Содержание к диссертации
Введение
Глава № 1 Обзор литературы 12
1.1 Медико-социальная значимость МКБ 12
1.2 Роль инфекции мочевыводящих путей в развитии МКБ 14
1.3 Биопленка как среда выживания и распространения бактерий 17
1.4 Проблема профилактики рецидива инфекционных камней после оперативного лечения 22
Глава № 2 Материалы и методы исследования 35
2.2 Методы исследования 38
2.3 Проводимое лечение 46
2.4 Статистическая обработка данных 49
Глава № 3 Результаты и обсуждение результатов 51
3.1 Поиск новых режимов антибиотикопрофилактики септических осложнений после перкутанной нефролитотрипсии 51
3.2 Эффективность антибактериальной профилактики в раннем и позднем послеоперационном периодах, назначенной на основании результатов бактериологических исследований мочи и камня взятых во время операции. 57
3.2.1. Оценка дооперационного состояния пациентов. 57
3.3.2 Эффективность антибактериальной профилактики назначенной на основании результатов бактериологических исследований мочи и камня взятых во время операции . 65
3.2.3 Оценка микрофлоры мочи в послеоперационном периоде у исследуемых пациентов 73
3.2.3 Развитие рецидивных камней за период наблюдения . 82
Заключение 89
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 100
- Биопленка как среда выживания и распространения бактерий
- Поиск новых режимов антибиотикопрофилактики септических осложнений после перкутанной нефролитотрипсии
- Эффективность антибактериальной профилактики назначенной на основании результатов бактериологических исследований мочи и камня взятых во время операции
- Развитие рецидивных камней за период наблюдения
Биопленка как среда выживания и распространения бактерий
Образующие биопленки бактерии, могут, находясь в составе самой биопленки, быть сессильными, и, при их дисперсии из биопленки, планктонными. В свою очередь планктонные бактерии, при их фиксации на биотическом или абиотическом субстрате, способны сами образовывать биопленки, то есть переходить в сессильную форму [51].
Под действием стрессовых факторов например, при приеме антибиотиков из планктонных форм формируются клетки-персистеры, численность которых внутри разных биопленок составляет от 1% до 10%. Персистер - фенотипический вариант клеток с обычным для данного штамма генотипом, но с сильно замедленным метаболизмом. При этом выявлено, что персистеры нечувствительны практически ко всем антибиотикам [57]. Трансформацию бактерий в персистеры в настоящее время объясняется существованием системы «токсин – антитоксин». В клетке бактерии в обычных условиях синтез «токсина» и «антитоксина» постоянно происходит в равной степени, вследствие чего «токсин» нейтрализуется. При воздействии стрессового фактора синтеза «антитоксина» нарушается «токсин» может реализовать свою активность, что приводит к замедлению обменных процессов бактериальной клетки [52]. В то же время антибиотики могут воздействовать только на метаболически активные клетки. То есть наличие в биопленке персистеров можно расценить в качестве одного из основных их механизмов антибиотикорезистентности. Метаболические процессы персистеров настолько замедлены, что бактерицидные антибиотики могут оказывать на них только бактериостатический эффект [96, 99]. Несмотря на то, что большинство бактерий биопленки находятся в неактивной фазе жизненного цикла, с поверхностных слоев постоянно происходит дисперсия планктонных форм колонизирующих новые территории. т.е. биопленки создают особую среду для выживания и распространения микробов [66, 110].
