Сравнительный анализ течения острого обструктивного пиелонефрита, вызванного различными родами неклостридиальных анаэробов (клинико-экспериментальное исследование) Митусова Евгения Валерьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Современное состояние проблемы острого пиелонефрита. Обзор литературы Стр. 12

Глава 2. Материалы и методы исследований Стр.30

2.1. Клиническая характеристика больных Стр. 30

2.2. Методы обследования и лечения больных Стр. 37

2.3. Экспериментальные исследования Стр. 43

2.4. Микробиологические методы исследования Стр. 47

2.5. Морфологические методы исследования Стр. 49

2.6. Методы статистической обработки результатов исследования Стр. 50

Глава 3. Моделирование острого обструктивного пиелонефрита неклостридиально-анаэробными бактериями в эксперименте Стр. 54

3.1. Обоснование моделирования заболевания неклостридиальными анаэробами Стр. 54

3.2. Клинико-лабораторная характеристика течения острого обструктивного пиелонефрита при его экспериментальном моделировании Стр. 55

3.3. Резюме Стр. 65

Глава 4. Бактериологические и гистологические результаты реакции органов и тканей у животных при остром обструктивном пиелонефрите в различные сроки моделирования болезни Стр. 66

4.1. Морфологические изменения в почке, лоханке и мочеточнике в модели острого обструктивного пиелонефрита Стр. 66

4.1.1. Морфологические изменения у животных 1 группы (инфицирование Eubacterium spp.) Стр. 66

4.1.2. Морфологические изменения у животных 2 группы (инфицирование Propionibacterium spp.) Стр. 72

4.1.3. Морфологические изменения у животных 3 группы (инфицирование Bacteroides spp.) Стр. 76

4.2. Результаты бактериологического исследования биоптатов почек, паренхиматозных органов и мочи у животных исследуемых групп Стр. 82

4.3. Резюме Стр. 84

Глава 5. Клинико - микробиологическое исследование пациентов с острым обструктивним пиелонефритом Стр. 85

5.1. Сравнительный клинико-лабораторный анализ двух групп больных получающих эмпирическую терапию Стр. 85

5.2. Микробиота мочи до и после ликвидации обструкции верхних мочевых путей Стр. 87

5.3. Антибиотикочувствительность уроизолятов пузырной мочи при остром обструктивном пиелонефрите Стр. 92

5.4. Клиническая эффективность двух вариантов выбора этиотропной терапии Стр. 99

5.5. Динамика микробиоты мочи у больных с двумя вариантами антибактериальной терапии Стр. 108

5.6. Цитокиновые маркеры воспаления при остром обструктивном пиелонефрите

Заключение Стр. 132

Выводы Стр. 139

Практические рекомендации Стр. 140

Список сокращений Стр. 141

Список литературы

• Экспериментальные исследования
• Клинико-лабораторная характеристика течения острого обструктивного пиелонефрита при его экспериментальном моделировании
• Морфологические изменения у животных 2 группы (инфицирование Propionibacterium spp.)
• Антибиотикочувствительность уроизолятов пузырной мочи при остром обструктивном пиелонефрите

Введение к работе

Актуальность проблемы

Заболевания почек в настоящее время занимают ведущее место в структуре инфекций мочевых путей (ИМП) и регистрируются более чем у 2,2 млн. человек в России ежегодно. Одной из самых тяжелых форм ИМП является острый пиелонефрит (Бешлиев Д.А. и др., 2008; Лоран О.Б. и др., 2008; Аполихин О.И. и др., 2012).

Актуальность проблемы острого пиелонефрита (ОП) характеризуется прогрессивным ростом заболеваемости населения, с преимущественным поражением людей трудоспособного возраста, прежде всего женщин, а также возрастанием случаев хронизации процесса (Colgan R. et al, 2011). Так, в настоящее время у 10,0% - 30,0% пациентов с ОП отмечается рецидивирование инфекции после стандартного курса терапии (Foxman В. et al, 2000; Czaja С.А. et al., 2007; Hawn T.R et al., 2009; Shields J., Maxwell A.P.,2010).

Высокая частота рецидивов ОП после лечения, переход заболевания в хроническую форму побуждают к расширению подхода по изучению этиологической структуры заболевания.

К уропатогенным микроорганизмам, вызывающим более 90,0% инфекций мочевыводящих путей, относят представителей семейства Enterobacteriaceae с доминированием Е. coli, обусловливающей 80,0 - 85,0% всех симптоматических ИМП, в том числе и ОП (Глыбочко П.В. и др., 2006; Сидоренко СВ., 2006; Лоран ОБ. и др., 2008; Максимов В.А., 2012; Натрус Л.В. и др., 2013; Scholes D. et al, 2005; Shields J., Maxwell A.P., 2010; Colgan R, Williams M., 2011; Ragnar N.S. et al, 2012; Drai J. et al, 2012; Wang A. et al.,2013).

Среди энтеробактерий возбудителями ОП помимо E.coli, являются Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. и другие (Стрижаков A.H., Баев О.Р., 2007; Аляев Ю.Г. и др., 2008; Шрайер Р.В., 2009; Рафальский В.В. и др., 2011; Ramakrishnan К., Scheid D.C., 2005; Shields J., Maxwell A.P.,2010).

