Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Физические и химические методы переработки органического сырья 10
1.2. Переработка отходов животноводства и птицеводства биологическими методами 14
1.3. Роль микроорганизмов и грибов в детоксикации микотоксинов 33
2. Материалы и методика исследований 38
3. Результаты собственных исследований 47
3.1. Изучение биологических свойств штаммов микроорганизмов, входящих в состав ускорителя ферментации (УФ-1) 47
3.1.1. Изучение биологических свойств Actinomyces fradiae-96 49
3.1.2. Изучение биологических свойств Candida krusei-96 52
3.2. Изучение безвредности препарата 55
3.2.1. Фармако-токсикологическая оценка УФ-1 55
3.2.1.1. Определение острой токсичности УФ-1 55
3.2.1.2 Изучение субхронической токсичности УФ-1 в опытах на белых крысах 58
3.2.1.3. Изучение хронической токсичности УФ-1 в опытах на белых крысах 62
3.2.1.4. Изучение влияние УФ-1 на функциональное состояние центральной нервной системы 65
3.2.1.5. Изучение влияния УФ-1 на функциональное состояние печени 65
3.2.1.6. Изучение раздражающего и аллергизирующего действия УФ-1 67
3.2.1.7. Изучение пирогенного действия УФ-1 69
3.2.1.8. Изучение канцерогенного действия УФ-1 69
3.2.1.9. Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия УФ-1 71
3.3. Изучение действия УФ-1 на патогенные микроорганизмы 75
3.3.1. Оценка обеззараживающего действия УФ-1 в отношении Е.СОІІ0126 75
3.3.2. Оценка обеззараживающего действия УФ-1 в отношении Salmonella typhimurium 371 78
3.4. Оценка детоксицирующего действия УФ-1 в отношении Т-2 токсина 80
3.4.1. Изучение обезвреживающего действия УФ-1 на органические отходы, экспериментально контаминированные Т-2 токсином 80
3.4.2. Изучение обезвреживающего действия УФ-1 на корма, экспериментально контаминированные Т-2 токсином 85
3.5. Методы контроля качества УФ-1 86
3.6. Определение срока годности УФ-1 88
3.7. Изучение эффективности УФ-1 в производственных условиях 90
4. Обсуждение результатов исследований 104
Выводы 114
Практические предложения 116
Использованная литература
- Переработка отходов животноводства и птицеводства биологическими методами
- Изучение биологических свойств Actinomyces fradiae-96
- Изучение влияние УФ-1 на функциональное состояние центральной нервной системы
- Оценка детоксицирующего действия УФ-1 в отношении Т-2 токсина
Введение к работе
Актуальность темы. Неотъемлемой частью любого цивилизованного общества наряду с производством продукции промышленного, бытового и сельскохозяйственного назначения является образование как жидких, так и твердых отходов. Наибольшую экологическую и эпизоотическую опасность представляют отходы сельскохозяйственных предприятий, в частности навоз и помет, отличающиеся высоким содержанием экологически опасных веществ -аммиака, сероводорода, меркаптана, фенола и др.
Вместе с тем, в сельском хозяйстве существует значительная потребность в органических отходах агропромышленного комплекса, содержащих достаточное количество питательных элементов, представляющих ценный сырьевой материал для получения высокоэффективных удобрений и других продуктов, необходимых народному хозяйству.
Внесение навоза и помета в почву без предварительной обработки является неприемлемым, в связи с возможным содержанием экотоксикантов (тяжелых металлов, пестицидов, микотоксинов и т.д.), медикаментозных препаратов и других загрязнителей. К тому же, с фекалиями животных не исключается выделение возбудителей инфекционных и инвазионных болезней, которые относительно длительное время сохраняют жизнеспособность и вирулентность. Так, например, возбудители сальмонеллеза сохраняют жизнеспособность в навозе 92-157 сут, туберкулеза - 457 сут, листериоза -более 160 сут, вирус болезни Марека - свыше 6 месяцев, яйца и личинки гельминтов в свином навозе сохраняются 12-15 месяцев, в навозе крупного рогатого скота - 7-8 месяцев. По данным Всемирной организации здравоохранения навоз является источником передачи более 100 видов возбудителей болезней животных, в том числе опасных для человека (Романенко Н.А. и др., 1981). Почва после внесения органических отходов в значительной степени обсеменяется микрофлорой, что создает определенную экологическую и санитарную опасность (Тюрин В.Г., 2004). Следует также отметить, что использование органических отходов без переработки нецелесообразно, поскольку при хранении в течение 2-3 месяцев потери азота в них могут составлять 50-60 % (Мыц Е.А., 1996; Фомин Ю.И., 1996; Morse D., 1994; Dosch P., Gutser R., 1995; Menzi H. et al., 1995; Estavillo J. et al., 1996). Значительным недостатком внесения в почву отходов является тот факт, что, с одной тонной навоза или помета в почву попадает 12 миллионов семян сорных растений (Попов П.Д., 1997).