Развитие резистентности может быть связано с повышением числа мутаций бактерий в биоплёнке. Так для P. aeruginosa было выявлено, что к появлению резистентности к антибиотикам ведет угнетение антиоксидантных систем в клетках биоплёнок, приводящее к кислородозависимому повреждению ДНК, накоплению множественных мутаций [114, 116]. Множественная резистентность может быть обусловлена и с фильтрующей способностью матрикса, который не только связывает клетки в единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, образуя трехмерную фильтрующую систему, ограничивающую диффузию антибактериальных веществ [52]. Ряд элементов матрикса биопленки могут связывать антимикробные вещества. Так слизь, продуцируемая некоторыми бактериями, заполняет межклеточное пространство в биоплёнках, и может связывать антибиотик [36]. Роль нарушения биопленки для развития резистентности была продемонстрирована в исследовании исследования O. Ciofu et al. (2012), которые продемонстрировали, что слизеподобный характер биопленки P. aeruginosa способствовал высокой устойчивость к действию тобрамицина [75]. Устойчивости бактерий в биопленках способствует и каталитическое расщепление с помощью ферментов. При образовании в клетках биопленки ферментов, вызывающих деградацию или модификацию антибиотиков, отмечается синергидное действие механизмов защиты. Задержка проникновения антибиотиков в биопленку приводит к уменьшению их концентрации, помогая бактериальным ферментам успеть инактивировать поступающее вещество [117]. Также множественная резистентность биопленки может быть связана с тем, что внутри нее могут присутствовать популяции микроорганизмов с разными защитными свойствами, дополняющими друг друга [51].
Генетическое взаимодействие нескольких видов бактерий внутри биопленки позволяет бактериальному сообществу более гибко реагировать на факторы окружающей среды [52]. Заметную роль в способности других видов внедряться в существующую биопленку, играют специфические характеристики экзополисахаридного матрикса [115]. Развитие резистентности бактерий биопленки зависит от многих факторов. К ним можно отнести, к примеру, формирование резистентности к антибиотикам бактерий биопленки P. aeruginosa под действием недостатка кислорода, бактерий K. pneumoniae - ограничения питательных веществ, и, конечно же, сигналы Quorum Sensing (QS) систем регуляции [36, 72, 86]. Так при ограничении/лимитировании питательных веществ, с помощью активных ответов на голодание/стресс у бактерии биопленки P. aeruginosa развивается высокая резистентность к антибиотикам, которая зависит от способности клеток модулировать продукцию прооксидантных хинолонов [86].
Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид-кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. По сравнению с чистыми культурами бактерий продукция метаболитов и биологически активных веществ в биопленке происходят по иному принципу. В начале 90-х годов был описан феномен коллективного поведения бактерий, указывающий, на то, что микроорганизмы, составляющие биопленку образуют, Quorum Sensing [57]. Формирование, рост биопленки и дисперсия планктонных форм осуществляется посредством межклеточной коммуникации через молекулы – мессенджеры [17]. В биопленках существует единая генетическая система несущая информацию о пищевых и энергетических связях бактерий биопленки, представляющая собой плазмиды – кольцевые ДНК. Она же является фактором переноса генов устойчивости к антибиотикам, обеспечивая синтез измененных рецепторов микроорганизмов, выработку ферментов, разрушающих антибиотики и др. [100].
Большинство исследователей выделяют следующие фазы в формировании биопленки: адгезия, колонизация, созревание и стадия распространения [61, 113]. Многие микроорганизмы не имеют механизмов адгезии непосредственно к инородным телам, при этом очень важным является начальный этап формирования биопленки - отложение мочевых компонентов на биоматериалах. В этом случае происходит их отложение на поверхности до начала поступления первых микроорганизмов. При этом протеины, входящие в состав отложений обеспечивают рецепторные места для бактериальных адгезинов, изменяя поверхностные характеристики инородных тел [109, 118, 119].
Далее за счет гидрофобных и электростатических сил осуществляется первичная адгезия, которая обратимый характер. Вторичная адгезия является специфической, осуществляется за счет специальных молекул (адгезинов и лектинов) [93]. Затем путем агрегации бактериальных клеток и формирования микроколоний, происходит образование микроколоний и синтез экзополисахаридного матрикса [17, 57].