Однако необходимо отметить, что при осложненных ИМП, к которым относится и острый обструктивный пиелонефрит (ООП), частота выделения грамотрицательной флоры снижается до 60,0%, а Е. coli до 30,0%, и следовательно утверждение о доминировании E.coli и других представителей семейства Enterobacteriaceae в качестве основных патогенов при ОП, особенно когда имеет место его обструктивная форма, является весьма спорным (Ходырева Л.А. и др., 2006; Ермоленко В.М. и др., 2012; Натрус Л.В. и др., 2013).

В настоящее время роль анаэробных микроорганизмов в развитии острых воспалительных поражений почек остается не ясной, несмотря на то, что исследования последних лет достоверно подтверждают наличие в моче

при ИМП неклостридиальных анаэробных бактерий (НАБ) в различном количестве и в составе аэробно-анаэробных ассоциаций (Коган М.И., Набока Ю.Л., 2006; Fouts D.E. et al, 2012; Wolfe A.J. et al, 2012; Lewis D.A. et al., 2013; Trautner B.W., Grigoryan L., 2014). Так, в группу патогенов урогенитального тракта могут входить Eubacterium spp., Bacteroides spp., Propionibacterium spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp. и другие (Greenwood D. et al., 2012).

Ю.Л. Набока и соавт. (2012) выявили обсемененность мочи здоровых женщин НАБ с большим разнообразием микроорганизмов, среди которых преобладали Propionibacterium spp., Peptococcus spp. (по 72,7%), Eubacterium spp. (54,5%), Peptostreptococcus spp. (45,5%), Bacteroides spp. (18,2%), Veilonella spp., Prevotella spp. (no 16,7%) и Actynomyces spp. (8,3%). Количественный уровень выделения НАБ из мочи колебался в пределах 10 -10⁴ КОЕ/мл. Максимальные количественные показатели регистрировали для бактероидов, пропионибактерий и эубактерий.

При этом в современной литературе крайне скудны сведения о возможной связи НАБ с этиологией ОП. Одно из доказательств причастности НАБ к развитию ООП приведено в работе З.И. Газаева (2012), где автор на экспериментальной модели ООП показал роль Peptococcus niger в его развитии. Морфологические исследования установили, что у животных с пептококковой инфекцией воспалительная реакция в почке наблюдалась к 3-м суткам с изменениями идентичными острому пиелонефриту, вызванному Е. соН. Аналогичные результаты были получены и японскими исследователями J.Kumazava, Н. Kiyohara еще в 1939 г., которые воспроизводили экспериментальную модель пиелонефрита на кроликах, где в качестве инфекционного агента использовали культуру Bacteroides fragilis, однако эти результаты не нашли своего прикладного применения в клинической практике до настоящего времени.

Вместе с тем, этиологическое значение других родов и видов НАБ в развитии ООП остается неизвестным и требует углубленного изучения.

Все вышеперечисленное показывает, что этиология острого пиелонефрита, в том числе обструктивного, продолжает оставаться недоизученной, и как следствие этого подходы к терапии данного заболевания осуществляются без учета целого ряда инфекционно-воспалительных факторов, которые могут оказывать серьезное влияние на тяжесть течения патологического процесса и приводить к хронизации заболевания.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение роли различных родов неклостридиальных анаэробных микроогранизмов в развитии острого обструктивного пиелонефрита и повышение эффективности его терапии.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Изучить в эксперименте особенности поражения почек на модели острого обструктивного пиелонефрита при инфицировании лоханочной мочи неклостридиальными анаэробами (Eubacterium spp., Propionibacterium spp., Bacteroides spp.).

2. Оценить бактериологические характеристики мочи до (пузырная моча) и после (лоханочная моча) ликвидации обструкции верхних мочевых путей у больных с острым обструктивным пиелонефритом.

3. Исследовать клинико-бактериологические особенности течения острого обструктивного пиелонефрита при сравнении стандартного и модифицированного подходов к выбору антибиотической терапии.

4. Определить антибиотикочувствительность микроорганизмов пузырной мочи при расширенном бактериологическом исследовании.

5. Исследовать отдаленные результаты лечения острого обструктивного пиелонефрита в связи с анаэробной бактериурией.

Научная новизна исследования

6. Впервые в эксперименте установлено, что различные таксоны неклостридиальных анаэробных бактерий (Eubacterium spp., Propionibacterium spp., Bacteroides spp.) в форме моноинфекции вызывают развитие острого обструктивного пиелонефрита с гнойным воспалением почки, аналогичное острому обструктивному пиелонефриту, вызванному Е.соН.

7. Впервые в эксперименте доказано, что тяжесть токсического синдрома, клинические, морфологические и бактериологические паттерны ООП связаны с родом неклостридиального анаэроба, а наиболее тяжелые деструктивные изменения в почке среди изученных НАБ вызывает Eubacterium spp.

8. Неклостридиальные анаэробные бактерии (Eubacterium spp., Propionibacterium spp., Bacteroides spp.) наряду с обще доказанными патогенами (Е.соН, Proteus spp., Klebsiella spp. и др.) следует рассматривать в качестве этиологических агентов ООП.

9. Впервые показано, что спектры доминирующих в пузырной и лоханочной моче микроорганизмов (энтеробактерии, грампозитивная флора и неклостридиально-анаэробные бактерии) у пациентов с острым обструктивным пиелонефритом до и после ликвидации обструкции значимо не отличаются друг от друга, однако после дренирования почки в моче достоверно ниже (р<0,05) частота присутствия некоторых представителей грампозитивной флоры и неклостридиально-анаэробных бактерий.