В этой возникшей дилемме важным для науки и практики является разработка биотехнологических процессов утилизации органических отходов, обеспечивающих организацию эффективных, безотходных и природоохранных технологий биоконверсии навоза и помета.
Перспективным и современным методом переработки органических отходов является биологический, с использованием специфических популяций микроорганизмов.
Во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте г.Казань (Тремасов М.Я., Сергейчев А.И.) на основе выделенных из почвы в 1996 г. микроорганизмов разработан препарат, получивший название УФ-1, использование которого ускоряет процесс утилизации различного вида органического сырья, в том числе экскрементов животных, птиц и человека.
Однако, не изученными оставались морфологические, физиолого-биохимические и патогенные свойства микроорганизмов, входящих в состав УФ-1, параметры безвредности, обеззараживающие и обезвреживающие действия, не обоснованы дозы препарата.
Работа является частью комплексных заданий НИР по теме «Разработка мероприятий по ликвидации в очагах поражения последствий воздействия экотоксикантами» (№ гос. регистрации 01200202603).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств микроорганизмов, входящих в состав УФ-1; определение параметров безвредности, обеззараживающего и обезврелшвающего действия препарата и эффективности использования его для переработки органических отходов агропромышленного комплекса в высококачественное экологически чистое органическое удобрение.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
• изучить морфологические, культуральные, биохимические и патогенные свойства микроорганизмов, входящих в состав УФ-1;
• изучить острую, субхроническую, хроническую токсичность, раздражающее, аллергизирующее, пирогенное, канцерогенное, эмбриотоксическое и тератогенное действия УФ-1;
• изучить обезврелсивающее действие УФ-1 в отношении патогенных микроорганизмов и микотоксинов;
• разработать методы контроля качества препарата;
• оценить эффективность использования УФ-1 для переработки органических отходов агропромышленного комплекса и провести анализ качества получаемого удобрения
Научная новизна. Впервые изучены морфологические, физиолого- биохимические и патогенные свойства штаммов микроорганизмов, входящих в состав препарата УФ-1. Выявлено, что они обладают сахаролитической, протеолитической, уреазной и каталазной активностью, не образуют сероводород и индол, не обладают амилолитической активностью и патогенными свойствами. Штаммы паспортизированы и депонированы во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» (ФГУ ВГНКИ). Установлено отсутствие выралсенной острой и хронической токсичности; пирогенных и раздражающих свойств; отдаленных эффектов действия УФ-1. Выяснена эффективность использования УФ-1 для обеззараживания и обезврелшвания органических отходов контаминированных микроорганизмами, микотоксинами. Предлолсены методы контроля качества препарата и разработана технология утилизации органических отходов сельскохозяйственных предприятий в высококачественное экологическое чистое органическое удобрение. Экспериментально обоснованы дозы препарата.
По материалам диссертационной работы подготовлены и представлены в Федеральный институт промышленной собственности 2 заявки на выдачу патентов на изобретения:
«Штамм Actinomyces fradiae-96 для переработки органических отходов животноводства и птицеводства» (заявка №2005109042 (010708) от 29.03.2005 г.);
«Способ получения органического удобрения» (заявка №2005109044 (010710) от 29.03.2005 г.).
