Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 11
1.1. Биологическая активность и применение азосоединений 11
1.2. Средства, применяемые для лечения дерматомикозов животных
1.3. Средства, применяемые для лечения акарозов животных 19
II. Собственные исследования 24
2.1. Материал и методы исследований 24
2.2. Результаты исследований 29
2.2.1. Физические свойства ароматических азосоединений 29
2.2.2. Биологическая активность ароматических азосоединений 35
2.2.2.1. Оценка антибактериальной активности азосоединений 35
2.2.2.2. Оценка антимикотической активности азосоединений 42
2.2.2.3. Оценка акарицидной активности азосоединений 43
2.2.3. Изучение параметров острой токсичности Азонола и Азодина 45
2.2.4. Изучение кумулятивного действия Азонола и Азодина
2.2.5. Определение раздражающего действия Азонола и Азодина на слизистые оболочки и кожу 50
2.2.6. Выявление сенсибилизирующего действия Азонола и Азодина
2.2.7. Изучение влияния Азонола и Азодина на морфологический состав крови 53
2.2.8. Биохимический состав крови крыс, получавших Азонол и Азодин 56
2.2.9. Влияние Азонола и Азодина на изолированное сердце и сосуды лапок лягушек
2.2.10. Влияние Азонола и Азодина на центральную нервную систему 65
2.2.11. Патоморфологические изменения в органах и тканях белых крыс, получавших Азонол и Азодин 71
2.2.12. Изучение отдаленных последствий действия Азонола и Азодина 80
2.2.12.1. Определение мутагенного действия Азонола и Азодина 81
2.2.12.2. Определение эмбриотоксического действия Азонола и Азодина 85
2.2.13. Разработка лекарственных форм и изучение лечебной эффективности азонола и азодина 92
2.2.13.1. Терапевтическая эффективность Азонола при псороптозе кроликов 93
2.2.13.2. Терапевтическая эффективность Азонола и Азодина при отодектозе плотоядных 94
2.2.13.3. Терапевтическая эффективность Азодина при микроспории кошек 95
III. Обсуждение результатов исследований 98
Выводы 105
Практические предложения 107
Библиографический список использованной литературы 108
- Средства, применяемые для лечения дерматомикозов животных
- Физические свойства ароматических азосоединений
- Определение раздражающего действия Азонола и Азодина на слизистые оболочки и кожу
- Разработка лекарственных форм и изучение лечебной эффективности азонола и азодина
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в лечении и ликвидации, болезни кожи микотической и саркоптоидной этиологии имеют распространение среди всех видов животных. Они представляют серьезную опасность, как для животных, так и для человека и наносят большой экономический ущерб хозяйствам.
По России зараженность собак и кошек паразитическими клещами Demodex canis, Otodectes cynotis и Sarcoptes canis составляет 41,3-65,0% (М.В.Шустрова, 1999). Ф.И.Василевич (1998) при исследовании 1606 собак с поражениями кожи в Москве и Московской области установил 38,3%-ную зараженность их Demodex canis. Пик заболеваемости демодекозом наблюдается в марте и сентябре, отодектозом - в мае и июне (Е.И. Латкина, 2007).
Статистика показывает, что только в Лечебно-консультативном центре Казанской государственной академии ветеринарной медицины ежегодно из всех принятых животных на долю паразитарных болезней кожи приходится от 26 до 34%). В целом по России, среди собак в большей степени распространен саркоптоз (23%>), отодектоз (21,2%) и демодекоз (13,8%>), а среди кошек нотоэдроз (38,5%) и отодектоз (18%>).
Ежегодно лечебной и профилактической обработке против трихофитии подвергаются более 50% общего поголовья крупного рогатого скота, против саркоптоза - 21%.
Экстенсивность инвазии (ЭИ) псороптоза среди взрослого крупного рогатого скота в хозяйствах республики Татарстан варьирует от 14,3 до 31,4%. В целом по базовым хозяйствам ЭИ клещами P. bovis составила 27,8%.