Практическая значимость результатов исследования

10. Проведение расширенного бактериологического исследования мочи до и после ликвидации обструкции верхних мочевых путей выявило идентичность спектра микроорганизмов пузырной и лоханочной мочи, что подтверждает правомерность бактериологического исследования средней порции мочи при ООП для назначения этиотропной терапии.

11. Бактериологическое исследование мочи при остром пиелонефрите целесообразно проводить на средах, специфичных для выделения как аэробов, так и анаэробов.

12. Выбор антибиотической терапии ООП должен быть направлен на основные группы доминирующих микроорганизмов, выделенных при бактериологическом исследовании мочи.

Положения, выносимые на защиту

13. При моделировании экспериментального ООП неклостридиальными анаэробными бактериями (Eubacterium spp., Propionibacterium spp., Bacteroides spp.) сроки развития острого воспаления в почке, тяжесть токсического синдрома и выраженность клинической симптоматики зависят от вида инфекционного агента. Экспериментальное введение взвеси Eubacterium spp. 10⁵ КОЕ/мл в лоханку почки вызывает наиболее тяжелое течение заболевания, с ранней манифестацией симптомов (1-3 сутки) и характеризуется развитием гнойного воспаления в почечной ткани с формированием абсцессов и выраженных деструктивных изменений, вплоть до папиллонекрозов, и гематогенным распространением процесса на контрлатеральную почку.

14. Бактериологическое исследование мочи до (пузырная) и после (лоханочная) дренирования верхних мочевых путей не выявляет значимых различий в спектре микрофлоры, которая в большинстве случаев представлена аэробно-анаэробными ассоциациями с преобладанием НАБ (до - 94,4%, после - 89,7%), энтеробактерий (до - 80,5%, после - 80,8%) и грампозитивной флоры (до - 63,8%, после - 52,9%).

15. Использование с 5 - 6 суток лечения ООП модифицированного подхода при проведении антибиотической терапии с воздействием на все микроорганизмы, выделенные при расширенном бактериологическом исследовании мочи, характеризуется более высокой клинической, лабораторной и бактериологической эффективностью лечения и полным купированием основных клинических проявлений ООП через 1 месяц от начала проведения терапии.

16. Общедоказанные (E.coli, Klebsiella spp., Proteus spp. и др.) и дискутабельные патогены (коагулазо-отрицательные стафилококки (КОС), НАБ) наиболее чувствительны к антибактериальным препаратам из группы карбапенемов. Для обще доказанных патогенов наибольшая чувствительность регистрируется к карбапенемам (66,7% - 100,0%), ципрофлоксацину (71,4% -

81,3%), офлоксацину (57,1% - 70,5%), амоксиклаву (62,5% - 66,7%), для НАБ - к карбапенемам (88,1% - 96,6%), тетрациклинам (88,1% - 83,0%) и клиндамицину (91,5%).

5. Использование комбинированной антибиотической терапии ООП позволяет добиться максимальной лабораторной эффективности (100,0%) к 6 месяцу мониторирования, в отличие от случаев, где применяли стандартную антибиотическую терапию, при которой лабораторная эффективность отсутствовала у 39,5% больных в аналогичные сроки наблюдения.

6. Бактериологическое мониторирование мочи у больных ООП через 1,3 и 6 месяцев после окончания лечения показывает, что стандартная антибиотическая терапия приводит к снижению частоты обнаружения и уровня бактериурии только общедоказанных патогенов без изменения аналогичных показателей для дискутабельной флоры. В группе пациентов, где проводили комбинированную антибиотическую терапию, отмечается достоверное снижение частоты обнаружения и уровня бактериурии всех родов микроорганизмов.

Связь с планом научных исследований

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Ростовского государственного медицинского университета в соответствии с программой «Научно - организационные основы профилактики, диагностики и лечения хирургических заболеваний» от 9 декабря 2010г.

Тема, план и сроки диссертационной работы утверждены на заседании Ученого совета по постдипломному образованию Ростовского государственного медицинского университета 21 декабря 2012г., протокол № 10.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Конгрессе урологов Сибири с международным участием (Томск, 2013); V Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы онкоурологии. Заболевания предстательной железы. Новые технологии в урологии» (Абзаково, 2013); 1 Итоговой научной сессии молодых ученых РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2014); Заседании региональной общественной организации «Ассоциация урологов Дона» (Ростов-на-Дону, 2014); V Международной научно-практической конференции «Академическая наука -проблемы и достижения» (North Charleston, USA, 2014); 30 конгрессе Европейской ассоциации урологов (Мадрид, 2015); 1-й Научно-практической конференции урологов Северо-Западного федерального округа «Актуальные вопросы урологии» (Санкт-Петербург, 2015); 2 Итоговой научной сессии молодых ученых РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2015).

Внедрение результатов исследования в работу

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность урологического отделения клиники Ростовского государственного медицинского университета, урологического отделения МБУЗ ГБСМП города Ростова-на-Дону, урологического отделения ГБ №1 им. Н.А. Семашко города Ростова-на-Дону.

Материалы работы используются в учебном процессе кафедры урологии и репродуктивного здоровья человека с курсом детской урологии-андрологии ФПК и ППС, кафедры микробиологии и вирусологии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 - в центральных периодических изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 72 отечественных и 108 зарубежных источников, приложения. Работа иллюстрирована 58 рисунками и 43 таблицами.