Практическая ценность работы. Предложен и внедрен в производство препарат УФ-1 для переработки различного вида органического сырья в высококачественное экологически чистое органическое удобрение. На основании полученных данных, разработаны и утверждены в установленном порядке следующие нормативно-технические документы (см. приложение 1и2):
«Методические рекомендации по борьбе с микотоксикозами животных в Самарской области», утвержденные руководителем управления реализации целевых программ в животноводстве МСХ и продовольствия Самарской области (1.03.2004);
Технические условия ТУ 9291-00-00492374-04 «Органическое удобрение на основе УФ-1 технологии», утвержденные заместителем Министра сельского хозяйства и продовольствия РТ по земледелию (15.06.2004).
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных сессиях ФГНУ ВНИВИ (г. Казань) по итогам НИР за 2002-2004 г.г., ежегодных республиканских, межрегиональных, всероссийских, международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (Владимир, 2003), «Повышение устойчивости и эффективности агропромышленного производства в Сибири: наука, техника, практика» (Кемерово 2003), «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2004), «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 2004), «Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве» (Чебоксары, 2004), «Актуальные проблемы агропромышленного комплекса» (Казань, 2004), «Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга» (Казань, 2005), «Успехи медицинской микологии» (Москва, 2005), «Агробиотехнологии и экологическое земледелие» (Владимир, 2005).
Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 11 работах, опубликованных в журналах «Био», «Ветеринарный врач» и материалах научно-практических конференций.
Основные положения, выносимые на защиту:
- препарат УФ-1 для переработки органических отходов животноводства и птицеводства в экологически чистое органическое удобрение;
- показатели качества и безопасности препарата УФ-1.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 151 страницах компьютерного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методику исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 38 таблицами, 6 рисунками. Список использованной литературы содержит 240 источника, в том числе 86 иностранных.
Переработка отходов животноводства и птицеводства биологическими методами
В последнее время, все более очевидным становится перспективность использования биологических методов переработки органического сырья. Это как использование в процессе переработки копрофагов (личинок комнатной мухи - Musca domestika S., специальных промышленных линий дождевых червей Eisenia fetida), так и специфических популяций микроорганизмов и грибов.
Во Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства был разработан энтомологический метод утилизации отходов сельскохозяйственных предприятий с помощью личинок комнатной мухи. Процесс переработки (утилизации) осуществляется путем внесения в навоз или помет яиц комнатной мухи и последующей его переработки отродившимися личинками которые за 5-6 дней проходят все стадия развития.
Раецкой Ю.И. и др. (1975) установлено, что в результате жизнедеятельности личинок, влажность навоза снижается в среднем на 24 %, уменьшается количество азота, содержание жира, крахмала и сахара. Количество гемицеллюлозы не меняется. Незначительно повышается содержание клетчатки и резко - золы, за счет уменьшения азотистых веществ. Значительная часть аминокислот навоза используется для питания личинок и кумулируется в их организме. В сухой массе личинок содержание некоторых аминокислот в 2-5 раз больше, чем в навозе, переработанный же субстрат обеднен протеином и аминокислотами. Протеин личинок по аминокислотному составу, особенно по содержанию лизина, близок к таким полноценным кормам, как дрожжи и мясо-костная мука.
В процессе культивирования личинок мух нативный навоз превращается в рыхлую дезорорированную массу темно-коричневого цвета, полученный таким образом биоперегной является хорошим органическим удобрением, существенно улучшает структуру почвы, обладает нематодо и бактерицидными свойствами, повышает урожайность сельскохозяйственных культур (Лукьянов А.К., 1981; Вальков В.И., 1982; Гребенюк И.Н., Орлова С.С., 1982; Кошникович В.И., 1982; Артюшин A.M. и др., 1995; Эрнст Л.К. и др., 2001; Блин Е.Н., 2002). Данная технология позволяет получить также и другие ценные продукты, используемые в многочисленных отраслях сельскохозяйственного производства. Так, например, в связи с содержанием большого количества питательных веществ, муку из личинок комнатной мухи используют при кормлении свиней, птиц, пушных зверей, рыб. Причем, включение в рацион определенного количества муки не только не вызывает каких-либо физиологических отклонений, но и оказывает положительное влияние на продуктивность животных (Гудилин И.И., Баяндина Г.В., 1976, 1995; Баяндина Г.В., 1981; Гудилин И.И., Фридчер А.А., 1981; 1982; Молчанова Н.В. и др., 1982;НугаевШ.А., 1982).