Недостаточная обеспеченность ветеринарной службы эффективными препаратами и в то же время возросшие требования по охране природной
среды от загрязнения обязывают осваивать новые средства и методы лечения кожных болезней животных.
Однако большинство средств, рекомендуемых для лечения болезней кожи животных, по ряду причин не удовлетворяют требованиям ветеринарной практики. Так, хлор- и фосфорорганические соединения высокотоксичны, кумулятивны, гонадо- и эмбриотоксичны, выделяются с молоком (Т.Г. Аббасов, 1982; М.А. Ананчиков, 1990; Л.Р. Закиева, 2000; Ю.А. Нахов, 2000; В.Н. Шевкопляс, 2006). Амфотерицин, нистатин часто вызывают аллергию, гризеофульвин (И.В. Сидоров, 2000; E.F. Donovan, 1960; L. Garli, 1988); препараты салициловой кислоты малоэффективны обладают канцерогенным, гонадо- и тератогенным действием.
Отодектоз часто осложняется секундарной микрофлорой и обычные методы лечения данного заболевания зачастую бывают неэффективными.
В связи с этим, рекомендованы синтетические пиретроиды, препараты бензилбензоата и макроциклические лактоны (А.Н. Давлетшин, 2000; Е.И. Латкина, 2007). Хорошо зарекомендовали себя как активные инсектоакарициды препараты на основе бензофуроксанов (Т.В. Гарипов, 1988; Р.Г. Каримова, 2003). Известно, что среди бензофуроксанов, замещенных такими функциональными группами, как окси, метокси-, хлор- и нитро-, найдены эффективные инсектициды и фунгициды.
Активно ведется поиск новых лекарственных препаратов среди
азосоединений. По литературным данным, азосодержащие
гетероциклические соединения, обладают выраженной биологической активностью. Особый интерес вызывают соединения, содержащие пиридиновый фрагмент, являющийся неотъемлемой частью биологических систем, некоторые из них используются как противовоспалительные средства (пироксисам и др.), а другие - для лечения стенокардии (пифедипин, амподипин).
Детальное изучение биологической активности, а также фармако-токсикологических свойств азосоединении даст возможность выявить наиболее активные против возбудителей дерматомикозов и акарозов, и рекомендовать их для внедрения в производство. Анализ зависимости биологической активности препарата от его химической структуры позволит в дальнейшем проводить целенаправленный синтез соединений, проявляющих необходимую биологическую активность. В связи с изложенным поиск новых лечебных средств среди азосоединении актуален и отвечает запросам практической ветеринарной науки.
Цель и задачи исследований. Основная цель исследований - изучение
биологической активности, фармако-токсикологических свойств
ароматических азосоединении и установление их перспективности как средств для лечения паразитарных болезней кожи животных.
Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить антимикробную, фунгистатическую и акарицидную
активность азосоединении в связи с их структурой и выявить наиболее
активные.
2. Определить параметры токсичности, кумулятивные и
сенсибилизирующие свойства наиболее активных ароматических
азосоединении.
Изучить влияние наиболее активных ароматических азосоединении на морфологический и биохимический состав крови животных, функциональное состояние центральной нервной системы, на изолированные сердце и кровеносные сосуды животных.
Установить наличие и характер гистоморфологических изменений, возникающих в организме лабораторных животных после длительного внутреннего применения препаратов.
5. Установить отдаленные последствия действия ароматических
азосоединении на организм животных.
6. Разработать лекарственные формы и рекомендации к применению ароматических азосоединений для лечения псороптоза кроликов, отодектоза и микроспории собак и кошек, изучить их терапевтическую эффективность.
Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте изучена активность 13-ти ароматических азосоединений и установлено, что их биологическая активность зависит от заместителей и положения их в молекуле азосоединения. Выявлены соединения, обладающие выраженными антимикробными, антимикотическими и акарицидными свойствами. Определены параметры токсичности 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенола (Азонол) и 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенола (Азодин). Доказано отсутствие их отрицательного влияния на общее состояние, морфологический и биохимический состав крови, функциональное состояние центральной нервной системы животных, изолированное сердце и кровеносные сосуды лапок лягушки. Установлено отсутствие отдаленных последствий действия препаратов на организм. Изучена гистоморфология тканей и органов животных, длительное время получавших внутрь азосоединения. Разработаны лекарственные формы, дозы и схемы применения ароматических азосоединений при псороптозе кроликов, отодектозе и микроспории кошек и собак.