Экспериментальные исследования

В России частота возникновения ОП ежегодно составляет до 1,3 млн. случаев, со средним показателем заболеваемости в 2013г. - 15 чел. на 10 000 населения. В Канаде этот показатель составил 11 чел. на 10 000 населения, а в Корее - 35,7 случаев на 10 000 населения. В США ОП ежегодно регистрируется у 400 000 человек, с госпитализацией в 50,0% случаев. (Бешлиев Д. А. и др., 2008; Лоран О.Б. и др., 2008; Аполихин О. И. и др., 2012; Foxman В. et al, 2000; Czaja С.А et al, 2007; Hawn T.R. et al, 2009; Colgan R. et al., 2011).

Острый пиелонефрит характеризуется тендерной приверженностью женщин, которых в 5 раз чаще госпитализируют в стационар из-за более тяжелого течения болезни. Так, частота госпитализаций среди женщин в нашей стране составляет 11,7 случаев на 10 тыс., а среди мужчин - 2,4 на 10 тыс. Важной социальной проблемой также является тот факт, что заболеваемость ОП наиболее часто встречается среди женщин в возрасте от 15 до 35 лет (Уразбаева Д.Ч. и др., 2006; Бешлиев Д.А., Ходырева Л.А., 2007; Плеханов В.Н. и др., 2011; Аполихин О.И. идр.,2012).

Факторами риска развития острого обструктивного пиелонефрита (ООП) являются беременность, сахарный диабет, анатомические аномалии развития мочевых путей и наличие конкрементов в почках (Scholes D. et al., 2006; Shields J., Maxwell A.P., 2010).

He малую роль в развитии ОП и последующей хронизации процесса играет и наследственный анамнез. D. Scholes и соавт. (2010) изучали данный фактор у женщин с хроническими рецидивирующими ИМП. В результате исследования установлено, что до 75,2% женщин, госпитализированных с пиелонефритом, сообщают в анамнезе о наличии ИМП у их матерей, сестер или дочерей, что может свидетельствовать о генетической составляющей повышенной восприимчивости к ИМП.

Клиническая картина острого обструктивного пиелонефрита (ООП) широко варьирует от невыраженного болевого синдрома в поясничной области и диагностируемой на этом фоне положительной культуры мочи, до молниеносного сепсиса у ослабленных больных (Глыбочко П.В., 2006; Lane D.R., Takhar S.S., 2011; Piccoli G.B. et al., 2011; Fujita K. et al., 2012). Так, при госпитализации в стационар пациентов с ООП бактериемия диагностируется в 10,0 - 53,0% случаев, при этом 25,9% больных госпитализированных с явлениями септического шока, несмотря на проводимый широкий комплекс противошоковой, дезинтоксикационной и противовоспалительной терапии, погибают (Mossad S., 2004; Lee D.G. et al, 2009; Lee J.H. et al, 2012; Borofsky M.S. et al, 2013).

A. Kim et al. (2010) изучавшие статистику ОП с самых негативных последствий установили, что внебольничная смертность при этом заболевании составляет 15,7 случаев на 100 000 населения в год, а внутрибольничная - 7,3 случая на 10 000 госпитализаций, даже в странах с высоким уровнем оказания медицинской помощи.

Острый пиелонефрит характеризуется этиологической мультифакторностью. К уропатогенным микроорганизмам, вызывающим более 90,0% ИМП, относят представителей семейства Enterobacteriaceae, с доминированием Е. coli, обусловливающих 80,0 - 85,0% всех симптоматических ИМП, в том числе и ОП (Глыбочко П.В. и др., 2006; Сидоренко СВ., 2006; Лоран О.Б. и др., 2008; Максимов В.А., 2012; Натрус Л.В. и др., 2013; Scholes D. et al, 2005; Shields J., Maxwell A.P., 2010; Colgan R., Williams M., 2011; Drai J. et al, 2012; Ragnar N.S. et al, 2012; Wang A. et al, 2013).

Помимо банальных и различных серовариантов E.coli, возбудителями ОП являются Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. и другие представители энтеробактерий (Стрижаков А.Н., Баев О.Р., 2007; Аляев Ю.Г. и др., 2008; Шрайер Р.В., 2009; Рафальский В.В. и др., 2011; Ramakrishnan К., Scheid D.C., 2005; Shields J., Maxwell A.P., 2010).

Грампозитивная флора, с преобладанием коагулазо-отрицательных стафилококков (КОС), энтерококки, золотистый стафилококк также могут быть этиологическими агентами данного заболевания (Яровой С.К. и др., 2011). Среди КОС ведущим патогеном является S. saprophyticus, вызывающий от 5,0% до 40,0% неосложненного ОП и цистита (Scholes D. et al., 2005; Nicolle L.E., 2005; Ragnar N.S. et al., 2012; Takhar S.S., Moran G.J., 2014).

По данным Harjaik и др. (2005), С. Nieuwkoop и др. (2010), A.J. Schaeffer, E.M. Schaeffer (2012), J. Shields, A.P. Maxwell (2010) к этиологии ОП также причастны неферментирующие грамотрицательные бактерии: P.aeruginoza, В.cepacia, P.fluorescens, Acinetobacter spp. и другие.