Внесение лечебных препаратов и микроэлементов в субстрат (навоз) для выращивания предкуколок мух (личинки, опарыши) позволяет получить живой лечебный корм, в частности препараты для лечения воспаления воздушного пузыря (краснухи) рыб (Эрнст Л.К. и др., 2000).
Веротченко М.А. и др. (2000), отработана технология получения хитина и хитозана из синантропных мух или форм их постадийного развития (личинок, куколок и пупариев), культивируемых на свином навозе. Хитин и хитозан используются в бумажной, текстильной, косметической, фармацевтической промышленности, в сельском хозяйстве, медицине и биотехнологии.
Во многих странах мира широко применяется технология переработки органических отходов с использованием специальной линии дождевых червей Eisenia foetida, больше известной как «Красный калифорнийский гибрид». В настоящее время в Российской Федерации, имеется ряд промышленных линий компостных червей, полученных на основе местных популяций гибридизацией и селекцией на разные кормовые субстраты (Болотецкий Н.М. и др., 1992; Трувеллер К.А., 1996; Шония A.M., 1996). На территории нашей страны выведен ряд гибридов Eisenia foetida: Владимирский, Моревский, Обнинский, Оболенский, Подольский.
Полученный, в процессе переработки органических промышленных, бытовых и сельскохозяйственных отходов - вермикомпост существенно улучшает водно-физические свойства почвы, оказывает положительное влияние на рост, развитие и продуктивность сельскохозяйственных культур (Мерзлая Г.Е. и др., 1994; Еськов А.И. и др. 2004; Панасин В.И., Рымаренко
Д.А., 2004; Лазарчик В.М. и др., 2005; Ручин А.Б. и др., 2005). По данным Edwards С, ВоЫеп Р. (1996) удобрительная ценность вермикомпоста, его положительное влияние на рост растений и увеличение урожайности, обусловлены наличием доступных элементов минерального питания, обменного кальция и обменной емкости.
Питательные вещества вермикомпоста, максимально сбалансированные по азоту, фосфору, калию, а также микроэлементам. Вермикомпост обладает также бактерицидными свойствами, содержит биостимуляторы и ферменты (Терещенко Н.Н., Бунина А.Б., 2004).
Дождевые черви являются главными потребителями мертвых остатков и разлагающейся органики. Поглощая вместе с почвой и переваривая огромное количество бактерий, грибов, водорослей, простейших они выделяют с копролитами большое количество кишечной микрофлоры, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, обладающих антибиотическими свойствами, препятствуя развитию патогенной микрофлоры, гнилостных процессов, обеззараживая, таким образом, почву. В процессе прохождения через кишечник червей осуществляется механическое разрушение, мацерация фрагментов растительных тканей, склеивание их слизистыми выделениями, минерализация органики с высвобождением ряда элементов питания в подвижной форме.
Санитарно-бактериологический и гельминтологический анализ показывает отсутствие в вермикомпосте патогенной микрофлоры, а также личинок и яиц гельминтов (Павловская Н.Е. и др., 2005). Получаемый вермикомпост характеризуется также низким содержанием семян сорных растений (Попкович Л.В., 2005).
Изучение биологических свойств Actinomyces fradiae-96
При исследовании морфологических свойств штамма на сусло-агаре отмечено образование мелких (1-2 мм), кремового цвета, округлых, выпуклых, вязкой консистенции, мутных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями (S-формы колоний). В жидкой питательной среде (МПБ) рост Actinomyces fradiae характеризовался помутнением, с формированием слизистой пленки, легко разбивающейся при встряхивании.
Исследуемый штамм обладает выраженной сахаролитической активностью и на средах Гисса интенсивно ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, дульцит, лактозу; а с образованием кислоты и газа - мальтозу.
Actinomyces fradiae-96 обладает протеолитической активностью, при посеве культуры уколом в столбик МПЖ и инкубирования посевов в термостате через 24 ч наблюдалось разжижение всего столбика желатина, находящегося в пробирке. Протеолитическая активность исследуемого штамма свидетельствует о выработке фермента желатиназы, под влиянием которого застывший желатин переходит в жидкое состояние (разжижение желатина).