Практическая ценность. Результаты . исследований могут быть использованы для направленного синтеза новых соединений, обладающих широким спектром антипаразитарного действия и создания эффективных средств для лечения паразитарных болезней кожи животных.
Для внедрения в ветеринарную практику рекомендованы Азонол и Азодин в виде 0,1% спиртового раствора, как эффективное средство при псороптозе кроликов, отодектозе и микроспории собак и кошек.
По результатам исследований разработаны и утверждены в установленном порядке Главным управлением ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан (13.11.2008 г) «Временное наставление по
применению препарата Азонол при акарозах и дерматомикозах животных» и «Временное наставление по применению препарата Азодин при акарозах и дерматомикозах животных».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-биологическая активность ароматических азосоединений зависит от заместителей и их положения в молекуле;
-наиболее выраженным антимикробным, антимикотическим и акарицидным действием обладают 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол (Азонол) и 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенол (Азодин);
-Азонол и Азодин малотоксичны для теплокровных животных, не обладают кумулятивным и сенсибилизирующим свойствами при длительном применении;
-Азонол и Азодин, в рекомендуемых дозах и концентрациях, не оказывают отрицательного действия на морфологический и биохимический состав крови, функциональное состояние центральной нервной системы, не обладают мутагенным и тератогенным действием;
-Азонол и Азодин в виде 0,1% спиртового раствора эффективны при псороптозе кроликов, отодектозе и микроспории собак и кошек.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены на
конференции молодых ученых Приволжского федерального округа,
посвященной роли молодых ученых в реализации национального проекта —
Развитие АПК (Саратов, 2007), Всероссийской научно-практической
конференции (Казань, 2007), Межрегиональной научно-практической
конференции (Воронеж, 2007), Научно-практической конференции
«Фармакологические и экотоксикологические аспекты ветеринарной медицины» (Троицк, 2007), Итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И. Лобачевского (Казань, 2007), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов и аспирантов (Казань, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 32 таблицами и 12 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Список использованной литературы включает 285 источников, в том числе 81 зарубежных.
Средства, применяемые для лечения дерматомикозов животных
Антифунгальные препараты можно классифицировать по мишеням их действия в клетке гриба. Такие классы включают: полиеновые антибиотики, аналоги нуклеозида (фторированные пиримидины), азолы, пневмокандины-эхинокандины, прадимицины-бенаномицины, никкомицины, аллиламины, тиокарбаматы и другие.
Первым препаратом широкого спектра действия был признан гризеофульвин [147, 148, 165, 166, 167, 222, 230]. Антибиотик оказывает выраженное фунгистатическое действие на различные виды дерматофитов, в том числе родов Trichophyton и Microsporum. Минимальная подавляющая концентрация гризеофульвина для чувствительных к нему видов грибов колеблется в пределах 0,2—0,5 мкг/мл. Устойчивы к действию препарата дрожжеподобные грибы рода Candida, актиномицеты, плесневые грибы и бактерии. Перекрестная устойчивость с другими антибиотиками антифунгального действия не зарегистрирована. Усиления резистентности чувствительных грибов в процессе применения гризеофульвина также не установлено.
Гризеофульвин действует на репродуктивную систему дерматофитов, подавляя репликацию ДНК и таким образом угнетая клеточное деление, что вызывает характерные морфологические изменения гифов (скручивание, искривление,, усиленное ветвление).
К полиенам, которые являются природными антимикотиками, относятся нистатин [237], леворин [120] и натамицин [45], применяющиеся местно и внутрь, а также амфотерицин В [203, 206, 231], используемый преимущественно для лечения тяжелых системных микозов. Липосомальный амфотерицин В [207] представляет собой одну из современных лекарственных форм этого полиена с улучшенной переносимостью. Его получают путем инкапсулирования амфотерицина В в липосомы (пузырьки жира, образуемые при диспергировании в воде фосфолипидов), что обеспечивает высвобождение активного вещества только при соприкосновении с клетками гриба и интактность по отношению к нормальным тканям [45, 46, 47].