Известно, что для правильного и этиологически обоснованного назначения антибактериального лечения, всем пациентам с ИМП, в том числе и при ОП, проводится бактериологическое исследование средней порции мочи, полученной при самостоятельном мочеиспускании (Яковлев СВ., 2000). Однако бактериологическое исследование мочи у пациентов с ОП выявляет микроорганизмы лишь в 49,1% - 90,0% случаев (Ramakrishnan К., Scheid D.C., 2005; Lee D.G., et al., 2009). Причем при наличии осложненных форм пиелонефрита микробиота мочи характеризуется более широким спектром причинных микроорганизмов и, соответственно, большим риском прогрессирования осложнений с возникновением внутрипочечного или околопочечного абсцессов, эмфизематозного пиелонефрита (Ronald А., 2002; ColganR. etal.,2011).

При осложненных ИМП, к которым относится и ООП, частота выделения грамотрицательной флоры снижается до 60,0%, а Е. coli до 30,0%. В то же время у таких больных чаще встречаются другие возбудители - Proteus spp., Pseudomonas spp., Klebsiella spp., грибковая флора, представленная в основном Candida albicans (Ходырева Л.А. и др., 2006; Ермоленко В.М. и др., 2012).

Такую картину, Л.В. Натрус и соавт. (2013) объясняют тем, что возникновение ООП на фоне конкремента в верхних мочевых путях (ВМП) определяет особенность микрофлоры, способствующей воспалению и, соответственно, отличается от типичной микробиологической картины мочи при ОП когда нет обструкции. Авторами так же проведен сравнительный анализ бактериологических результатов микробиоты мочи у пациентов с ОП и ООП. Отмечено, что монокультуры были причиной ИМП в 34,0%, ассоциации 2-х культур - в 35,0%, 3-х культур в 25,0% случаев. При этом E.coli не выступала в роли ведущего патогена при ООП и выявлялась в виде монокультуры в количестве 105 КОЕ/мл лишь в 5,0% случаев. Основную картину представляли монокультуры E.faecalis, его ассоциации со S. haemolyticus или P. aeruginosa в количестве 103-104КОЕ.

Клинико-лабораторная характеристика течения острого обструктивного пиелонефрита при его экспериментальном моделировании

В эксперименте использовали 48 часовые культуры анаэробных бактерий, выращенных на агаре Шадлера. Далее готовили бактериальную взвесь, стандартизированную по оптическому стандарту (1,0 мл - 105КОЕ).

Перед началом эксперимента у подопытных животных измеряли ректальную температуру, забирали кровь и мочу для выполнения общеклинических и бактериологических исследований.

Содержание, питание, уход за животными до и после введения в эксперимент осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 №5). Всех животных содержали при сходных условиях: температура 20-23С, влажность 70-75%, освещение с 12-часовым циклом свет-темнота, соответствующий рацион питания. Кролики имели свободный доступ к пище и воде и в течение недели адаптировались к новой окружающей среде перед экспериментом.

После введения в эксперимент, у животных ежедневно оценивали общее поведение (активность, подвижность, аппетит, наличие озноба, диареи), измеряли ректальную температуру, исследовали уровень лейкоцитов в крови.

По протоколу экспериментального исследования, животных умервщляли на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки. Вскрытие проводили в операционной в асептических условиях и забирали сегменты следующих органов: почек, печени, селезенки, легкого и сердца для гистологического и бактериологического исследований.

Для бактериологического исследования сегменты забранных тканей размерами 1x1x1см помещали в стерильные пластиковые контейнеры «Eppendorf», содержащие 1,0 мл тиогликолевого буфера. Также в стерильных условиях, пункционно, из левой лоханки забирали мочу для бактериологического исследования. Пробы мочи и сегменты забранных органов транспортировали в лабораторию в течение 30 минут после их забора.

Посев мочи и степень бактериурии изучали по методике В.В.Меньшикова (2009) с использованием расширенного набора питательных сред, включающего среды для анаэробов - среда Блаурокка, Anaerobic Agar, Shaedler Agar, Shaedler Broth, Bacteroides Bile Esculinum Agar. В жидких и полужидких средах уровни бактериурии определяли методом серийных разведений. Посевы инкубировали в анаэробных условиях 48-72 часа. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по морфо-тинкториальным, культуральным и биохимическим (Lachema тест-систем) признакам.

Для проведения гистологического исследования забирали сегменты тех же тканей, что и для бактериологического исследования, и фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина с последующим обезвоживанием препаратов и приготовлением гистологических срезов для верификации произошедших изменений в органах и их фотографированием под микроскопом (Leica DND 180).

Исходя из основной цели данного исследования - изучить роль различных родов НАБ в развитии ООП, микробиологический и морфологический разделы работы ставили задачу изучить роль данных микроогранизмов в развитии ООП не только в эксперименте, но и в клинике. В табл. 2.4.1 представлен перечень биологических тканей и жидкостей, которые были подвергнуты микробиологическим исследованиям.

Для определения бактериурии у пациентов с ООП исследовали среднюю порцию мочи, полученную при госпитализации в стационар. Забор материала проводили в соответствии с Методическими указаниями 4.2. 2039-05 (2006). Степень бактериурии определяли по методике Меньшикова В.В. (2009), но с использованием расширенного набора питательных сред. Для факультативно-анаэробных бактерий применяли среды Endo Agar, HiCrome Candida Differential Agar, HiCrome Enterococci Agar, HiCrome Aureus Agar Base, желточно-солевой агар, Blood Agar Base. Для выделения НАБ использовали среды Блаурокка, Anaerobic Agar, Shaedler Broth, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar. В работе в основном использованы питательные среды Himedia (Индия). Для определения НАБ в жидких (Shaedler Broth) и полужидких средах (Блаурокка) проводили десятикратные разведения в тиогликолевом буфере с высевом на соответствующие питательные среды (патент РФ на изобретение № 2010147953 от 24.01.12).