Степень протеолиза и глубину расщепления белка определяли по образованию конечных продуктов распада (индол, сероводород).
При использовании индикаторной бумаги пропитанной уксусно-кислым свинцом не отмечалось характерное черно-бурое окрашивание. Данный штамм не образует сероводород.
При внесении 2 мл эфира в пробирки с трехсуточными культурами исследуемого штамма и наслаивание нескольких капель реактива Эрлиха (пара-диметиламинобензоальдегид 1 г; этанол 96 %-ный 95 см , хлористоводородная з концентрированная кислота 20 см ) не наблюдалось образования на границе МПБ и эфирного слоя кольца ярко-красного цвета, что свидетельствует об отрицательной реакции на индол.
При культивировании испытуемой культуры на скошенном агаре Кристенсена через 72 ч отмечалось покраснение среды, что свидетельствует об уреазной активности.
Исследуемый штамм обладает каталазной активностью, после суспендирования культуральной массы в 3 %-ной перекиси водорода и при нанесении нескольких капель перекиси водорода на поверхность культур на скошенном агаре, отмечалось появление пузырьков газа.
Actinomyces fradiae-96 не обладает амилолитической активностью, так как при нанесении на поверхность агара раствора Люголя не наблюдалось образование бесцветной зоны вдоль штриха, образующейся в результате расщепления крахмала.
Для выявления патогенных свойств исследуемого штамма белым мышам подкожно и внутрибрюшинно вводили культуральную массу в объеме 0,5-1 мл. На данный опыт было использовано 32 половозрелых белых мышей, разделенных по принципу аналогов на 8 групп (таблица 3).
Из таблицы следует, что исследуемый штамм не вызывал гибели белых мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении взвеси культуральной массы в объеме 0,5-1 мл, с содержанием в 1 мл 100, 200, 500 млн. и 1 млрд. микр. кл. При вскрытии вынужденно убитых животных видимых изменений во внутренних органах не наблюдалось. Из тканей внутренних органов убитых животных исходная культура не выделялась. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии у Actinomyces fradiae-96 патогенных свойств.
Штамм паспортизирован как Actinomyces fradiae-96-ВГНКИ 04.05.17.-ДЕП и депонирован 10.08.2004 во «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» (ФГУ ВГНКИ). Справка о депонировании штамма выдана за № 2395/20 от 23.09.2004 (см. приложение 3). Изучение биологических свойств Candida krusei-96 Изучение морфологических свойств исследуемой культуры включало определение формы и размеров клеток в процессе микроскопирования мазков окрашенных по Граму.
В препаратах из агаровых или бульонных культур были обнаружены округлые, грамположительные дрожжевые клетки, размерами: 4,0 ± 0,17 мкм и 5,0 ± 0,3 мкм (Рис. 2). В мазках клетки располагаются по отдельности изолировано или скоплениями в виде цепочек.
2. Candida krusei-96 (х900) При изучении культуральных свойств Candida krusei-96 учитывали характер роста колоний на плотных и жидких питательных средах. Для этих целей использовали сусло-агар и МПБ. На сусло-агаре рост дрожжевых клеток характеризовался образованием мелких (1 мм), округлой формы колоний, мутных, кремового цвета, с ровн ы м и краям и и вязкой консистенци и. Дрожжевые клетки вызывали помутнение МПБ, с формированием слизистой пленки и хлопьев, разбивающиеся при встряхивании.
Сахаролитическую активность исследуемого штамма изучали на средах Гисса с различными углеводами и многоатомным спиртом - глицерином.
Candida krusei-96 на средах Гисса ферментирует мальтозу с образованием кислоты и газа. С образованием только кислоты расщепляет глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, сорбит, дульцит, лактозу.
Candida krusei-96 обладает протеолитической активностью, об этом свидетельствует разжижение всего столбика желатина находящегося в пробирке.
Штамм не образует сероводород, так как не наблюдалось изменение цвета индикаторной бумаги, пропитанной уксусно-кислым свинцом.
Исследуемая культура не образует индол, при использовании эфира и реактива Эрлиха не наблюдалось окрашивание эфирного слоя в малиновый цвет.