Полиены, в зависимости от концентрации, могут оказывать как фунгистатическое, так и фунгицидное действие, обусловленное связыванием препарата с эргостеролом мембраны гриба, что ведет к нарушению ее целостности, потере содержимого цитоплазмы и гибели клетки [206]. Полиены обладают самым широким среди противогрибковых препаратов спектром активности in vifro. При системном применении (амфотерицин В) чувствительны Candida spp. (среди C.lusitaniae встречаются устойчивые штаммы), Aspergillus spp. {A.terreus может быть устойчивым), C.neoformans, возбудители мукомикоза (Mucor spp., Rhizopus spp. и др.), S.schenckii, возбудители эндемичных микозов {B.dermatitidis, H.capsulatimi, C.immitis, P.brasiliemis) и некоторые другие грибы. Однако при местном применении (нистатин, леворин, натамицин) они действуют преимущественно на Candida spp. Полиены активны также в отношении некоторых простейших — трихомонад (натамицин), лейшманий и амеб (амфотерицин В).
Азолы являются наиболее представительной группой синтетических антимикотиков, включающей лекарственные средства для системного (кетоконазол [250, 257], флуконазол, итраконазол) и местного применения (бифоназол, изоконазол, клотримазол, миконазол, оксиконазол, эконазол) [93, 215, 251]. Кетоконазол в последнее время стали рекомендовать для местного применения. Азолы обладают преимущественно фунгистатическим эффектом, который связан с ингибированием цитохром Р-450-зависимой 14а-деметилазы, катализирующей превращение ланостерола в эргостерол — основной структурный компонент грибковой мембраны [191]. Местные препараты при создании высоких локальных концентраций в отношении ряда грибов могут действовать фунгицидно. Азолы обладают широким спектром противогрибковой активности [154]. К итраконазолу чувствительны основные возбудители кандидоза, дерматомицеты и некоторые другие грибы. Кетоконазол по спектру близок к итраконазолу, но не действует на Aspergillus spp. Флуконазол наиболее активен в отношении большинства возбудителей кандидоза, криптококка и кокцидиоида, а также дерматомицетов. Клотримазол рекомендован для применения в виде 1-2% мазей в комплексе с сульфатом цинка, 0,5-1% аэрозоли, 1% присыпки, а хлормидазол в виде 5% присыпки, 5% мази при дерматомикозе крупного рогатого скота. Клотримазол в 1% концентрации рекомендован при трихофитии кроликов и микроспории кошек [257].
К аллиламинам (производные N-метилнафталина) относятся синтетические антимикотики тербинафин [238, 246, 241], назначаемый внутрь и местно, нафтифин и бутенафин, предназначенные для наружного применения. Механизм действия аллиламинов связан с ингибированием скваленэпоксидазы в клеточной мембране гриба [197, 245]. Это приводит к подавлению синтеза эргостерина, с чем связан фунгистатический эффект, и внутриклеточному накоплению сквалена, что вызывает разрушение мембраны и гибель клетки гриба (фунгицидный эффект). Аллиламины обладают преимущественно фунгицидным действием, связанным с нарушением синтеза эргостерола. В отличие от азолов аллиламины блокируют более ранние стадии биосинтеза, ингибируя фермент скваленэпоксидазу. Аллиламины обладают широким спектром противогрибковой активности. К ним чувствительны дерматомицеты {Epidermophyton spp., Trichophyton spp., Microsporum spp.), M.furfur, кандиды [191], аспергиллы, гистоплазмы, бластомицеты, криптококк, споротрикс, возбудители хромомикоза.Тербинафин активен in vitro также против ряда простейших (некоторые разновидности лейшманий и трипаносом) [100].
Физические свойства ароматических азосоединений
Ароматические азосоединения (таблица 1) представляют собой порошки красного или коричневого цвета, нерастворимые в воде. В связи с этим, проведены специальные исследования для определения подходящих растворителей.