Посевы аэробных бактерий инкубировали в термостате 24 - 48 часов, анаэробных - 48 - 72 часа (температура 37С). Для создания анаэробных условий использовали HiAnaerobic System - Mark VI с индикатором анаэробиоза (HiAnaero Indicator Tablet) в присутствии газовой смеси (10% С02 , 10% Н2, 80% N2) или AnaeroHiGas Рак.

Идентификацию выделенных бактерий проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам с помощью энтеро-, стафило-, неферм-, анаэростэстов (Lachema, Чехия).

Чувствительность выделенных из мочи микроорганизмов к антибактериальным препаратам различных групп (36) определяли диско-диффузионным методом на агаровой среде Mueler Hinton (Методические указания 4.2. 1890-04 от 04.03.04) с помощью стандартных дисков фирмы «Himedia» (Индия).

Гистологическое изучение изменений в почках и внутренних органах при инфицировании лоханочной мочи различными НАБ при воспроизведении экспериментальной модели ООП являлось важной доказательной базой для выяснения роли различных родов данных бактерий в развитии заболевания. Проводили изучение морфологических изменений в почках, печени, селезенке, легких и сердце в различные сроки после воспроизведения экспериментальной модели заболевания (табл. 2.5.1).

Для патогистологического исследования из различных отделов обеих почек, лоханки, клетчатки почечного синуса и паранефрия, вырезались кусочки, с последующей фиксацией 10% забуференным нейтральным формалином. В дальнейшем препараты обезвоживались, заключались в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином-эозином по классической методике с последующим изучением и фотографированием под микроскопом LeicaDND180.

Полученные в результате исследования данные будут подробно освещены в отдельной главе данного исследования.

Для обработки полученных данных использовались статистические методы: получение средних значений и средне-квадратичных ошибок, Т-критерий Стъюдента, а также коэффициент корреляции Спирмена и дискриминантный анализ. Применяли общепринятые уровни значимости: р 0,05; р 0,01и р 0,001.

Для расчета этих параметров была использована программа Regpar. Regpar - программа определения статистических параметров, необходимых при обработке исходной информации и согласовании ее с полученными клиническими и инструментальными исследованиями.

Процедура статистической обработки полученных данных проводилась на персональном компьютере типа IBM PC/AT с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 электронных таблиц Excel 2009. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов и экспериментов в медицине.

Морфологические изменения у животных 2 группы (инфицирование Propionibacterium spp.)

Полученные данные по антибиотикочувствительности общедоказанных патогенов, выделенных из мочи пациентов обеих групп, в большинстве случаев корреспондируют, что свидетельствует о сопоставимости групп по изучаемому признаку.

К дискутабельным патогенам в развитии ООП относят обширные (в таксономическом отношении) группы КОС и НАБ. При поступлении (до дренирования) у пациентов 2 группы в моче КОС обнаруживали в 41,1% случаев. Паттерн КОС был представлен видами S.haemolyticus (23,6%), S. epidermidis (11,7%), S. lentus (5,8%). Эффективными препаратами в отношении КОС (рис. 5.3.8) являлись карбапенемы (78,6%-92,9%), амоксиклав (71,4%) и некоторые цефалоспорины (цефаклор (64,3%), цефотаксим и цефепим (по 57,1%)). Рисунок 5.3.8.- Антибиотикочувствительность КОС выделенных из мочи пациентов 2 группы Паттерн выделенных из мочи НАБ был представлен 6 родами: Eubacterium spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Megasphaera elsdenii Наиболее эффективными препаратами «Рисунок 5.3.9» в отношении НАБ являлись карбапенемы, клиндамицин (91,5%), тетрациклин (88,1%), доксициклин (83,0%), цефокситим (81,3%), а также моксифлоксацин (74,6%), амоксиклав (71,2%), ампициллин/сульбактам (62,7%).

Антибиотикочувствительность НАБ выделенных из мочи пациентов 2 группы Таким образом, у пациентов с ООП на основании изучения результатов индивидуальных антибиотикограмм, выделенных из мочи общедоказанных и дискутабельных патогенов, можно сделать заключение о том, что, несмотря на выявленную множественную лекарственную устойчивость, наиболее эффективными препаратами являются карбапенемы. Эшерихии, выделенные из мочи пациентов обеих групп, были также чувствительны к офлоксацину, ципрофлоксацину, клебсиеллы - амоксиклаву. Достаточно высокие показатели чувствительности к имипенему, офлоксацину и левофлоксацину регистрировали для энтерококков. Для выделенных из мочи штаммов КОС, помимо карбапенемов и амоксиклава, эффективными препаратами являлись некоторые цефалоспорины - цефаклор, цефотаксим, цефепим.