При использовании агара Кристенсена через 48 ч отмечалось покраснение среды, что свидетельствует об уреазной активности дрожжевых клеток (гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислоты).
Candida krusei-96 каталазоположительна, сразу после суспендирования культуральной массы в 3 %-ной перекиси водорода, отмечалось появление пузырьков газа. Пузырьки газа появлялись и при нанесении несколько капель 3 % -ной перекиси водорода на поверхность культур на скошенном агаре.
Изучение влияние УФ-1 на функциональное состояние центральной нервной системы
Влияние УФ-1 на антитоксическую функцию печени изучали в опытах на 20 белых крысах обоего пола, живой массой 150-160 г, разделенных по принципу аналогов на 2 группы: опытная и контрольная (п=10). Животным опытной группы в течение 30 суток внутрижелудочно вводили УФ-1 в объеме 0,5 мл, с содержанием в 1 мл 200 млн. микр. кл., контрольной - в аналогичном объеме физиологический раствор. Через 24 ч после введения как препарата, так и физиологического раствора животным внутрибрюшинно вводили гексенал в дозе 80 мг/кг, т.е. 12 мг (1 мл на 100 г массы тела).
В результате проведенных исследований установлено, что УФ-1 не оказывал отрицательного влияния на продолжительность и характер гексеналового сна. Так, у животных опытной и контрольной групп гексеналовый сон наступал через 3,7+0,05 и 3,6+0,05 мин, а продолжительность сна - 23,6+0,35 и 22,9+0,1 мин, соответственно (таблица 13).
Оценку влияния УФ-1 на активность гепатоспецифических ферментов проводили в опытах на 40 белых крысах, обоего пола, разделенных на опытную и контрольную группу (п=20). Подопытным крысам внутрижелудочно, в течение 30 сут, вводили УФ-1 в объеме 0,5 мл (100 млн. микр. кл.), контрольной в аналогичном объеме физиологический раствор. На 5, 20 и 30 сут опыта, по 5 крыс из каждой группы убивали декапитацией для определения активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ). Результаты проведенных опытов представлены соответственно в таблицах 14 и 15. Согласно данным таблиц, многократное введение УФ-1 не оказывало отрицательного влияния на функциональное состояние печени. В сыворотке крови контрольных и опытных животных достоверных изменений Ac AT и АлАТ не наблюдалось.
Местно-раздражающее действие УФ-1 на кожу изучали в опытах на 4-х кроликах породы «Шиншилла» и 4-х морских свинках. За день до проведения эксперимента у животных на симметричных участках спины по обе стороны от позвоночника тщательно выстригали шерсть размером 6x6 см у кроликов и 2x2 см у морских свинок. На кожу правого бока животного шпателем наносили УФ-1, участок кожи левого бока служил контролем - наносили физиологический раствор. Реакцию кожи регистрировали и оценивали с симметричным участком кожи того животного через 1 и 16 ч.
Функциональное нарушение кожи определяли появлением эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры кожи; на участках аппликации выраженность эритемы измерялась визуально.
В течение всего периода наблюдений, каких либо функциональных нарушений кожи (эритема, отек, изъязвления, изменение местной температуры) на месте нанесения препарата не отмечалось.
В следующей серии опытов в конъюнктивальный мешок правого глаза 4-х кроликов глазной пипеткой закапывали по 2 капле УФ-1. Левый глаз служил контролем, в том же объеме закапывали физиологический раствор. После внесения препарата и физиологического раствора на 1 мин прижимали слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. Наблюдение за состоянием слизистой оболочки и прозрачности роговицы проводили в течение недели.
После нанесения на слизистую оболочку глаза УФ-1 и физиологического раствора у животных наблюдались незначительные слезотечение, исчезающие через несколько минут. В дальнейшем каких-либо признаков раздражения слизистой оболочки глаз, выражающиеся в инъецировании сосудов конъюнктивы и гиперемии, не отмечалось, что свидетельствует об отсутствии у препарата раздражающих свойств.