Для определения растворимости препарата в разных растворителях использовали фармакопею СССР (изд.ХІ, часть 1, 1987). Установили растворители и их количество для растворения 1 г соединения. Растворы оставляли в цилиндрах на 24 часа для наблюдения. Если выпадения осадка не происходило, то раствор считался стабильным. Результаты исследования приведены в таблицах 2 и 3.
Как видно из результатов, приведенных в таблицах 2 и 3, наиболее подходящим растворителем для Азонола и Азодина является диметилсульфоксид и этиловый спирт. Исходя из этого, для приготовления лекарственных форм в качестве растворителя использовали 96% этиловый спирт и доводили до 70% концентрации дистиллированной водой.
Бактериостатическое и бактерицидное действие ароматических азосоединений изучено по отношению к St aureus и Е. coli. Для определения бактериостатического действия препаратов готовили двукратные разведения их в бульоне Хоттингера, предварительно растворив их в ДМСО. В пробирки засевали суточные агаровые культуры используемых бактерий (бактериальная нагрузка 330 микробных тел в 1 мл.). Пробирки инкубировали в термостате 24 часа при t 37С. Минимальной бактериостатической концентрацией (МБСК) считали наименьшую концентрацию, которая задерживает рост бактериальных культур. Результаты изучения бактеристатической активности азосоединений приведены в таблице 4. МБСК 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенола (соединение № 3) в отношении золотистого стафилококка составила 0,00039%, что связано, скорее всего, с присутствием в молекуле атома хлора. Замена хлорного радикала на гидроксильную группу в молекуле 2,4 динитрофенилазорезорцина снизило МБСК в 160 раз - 0,0625%. Такая же активность наблюдается и у 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенола, что объясняется уже отсутствием одной нитрогруппы. Меньшей активностью обладают 3-(2,4-динитрофенилазо)-2,6-диаминопиридин и 3-(п нитрофенилазо)-2,6-диаминопиридин с МБСК 0,125%. Снижение антибактериальной активности можно объяснить наличием в молекуле двух аминогрупп.
У 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенола и 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенола была изучена бактерицидная активность. Для этого к 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125% растворам исследуемого вещества в физиологическом растворе добавляли суспензию бактерий (бактериальная нагрузка 330000 микробных тел в 1 мл.). Через 5, 10, 15, 30, 60, 120 и 240 минут с помощью бактериальной петли делали высевы в пробирки с МПА. Опыт приводили в 2 модификациях: при комнатной температуре и при t 37 С. Пробирки инкубировали в термостате при 137 С в течение 5 суток.
Установлено, что 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол и 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенол in vitro при двухчасовой экспозиции при температуре +37 С проявляют стойкую бактерицидную активность по отношению к St. aureus в 0,03125 %, к Е. соїі в 0,0625% концентрации. При комнатной температуре данные соединения активны в концентрации 0,03125 % как для St. aureus, так и для Е. coli.
Для определения фунгистатического действия ароматических азосоединений готовили двукратные разведения препаратов в жидкой среде Сабуро, в которую засевали культуру Tr. mentagraphytes. Пробирки выдерживали в термостате при 27 С в течение 14 суток. Активность соединений по отношению к грибам определяли их минимальной концентрацией (МФСК), при которой рост гриба не наблюдается. Результаты исследований приведены в таблице 9.
Установлено, что выраженной фунгистатической активностью из изученных нами 13-ти ароматических азосоединений, обладают хлорфенолы с содержанием нитро-группы в мета-положении к азогруппе 4-( м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол (соединение №10 - МФСК - 0,0625%) или с содержанием двух нитрогрупп 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенол (соединение №3 - МФСК - 0,125%).