НАБ обладали чувствительностью не только к карбапенемам, но и к тетрациклинам, клиндамицину и некоторым другим препаратам. Необходимо отметить низкую чувствительность к метронидазолу ( 40,0%). Несмотря на общие выявленные тенденции по антибиотикочувствительности и сопоставимости групп по изучаемому признаку, были выявлены некоторые различия по показателям антибиотикочувствительности, что, возможно, связано с ранее проведенными курсами антибактериальной терапии до поступления пациентов в стационар, гетерогенностью бактериальной популяции по изучаемому признаку, наличию различных факторов внехромосомной наследственности у бактерий, в частности, R - плазмид, кодирующих признак множественной лекарственной устойчивости и другими факторами.

1 группа (n=38) - пациенты, которым на 6 сутки лечения, после получения бактериологических результатов исследования мочи, проводилась смена антибактериальной терапии, основанной на результатах индивидуальной чувствительности общедоказанных патогенов (представители семейства Enterobacteriaceae, энтерококки, золотистый стафилококк, P. aeruginosa и т.д.) в соответствии с рекомендациями Европейской ассоциации урологов.

2 группа (п=34) - пациенты, которым на 6 сутки лечения также осуществлялась смена антибактериальной терапии в соответствии с результатами индивидуальных антибиотикограмм, учитывающих присутствие в моче как общедоказанных, так и дискутабельных патогенов (КОС, НАБ).

В связи с избранной концепцией лечения, было целесообразно проанализировать основные параметры течения болезни в группах к 5-м суткам проведения у них идентичной антибиотической терапии и оценкой сохранившихся клинических и лабораторных проявлений пиелонефрита (табл.

Как видно, к началу проведения этиотропной антибиотической терапии у пациентов обеих групп достоверных различий в общеклиническом течении болезни не отмечено, что подтверждалось и данными лабораторных исследований.

Этиотропная антибиотическая терапия проводилась пациентам обеих групп с 6 по 21 сутки с учетом результатов индивидуальных антибиотикограмм и чувствительности выделенных патогенов к антибиотическим препаратам. Парентеральное введение антибиотиков продолжали до исчезновения гипертермии тела и ее отсутствия в течение 2 суток, затем осуществляли переход на пероральные формы препаратов.

Общая продолжительность антибиотической терапии у пациентов обеих групп составила 21 сутки. К 14 суткам все пациенты были выписаны из стационара. В связи с этим, исходя из задач исследования, нами были изучены и проанализированы эти же показатели в группах на 14 сутки болезни. В табл. 5.4.8 - 5.4.12 представлены изучаемые показатели как в абсолютных цифрах, так и в процентах купирования того или иного синдрома {клиническая эффективность - КЭ) и в процентах стабилизации изучаемых лабораторных показателей крови (лабораторная эффективность - ЛЭ).

Антибиотикочувствительность уроизолятов пузырной мочи при остром обструктивном пиелонефрите

Общее число больных, вошедших в исследование составило 72 человека, причиной обструкции у которых были конкременты мочеточника: лоханочно-мочеточникового сегмента - 9,7%, верхней трети мочеточника - 29,1%, средней трети - 16,7%, нижней трети - 44,5% . При госпитализации в стационар всем пациентам выполнялось бактериологическое исследование 2 порций мочи, взятых до и после дренирования ВМП, с использованием расширенного набора питательных сред, перед началом проведения антибиотической терапии. Во всех случаях ликвидация обструкции была осуществлена в первые 3-6 часов с момента госпитализации больных одним из ниже перечисленных видом малинвазивного вмешательства: стентирование мочеточника - 69,4%, ЧПНС -11,1%, катетеризация мочеточника с последующим его стентированием - 19,5%.

После ликвидации обструкции в течение первых 5 суток всем пациентам назначалась идентичная эмпирическая антибиотическая терапия, вплоть до получения результатов бактериологического исследования мочи.

С 6 по 21 сутки пациентам обеих групп проводилась различная по этиологической направленности антибиотическая терапия. В 1 группе - с учетом антибактериальной чувствительности обще доказанных патогенов (E.coli, Klebsiella spp., Proteus spp.), во 2 группе - с учетом антибактериальной чувствительности не только общедоказанных, но и дискутабельных патогенов, прежде всего НАБ.

При госпитализации в стационар пациенты обеих групп имели сходную клиническую симптоматику с преобладанием боли в поясничной области и гипертермии тела (по 100,0%). Также больные жаловались на тошноту (52,8%) и рвоту (13,9%), озноб (25,0%) и учащенное мочеиспускание (16,7%). Необходимо отметить, что к началу проведения пациентам разнонаправленной антибиотической этиотропной терапии, были проанализированы основные параметры течения заболевания, при этом достоверных различий в общеклиническом течении ООП у пациентов 1 и 2 групп не выявлено. Так, к 5 суткам проводимой терапии болевой синдром в поясничной области сохранялся у 31,5% пациентов 1 группы, и у 29,4% - 2 группы. Гипертермию тела регистрировали у 57,8% пациентов в 1 группе, и у 55,8% - во 2 группе. Нормализация показателей гипертермии тела к 5 суткам отмечена у 42,1% больных 1 группы, и у 44,1% - 2 группы. Оценка лабораторных показателей течения болезни также не выявила достоверных различий.

На 14 сутки все пациенты были выписаны из стационара, с предварительной оценкой клинической и лабораторной эффективности проводимой терапии.