Для выявления аллергенных свойств ускорителя ферментации проводили внутрикожную сенсибилизацию морских свинок массой 250-300 г., разделенных на 2 опытные и контрольную группы по 4 животных в каждой. Подопытным морским свинкам однократно внутрикожно вводили УФ-1 в дозе 0,02 мл (1-я опытная группа) и 0,1 мл (2-я опытная группа). Контрольным животным вводили в том же объеме стерильный физиологический раствор.
Выявление сенсибилизации проводили через 8 дней, используя специфический аллерготест с клетками крови животных - реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Реакцию расценивали как положительную при лизисе лейкоцитов более 10 %. На протяжении всего опыта, видимых кожных изменений на месте введения препарата не отмечалось.
Показатели РСЛЛ у животных 1-ой опытной группы составили 4,5±0,4 %, у 2-ой - 12,4±0,5 %. В то время как у интактных животных не отмечалось увеличение лизиса лейкоцитов, РСЛЛ составила - 4,8±0,3 %. Положительная РСЛЛ обнаруженная только у животных 2 опытной группы, при отрицательной кожной пробе, свидетельствует о слабо выраженной аллергической реакции УФ-1.
Опыты по выяснению пирогенности УФ-1 проведены на 6 кроликах массой 2,3±1,5 г, разделенных по принципу аналогов на опытные и контрольные группы. В течение 3 сут перед проведением эксперимента у каждого кролика с помощью медицинского термометра измеряли температуру тела. Через 30 мин после измерения исходной температуры кроликам опытной группы вводили УФ-1 из расчета 10 мл/кг массы тела. Животным контрольной группы в аналогичном объеме вводили стерильный физиологический раствор. После инъекции препарата и физиологического раствора у животных 3 раза с промежутками віч измеряли температуру тела. В результате проведенных исследований установлено, что УФ-1 не обладает пирогенным действием, так как у подопытных животных не наблюдалось повышении температуры тела выше 0,6С.
Оценка детоксицирующего действия УФ-1 в отношении Т-2 токсина
Для изучения эффективности УФ-1 нами были проведены производственные опыты в условиях свиноводческих, скотоводческих и птицеводческих хозяйств РФ.
Производственные опыты по изучению эффективности переработки свиного навоза препаратом УФ-1 проведены в условиях агрофирмы «Hyp» Кукморского района (см. приложение 5). Для этих целей, на твердую площадку закладывали свиной навоз (высотой не менее 1 м). Поверхность равномерно поливали УФ-1, разведенным в воде в концентрации 1:1000. Затем на обработанную поверхность вновь закладывали навоз и повторяли процедуру полива. Испытывали разные дозы препарата. Ставили 3 опытные и 1 контрольную пробу. Объем заложенных буртов составил 500 т. В 1 опытную пробу вносили УФ-1 из расчета 10 мл/т, во 2 в количестве 20 мл/т и в 3 - 30 мл/т. Поверхность контрольной пробы поливали в том же объеме водой. До и после обработки навозных масс отбирали пробы, как с поверхности, так и с глубины для проведения копрологических и микробиологических исследований. Каждые 10 сут навозную массу перемешивали бульдозером.
Эффективность процессов переработки определяли по выживаемости санитарно-показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечной палочки, сальмонелл). Для изучения влияния УФ-1 на выживаемость гельминтов проводили исследование фекалий методом Фюллеборна.
По окончанию процесса ферментации свиного навоза оценивали качество получаемого продукта. Качество полученного удобрения оценивалось по следующим Параметрам: внешний вид, цвет, массовая доля влаги, содержание общего азота, фосфора в пересчете на Р2О5, калия в пересчете на К20.
В результате проведенных исследований было установлено, что о нативный свиной навоз имел общую микробную обсемененность 3,5-4,9x10 КОЕ/г фекалий (таблица 27).
