциональными карбоксильными группами для конъюгирования с белками-носителями: диэтилстильбэстрол-о-карбоксиметила (патентом РФ № 2192408), 3-о-карбоксиметилэтинилэстрадиола (патент РФ № 2214995), тренболон-17-гемисукцината и 19-нортестостерон-17-гемисукцината (патент РФ № 2193566) [14-16]. Карбоксипроизводные диэтилстильбэстрола - 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-1-бутенил] феноксиуксусная кислота и этинилэстрадиола - 0-[19-нор-17а-этинил-17р-гидрокси-прегна-1,3?5(10)-триен-3-ил]гликолевая кислота синтезированы впервые. Путем конъюгирования синтезированных гапте-нов с белками созданы оригинальные иммуногены (патенты РФ № 2218351 и № 2218352) [17, 18].
Синтезированные иммуногены позволили получить антитела, специфичные для определения индивидуальных анаболиков (19-нортестостерона, этинилэстрадиола, тренболона и 17-метилтестостерона), а так же целого класса близких по структуре соединений: производных стильбена и р-адреностимуляторов. Подобраны условия: структура иммуногенов (строение гаптенов, эпитопная плотность конъюгатов), природа и концентрация твердофазных антигенов, условий сенсибилизации носителя твердофазным антигеном и инкубации с ним антител, обеспечившие высокую чувствительность и специфичность определения анаболиков методом ИФА. Для экспрессного определения анаболиков методом ИФА разработаны простые и экономичные способы их извлечения из биологических жидкостей, органов, тканей животных, кормов и оптимизированы условия ферментативного гидролиза конъюгированных форм этих соединений с серной и глюкуроновой кислотами. Предложены эффективные методики экстракции анаболических стероидов, производных стильбена из биосубстратов, очистки и концентрирования экстрактов методом ВЭЖХ, позволившие проводить надежную идентификацию и количественное определение этих соединений в организме сельскохозяйственных животных и продукции животного происхождения методом ГХ-МС на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка». Разработана методика, обеспечивающая одновременное хроматомасс-спектрометрическое определение в биосубстратах р-адреностимуляторов различных типов путем очистки гидролизованных образцов оптимизированным способом твердофазной экстракции на картриджах с комбинированным обра щеннофазовым и ионообменным сорбентом. Оптимизированы способы предварительной дериватизации и хроматографического разделения анаболических агентов, обеспечившие проведение их надежной идентификации и количественного анализа методом ГХ-МС с соблюдением международных требований. Создана оригинальная библиотека масс-спектров производных анаболических агентов и их деитерированных аналогов для идентификации этих соединений на масс-спектрометрах типа «ионная ловушка» с внутренним источником ионизации.
Практическая значимость работы. Впервые в Российской Федерации создана двухуровневая система контроля безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стимуляторов роста животных. Для экспрессного определения основных представителей синтетических эстрогенов (диэтилстильбэстрола, этинилэстрадиола), андрогенов (19-нортестостерона, тренболона, 17-метилтестостерона) и р-адреностимуляторов (кленбутерола) в кормах, организме животных и продукции животного происхождения разработаны и зарегистрированы Россельхознадзором тест-системы ИФА. Чувствительность большинства разработанных тест-систем не уступает, а в ряде случаев (для кленбутерола в 10 раз, а 19-нортестостерона в 16 раз) превосходит показатели зарубежных аналогов. Разработаны простые и экономичные способы извлечения анаболиков из биосубстратов для определения методом ИФА, исключающие использование дорогостоящего метода твердофазной экстракции. На тест-системы подготовлена, согласована и утверждена нормативная документация и организовано их серийное производство в России. Для подтверждающего анализа анаболиков в подозрительных образцах, показавших положительные результаты в ИФА, разработаны, утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству и аттестованы Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии арбитражные методики определения массовых долей анаболических стероидов, производных стильбе-на и р-адреностимуляторов методом ГХ-МС в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Использование относительно недорогих и простых в экс плуатации масс-спектрометров типа «ионная ловушка» позволило обеспечить невысокую стоимость анализа при достижении высокой чувствительности и селективности определения за счет возможности работы на анализаторах этого типа в режимах тандемной масс-спектрометрии и селективного удерживания ионов. С целью гармонизации отечественных и международных подходов к оценке качества результатов измерений при метрологической аттестации методик впервые оценена расширенная неопределенность измерения. Материалы диссертационной работы вошли в методическое пособие «Контроль за содержанием ветеринарных препаратов в кормах и продукции животноводства» ( издательство «Пищепромиздат», 2003), использованы в лекциях и семинарах на курсах повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и предприятий агропромышленного комплекса.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на IX Международном конгрессе Европейской ассоциации ветеринарной фармакологии и токсикологии (Лиссабон, 2003), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), XI Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003), II Международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубовицы, 2003), Международной научной конференции «Медико-биологические проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса» (Сергиев Посад, 2003), III Международной конференции «Птицеводство - мировой и отечественный опыт» (Москва, 2004), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XII Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2004), NATO Advanced Research Workshop «Food Safety and Security» (Issyk-Kul, 2004), II Съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004), III Международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практической конференции «Продовольственная безопасность России» (Москва, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006), Всероссийском ветеринарном конгрессе и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2006), V Международном симпозиуме по анализу остаточных количеств гормонов и ветеринарных препаратов (Антверпен, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 2006), заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2005 гг., заседаниях научно-методической комиссии по химиотерапевтическим лекарственным средствам для животных ФГУ «ВГНКИ» в 2004-2005 гг., межлабораторном совещании сотрудников ФГУ «ВГНКИ» в 2006 г.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 65 статей и тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях, одно методическое пособие (3 п. л.), 2 методических указания, получено 5 патентов РФ на изобретение.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Технология создания тест-систем для экспрессного иммунохимического определения анаболических агентов в организме животных и продукции животного происхождения.
2. Разработка подтверждающих (арбитражных) методик определения анаболических стероидов, производных стильбена и р-адреностимуляторов в объектах ветеринарно-санитарного надзора с помощью ГХ-МС.
3. Современные подходы к метрологической аттестации разработанных методик: алгоритм оценивания неопределенности измерения и контроль правильности разультатов измерения содержания анаболиков в биосубстратах с использованием международных аттестованных стандартных образцов. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 581 источник, 27 из которых опубликованы в отечественных и 554 - в зарубежных изданиях и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 104 рисунками.
Похожие диссертации на Система обеспечения безопасности продукции животноводства при использовании анаболических стероидов, производных стильбена и b-адреностимуляторов