В данный период мониторинга отмечена достоверная регрессия всех основных симптомов заболевания у пациентов 2 группы. Так, болевой синдром во 2 группе сохранялся лишь в 2,9% случаев, в то время как в 1 группе боль в поясничной области отмечали 13,1% пациентов. Гипертермия тела у пациентов 2 группы к 14 суткам отсутствовала у 94,1% больных, в то время как в 1 группе гипертермия тела на уровне субфебрильных значений сохранялась у 18,4% пациентов.

Основным критерием оценки лабораторной эффективности лечения было отсутствие пиурии в общем анализе мочи как к моменту окончания антибиотической терапии (21 сутки), так и на протяжении последующего периода наблюдения в течение 6 месяцев.

Так, если к 21 суткам частота обнаружения пиурии в общем анализе мочи в 1 и 2 группах достоверно не отличалась ( 47,4% и 55,9% соответственно), то к 1 месяцу и в последующие сроки наблюдения достоверно уменьшалось количество пациентов с наличием пиурии, особенно во 2 группе. Через 1 месяц после завершения антибиотической терапии нормальный анализ мочи отмечен у 79,4% больных во 2 группе, и у 47,4% в 1 группе. К 3 месяцу пиурия отсутствовала у 94,1% пациентов 2 группы, и у 63,1% пациентов 1 группы. Через 6 месяцев у 100,0% больных во 2 группе регистрировали нормативные показатели лейкоцитов в моче, в то время как в 1 группе в 39,5% случаев обнаруживали пиурию. Другим критерием оценки эффективности проведения двух вариантов разнонаправленной антибиотической терапии были результаты бактериологического мониторинга мочи, который проводили через 1,3 и 6 месяцев после окончания лечения.

Так, у пациентов 1 группы в динамике обследования наблюдали снижение частоты обнаружения и уровня бактериурии для всех представителей семейства Enterobacteriaceae. В частности, средний уровень бактериурии для E.coli при поступлении составил 105 2, спустя 6 месяцев - 1020, для Klebsiella spp. - 105 3 при поступлении и 10 через 6 месяцев.

Для представителей грампозитивной флоры и НАБ в 1 группе отмечали иную динамику показателей. Так, частота обнаружения и уровень бактериурии для КОС достоверно увеличивались к 6 месяцу (47,3%, 101 9 при поступлении и 76,3%, 10 через 6 месяцев). Для НАБ прослеживалась аналогичная динамика (100%, 101 8 при поступлении и 100%, 103 8 через 6 месяцев).

Таким образом, у пациентов 1 группы абсолютную бактериологическую эффективность с элиминацией микроорганизмов из мочи в группе общедоказанных патогенов наблюдали для E.coli в 90,5% случаев, для Klebsiella spp. в 50% случаев, для Proteus spp., P. rettgeri, P. aeruginosa, S. aureus во всех случаях.

Однако, если рассматривать относительную бактериологическую эффективность, заключающуюся в снижении уровня бактериурии в динамике исследования, то ее регистрировали во всех случаях для Е. coli и Klebsiella spp.

К общедоказанным патогенам ОП также относят и многочисленную группу энтерококков, патогенный потенциал которых лучше изучен для вида Е. faecalis. В исследуемой когорте больных частота обнаружения энтерококков повышалась в динамике исследования, однако их количество во все сроки наблюдения колебалось в пределах формально допустимых для данной нозологии.

В группе дискутабельных патогенов, в частности CNS и НАБ отсутствовала как абсолютная, так и относительная бактериологическая эффективность с плавным нарастанием уровня бактериурии от незначительного при поступлении (101 9 КОЕ/мл и 101 8 КОЕ/мл соответственно) до практически диагностического через 6 месяцев (104 7 КОЕ/мл и 103 8 КОЕ/мл).

У пациентов 2 группы частота обнаружения представителей семейства Enterobacteriaceae достоверно (р 0,05) снижалась в динамике. Так, для E.coli показатели составили 50,0% при поступлении, и 8,8% через 6 месяцев наблюдения. Уровни бактериурии были 10 при поступлении и 10 спустя 6 месяцев, соответственно.

Так же как у и пациентов 1 группы, возрастала частота обнаружения КОС через 1 и 3 месяца, но, в отличие от 1 группы уровень бактериурии был минимальным. К 6 месяцу обследования для данной группы микроорганизмов отмечали снижение частоты обнаружения и уровня бактериурии.

Для НАБ количественные характеристики достоверно снижались для эубактерий, пептострептококков, бактероидов и вейллонелл.

У пациентов 2 группы к 6 месяцу динамического наблюдения абсолютную бактериологическую эффективность для E.coli регистрировали в 82,4% случаев, для Klebsiella spp. в 50% случаев. Относительную бактериологическую эффективность регистрировали во всех случаях как для общедоказанных, так и дискутабельных патогенов.

Таким образом, представленные экспериментальные и клинические сведения показывают, что неклостридиальные анаэробные бактерии играют важную роль в этиопатогенетическом звене развития и течения острого обструктивного пиелонефрита. Поэтому общепризнанная и являющаяся стандартом лечения антибиотическая терапия, с воздействием на общепризнанные патогены, не в полной мере позволяет минимизировать хронизацию патологического процесса после купирования острых проявлений заболевания.

Проведение антибиотической терапии с учетом чувствительности всех выделенных из мочи ассоциантов, в первую очередь НАБ, позволяет существенно снизить в 2-2,5 раза вероятность развития рецидива заболевания к 6 месяцу наблюдения, что подтверждается данными лабораторных исследований мочи.