Изменение положения нитрогруппы из мета- в пара- (4-(-п-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол, соединение № 11) или орто-положения (4-(-о-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол, соединение № 12) — приводило к резкому снижению фунгистатической активности (МФСК 0,5%). У 2,4-динитрофенилазорезорцина (соединение № 9) МФСК по отношению к Tr. mentagraphytes равна 0,25%, что свидетельствует о меньшей его активности по отношению к грибам. Наблюдение за клещами вели под микроскопом тотчас же после воздействия препарата и через 10, 15, 30 минут и 1, 2, 4, 20 и 24 часа. При этом учитывали количество живых и мертвых клещей. Мертвыми считали тех клещей, которые не реагировали на механический и тепловой раздражители. Таким образом, подводя итог биологической активности ароматическх азосоединений, можно сделать вывод, что среди исследованных 13-ти соединений выделены два, которые обладают выраженным бактериостатическим, фунгистатическим и акарицидным действием одновременно. Это 2-(2,4-динитрофенилазо)-м-хлорфенол, мы назвали его Азодин и 4-(-м-нитрофенилазо-)-м-хлорфенол, названный Азонолом. Острую токсичность Азонола и Азодина изучали на белых мышах обоего пола живой массой 25-30 г (п=72) и белых крысах обоего пола живой массой 180-200 г (п=42). Исследования проведены в два этапа. На первом этапе методом скользящих доз определяли недействующую и летальную дозы. На втором этапе дозы препарата подбирали таким образом, чтобы наибольшая вызвала гибель всех крыс использованных в эксперименте, наименьшая доза не вызывала гибель. Также определяли несколько промежуточных доз, которые приводили к гибели около 50% опытных животных. Белым мышам девяти опытных групп вводили однократно в желудок Азонол в дозах от 100-3500 мг/кг в виде 10% водной суспензии, Азодина в дозах 400-5000 мг/кг, и контрольным животным вводили 1% раствор эмульгатора.
Определение раздражающего действия Азонола и Азодина на слизистые оболочки и кожу
Раздражающее действие Азонола и Азодина в концентрациях 0,1% и 0,5% изучали на 15 кроликах обоего пола живой массой 2,5-3 кг, разделенных на 5 групп (п=3), путем 10-дневного нанесения на слизистую оболочку глаза, а другой глаз служил контролем (отстоянная водопроводная вода).
Кроликам контрольной группы на конъюнктиву правого глаза закапывали по две капли раствора стеарокса (эмульгатора), а левого -водопроводной воды комнатной температуры (18-20С). Состояние животных оценивали через 5, 30, 60 минут после нанесения препарата и ежедневно в течение 10 дней. Учитывали общее состояние животных, пищевую возбудимость, отмечали состояние слизистой оболочки глаза, время появления и выраженность гиперемии, отечность, инъекцию сосудов склеры и роговицы, измеряли диаметр зрачка, наблюдали за состоянием век.
Азодин в виде 0,1% и 0,5% суспензии вызвал гиперемию кровеносных сосудов и сужение зрачка. Азонол в виде 0,1% суспензии вызывал незначительное покраснение конъюнктивы, а 0,5% раствор вызвал еще и сужение зрачка на 2 мм. Эффекты вызванные Азонолом и Азодином полностью исчезали в течение 90-120 минут. У животных контрольной группы, которым вводили раствор стеарокса, наблюдалось слезотечение, незначительная гиперемия, исчезающая в течение 30-40 минут. Местное действие Азонола и Азодина на кожу изучали на 36 белых беспородных крысах живой массой до 200 г, которых разделили на 6 групп по 3 крысы в каждой, и 36 кроликах, живой массой 2,5-3 кг. Крысам и кроликам наносили 0,1, 1, 2, 5 и 10% суспензии препарата на стеароксе. Волосяной покров за день до применения препарата тщательно выстригали. Приготовленный препарат наносили на участок кожи размером 2x2 см для крыс и 4x5 для кроликов объемом 1 мл ежедневно в течение 25 дней. На выстриженный участок кожи, служивший контролем, наносили такое же количество растворителя. За животными вели клинические наблюдения в течение двух месяцев. Определяли эластичность кожи, наличие отека, воспалительных процессов, утолщения кожной складки, шелушения, расчесов. Реакцию кожи, контактирующей с препаратом, определяли пальпацией. Реакцию кожи оценивали по пятибалльной системе: О- видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая кожа по всему участку или его периферии; 2- ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии; 3- красная эритема по всему участку; 4- инфильтрация или отек кожи при наличии или отсутствии эритемы; 5- эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления, образование корочки;
В результате проведенных исследований установлено, что Азонол и Азодин в 0,1, 1, 2, 5 и 10% концентрации не оказывают отрицательного воздействия на кожу и слизистые оболочки животных, хотя вызывали незначительную кратковременную гиперемию участка кожи, что объясняется, по-видимому, раздражающим действием стеарокса.