На 10 сут после обработки свиного навоза УФ-1, микробное число снизилось в среднем на 2-3 порядка по сравнению с фоновым значением. Наиболее выраженный бактерицидный эффект был отмечен при внесении УФ-1 в дозе 20-30 мл/т субстрата. Так, если в исходном навозе микробное число было в пределах 4,9±0,1х108 (2 проба) и 3,8±0,2х108 (3 проба), то после обработки навоза УФ-1 в дозе 20 и 30 мл/т субстрата соответственно 2,5±0,4х105 и ЗД=ьО,1х105 КОЕ/г субстрата (Р 0,001). При использовании для переработки свиного навоза УФ-1 в дозе 10 мл/т микробная обсемененность на 10 сут составила 2Д±0,5хЮ6 при исходном значении 3,5±0,3х108 КОЕ/г субстрата (Р 0,001). На 20 сут после обработки навоза УФ-1 микробное число снизилось
на 5-6 порядков, от нескольких миллионов до несколько сотен (во 2 и 3 пробе) и тысяч (в 1 пробе). Бактериальная обсемененность контрольной пробы в течение 20 сут изменилась незначительно - колебания не превысили 1 порядок. Через 30 сут после обработки свиного навоза УФ-1 общая микробная обсемененность конечного продукта составила: 2,9±0,3xlOz; 1,5±0,3; 2,2±0,7 (Р 0,001) КОЕ/г субстрата (соответственно 1, 2 и 3 проба). Микробная обсемененность в контрольной пробе не притерпевала значительных изменений по сравнению с фоновым значением. Так, на 30 сут опыта микробное число в контрольной пробе составило 1,3±0,5х107 при исходном значении данного показателя 4,2±0,7х108.
Через 10 сут после обработки свиного навоза препаратом УФ-1 количество бактерий группы кишечной палочки снизилось в среднем на 3-4 порядка (Р 0,001), от нескольких миллионов до несколько тысяч, при дозе препарата 10 мл/т и несколько сотен, при дозе - 20 и 30 мл/т (таблица 28). Количество бактерий группы кишечной палочки в 1 пробе на 20 сут составило 13,7±0,9 КОЕ/г субстрата (Р 0,001). На 20 сут после обработки навоза УФ-1 в количестве 20 и 30 мл/т бактерии группы кишечной палочки во 2 и 3 пробе отсутствовали. Через 30 сут после внесения в свиной навоз 10 мл УФ- бактерии группы кишечной палочки в отобранных образцах отсутствовали. В контрольных пробах, содержание бактерии группы кишечной палочки не претерпевало значительных изменений по сравнению с фоновым показателем.
На 10 сут после обработки свиного навоза УФ-1 количество сальмонелл снизилось в среднем на 3-4 порядка (Р 0,001), от нескольких миллионов до несколько тысяч в 1 г фекалий (таблица 29). В последующие сутки отмечалось дальнейшие снижение количества сальмонелл. На 30 сут опыта в отобранных образцах обработанного навоза сальмонеллы не обнаруживались, при наличии в контрольных пробах.
В нативном навозе были также обнаружены яйца Ascaris suum, возбудитель аскаридоза свиней. Использование для переработки навоза УФ-1 в дозе 20 и 30 мл/т (2 и 3 проба) способствовало полному уничтожению яиц гельминтов на 10 сут (таблица 30). В 1 пробе, где применялась доза УФ-1 10 мл/т, наблюдалось лишь частичное обеззараживание субстрата, т.е. обнаруживались единичные яйца аскарид. Через 20 сут после обработки навоза УФ-1 в количестве 10 мл/т, в отобранных образцах яйца гельмитов не обнаруживались. В контрольной, 4 пробе, количественное содержание Ascaris suum в период исследования (30 сут) не притерпевало значительных изменений по сравнению с исходным значением.
Примечание: (-) и (+) отсутствие и наличие яиц гельминтов; ±частичное обеззараживание, наличие единичных яиц гельминтов
Органолептические и физико-химические показатели удобрения, получаемого в результате переработки свиного навоза УФ-1 представлены в таблице 31. Фактическое содержание в навозе азота, фосфора и калия (в % от массы сухого вещества экскрементов) составило соответственно: 3,2±0,9; 1,5±1Д; 2,3±2,5. Массовая доля влаги навоза до обработки составила 82,4±4,9. Согласно данным таблицы Зів исследуемых партиях получаемого удобрения массовая доля влаги составила 24,5-33,5 % (Р 0,05), содержание общего азота 2,49-3,1 % (Р 0,05), фосфора в пересчете на Р205 - 1,18-1,39 % (Р 0,05), калия в пересчете на К20 - 2,0-2,1 % (Р 0,05).