Сенсибилизирующие свойства Азонола и Азодина изучали на 9 кроликах, массой 2 кг. Перед опытом определили первично-раздражающее действие препаратов путем однократных накожных аппликаций различных их разведений для выявления концентрации, которая не вызывает реакцию кожи животных. Такой оказалась 10% концентрация.
За день до опыта у кроликов выстригали волосы на участке спины размером 2x3 см. На поверхность кожи наносили 10% раствор Азонола или Азодина, выдерживали 4 часа и смывали дистиллированной водой. На 10-й день нанесения препаратов у кроликов наблюдалось утолщение кожной складки, болезненность и гиперемия кожи. Затем нанесение их было прекращено. Через 21 день после последней аппликации, на кожу свежевыстриженного участка спины наносили разрешающую дозу 1 мл препаратов в той же концентрации. Учет реакции проводили через 24 часа. Признаков аллергической реакции у опытных животных не обнаружили. Таким образом, было установлено, что Азонол и Азодин не обладают аллергизирующими свойствами. Исследования были проведены на 18 клинически здоровых беспородных белых крысах обоего пола массой 180-200 г путем внутрижелудочного введения соединений.
Для этого животных разделили на три группы. Первой группе ежедневно вводили 10% суспензию Азонола в дозе 50 мг/кг, второй группе -10% суспензию Азодина в дозе 50 мг/кг, третья группа состояла из контрольных животных. Кровь для анализа брали утром натощак из хвостовой артерии до введения препаратов, затем на 5-, 15- и 25-й дни исследования.
В крови у крыс всех трех групп в течение эксперимента повышалось количественное содержание эритроцитов и лейкоцитов, соответственно у первой группы с 7,2±0,18хЮ2/л и 8,5±0,36хЮ9/л до 8,0±0,33х1012/л и 8,9±0,26хЮ9/л, у второй группы с 7,3±0,21хЮ2/л и 8,4±0,32х109/л до 7,8±0,43хЮ,2/л и 8,7±0,40хЮ%, третьей группы с 7,3±0,27хЮ12/л и 8,4±0,29хЮ9/л до 8,1±0,29хЮ,2/л и 9,0±0,24хЮ9/л. СОЭ и содержание гемоглобина у животных опытной группы, менялись в течение эксперимента незначительно. Количество гемоглобина не изменялось к концу эксперимента и тем самым можно сделать вывод, что насыщенность гемоглобином одного эритроцита снижается. Это явление, по-видимому, не связано со специфическим действием препаратов, а является лишь ответной реакцией организма крыс на стресс-факторы: манипуляции с введением зонда и препарата в желудок.
Разработка лекарственных форм и изучение лечебной эффективности азонола и азодина
Самой простой в приготовлении лекарственной формы веществ не растворимых в воде является суспензия. В качестве стабилизатора (эмульгатора) для приготовления стойких суспензий мы использовали стеарокс-6.
Для приготовления суспензии навеску исследуемого соединения растирали в ступке с эмульгатором в различных соотношениях, затем при постоянном перемешивании добавляли малыми долями дистиллированную воду до требуемого объема. Полученную суспензию оставляли на 24 часа, 5, 10 суток, затем взбалтывали и проверяли однородность. Повышение или понижение процентного содержания указанного эмульгатора изменяют стабильность суспензии Азонола и Азодина.
Установлено, что через 24 часа однородность водной суспензии нарушается, при взбалтывании восстанавливается. Водные суспензии препарата удобны для массового применения, однако они непригодны для длительного хранения. Поэтому были разработаны ушные капли - раствор Азонол и Азодин в 70% этиловом спирте. Раствор в данной лекарственной форме обладает стабильностью, не выпадает в осадок и может хранится длительное время. Для этого навеску действующего вещества растворяли в 96% этиловом спирте (90 мл), затем добавляли воду (26 мл).
На клинические испытания были предложены ушные капли в 70% спирте, содержащие активно действующее вещество 0,1%. Диагноз на псороптоз ставили на основании клинических признаков и результатов исследования соскобов, взятых с места поражения. Клиническая картина псороптоза характеризовалась тем, что кролики трясли головой, расчесывали и терлись ушной раковиной об стенку клетки. В слуховом проходе и внутренней стенке ушных раковин имелись наслоения некротических корочек и струпьев серого, серо-коричневого цвета, иногда с неприятным запахом. В соскобах видны живые клещи, их личинки и яйца. Лечебная эффективность Азонола изучена в виде 0,5; 0,25; 0,1; 0,05% концентрации на 70 этиловом спирте путем 4-5 кратного нанесения на очаги поражения. Лечение проводили после предварительной очистки ушной раковины от чешуек, корок и экссудата. Кратность применения раствора Азонола зависела от степени поражения (4-5 раз с интервалом в один день). После однократного применения 0,5; 0,25 и 0,1% спиртовых растворов Азонола животные успокаивались, охотно принимали корм и воду. Пораженные участки кожи начинали освобождаться от корочек, на открытых местах появлялась чистая, розового цвета кожа. В соскобах, взятых на 4 и 5 день лечения, отсутствовали живые клещи, на пораженных участках начинался рост волос. Полное исцеление кроликов наступало на 5-7 день, а в случаях осложненного течения заболевания отитом - на 7-9 день. При применении 0,05% раствора лечебный эффект был менее выраженным. В соскобах, взятых после 3- и 4-го применения обнаруживались клещи. Стабильный эффект был получен только на 20 день лечения. Исходя из этого, считаем, что 0,1% спиртовой раствор Азонола является эффективным средством для лечения псороптоза кроликов. Он не оказывает отрицательного влияния на общее состояние кроликов и не обладает местно-раздражающим действием. Полное выздоровление животных при трехкратной обработке наступает в течение 6-7 дней.
Исследования проводили в условиях государственной участковой ветеринарной лечебницы Советского района г. Казани и Спасского РГВО на 57 кошках и 30 собаках. Клинически болезнь проявлялась беспокойством животных, угнетением. Животные трясли головой и на поверхности ушной раковины отмечались места расчесов, в ушной раковине имелся высохший экссудат, в соскобах, взятых от больных животных, были выделены живые, серовато-желтые, овальной формы длиной 0,5 мм клещи. Диагноз на отодектоз считали установленным при обнаружении яиц, личинок, нимф или имаго клещей Otodectes cynotis.
Азонол и Азодин применяли кошкам и собакам в виде 0,1% спиртового раствора ежедневно. Лечение проводили предварительно очистив внутреннюю поверхность ушной раковины. Препарат наносили на внутреннюю поверхность ушных раковин с последующим массажем их основания.
Установлено, что препараты обладают выраженной терапевтической эффективностью. При применении Азонола отторжение корочек начиналось на 1-2 сутки после нанесения препарата. Внутренняя поверхность ушных раковин становилась розовой и безболезненной, спала отечность, кожа стала эластичной. У животных уменьшилось беспокойство, повысился аппетит. Выздоровление наступало в течение 6-7 дней. При применении Азодина наблюдалась аналогичная картина. Отторжение корочек также наблюдалось на 1-2 день, животные успокаивались, меньше касались лапами пораженных ушей. Внутренняя поверхность ушей стала безболезненной, влажной, розовой. Из 17 кошек, которых лечили Азодином, у 9 отмечали полное выздоровление после 6-7 кратной обработки, у 8 - после 7-8 кратной обработки. Таким образом, 0,1% спиртовые растворы Азонола и Азодина при 6-8 кратном применении обеспечивают полное выздоровление плотоядных от отодектоза.