Созревание биопленки совершается в процессе размножения микроорганизмов биопленки за счет активного синтеза компонентов межклеточного матрикса и формирования упорядоченной многослойной структуры. При этом образование жгутиков и адгезинов ингибируется Quorum Sensing системами, под контролем которых также часто находится активация генов определяющих возможность синтеза внеклеточных полимеров. Клетки, которые раньше прикрепились к поверхностям, облегчают прикрепление последующих клеток из окружающей среды, у бактерий теряются подвижность, часть из них слипаются друг с другом и начинают выделять внеклеточные полимеры, которые формируют внеклеточный полимерный матрикс, при этом накапливаются питательные вещества, клетки начинают делиться и образуют многоклеточный слой [36, 76, 77].
Поиск новых режимов антибиотикопрофилактики септических осложнений после перкутанной нефролитотрипсии
Для сравнительной оценки разных режимов периоперационной антибактериальной профилактики инфекционно-воспалительных осложнений после перкутанной нефролитотрипсии проведено клинико фармакокинетическое исследование. После подписания информированного согласия, были включены 30 пациентов с предстоящей перкутанной нефролитотрипсией по поводу коралловидных и крупных камней почек. Из них 21 (70,0%) женщин и 9 (30,0%) мужчин, возрастом от 20 до 75 лет, средний возраст составил 51,3 года. Больных случайным образом подразделили на две группы, рандомизацию проводили с помощью таблицы случайных чисел.
1 группа (n=15), основная, проводили периоперационную антимикробную профилактику в виде внутривенной капельной инфузии 1000 мг ципрофлоксацина в течение всей операции (45-60 мин); 2 группа (n=15), группа сравнения, пациенты получали препарат путем внутривенного болюсного введения 1000 мг ципрофлоксацина в течение 5-6 минут на вводном наркозе.
Из сопутствующих заболеваний у пациентов обеих групп чаще всего встречались гипертоническая болезнь (53,3%), сахарный диабет (30%). Достоверных различий по сопутствующим заболеваниям в двух группах не выявлено. При исследовании химического состава камней чаще определяли смешанные камни, такие как карбонатапатит, струвит, мочевая кислота, вевеллит и карбонатапатит; мочевая кислота и аммоний урат, ведделлит. Достоверных различий в химическом составе камней в исследуемых группах не выявлено.
Результаты бактериологических анализов представлены в Таблице №3.
Таким образом, уропатогены выделены и в моче из лоханки во время операции и в камнях, причем в камнях микроорганизмы обнаружены чаще (60% против 40%). Оценивая характеристики больных исследуемых групп можно отметить, что 1 и 2 группы сравнимы по всем основным исходным показателям. Отмечается меньшая инфицированность мочи до госпитализации у пациентов во 2 группе. (Таблица № 4)
В 1 группе проводили антимикробную профилактику в виде внутривенной капельной инфузии 1000 мг ципрофлоксацина в течение всей операции (45-60 мин); во 2-ой группе пациенты получали препарат путем внутривенного болюсного введения в течение 5 минут 1000 мг ципрофлоксацина перед основным этапом. Пробы крови 5 мл забирали через 10, 20, 40, 60 мин (последний забор совпадал со временем окончания оперативного вмешательства). Перед введением антибиотика забирали 5 мл крови, для контрольного анализа.
Результаты фармакокинетического исследования концентрации ципрофлоксацина 1000 мг в сыворотке крови при продленном внутривенном капельном введении в течение всей операции 45-60 минут (1 группа) и болюсном внутривенном введении (2 группа) отображены в Таблице № 5.
Таким образом, достоверные различия в создаваемых концентрациях отмечаются только через 10 и 20 мин после введения (выше при болюсном способе введения), начиная с 40 мин, достоверных отличий в сывороточных концентрациях ципрофлоксацина не выявлено, однако, сохраняется тенденция к более высоким значениям при использовании болюсного способа введения. В то же время, при болюсном методе введения отмечается большая вариабельность кинетики антибиотика. Учитывая известные данные о периоде полувыведения (T) ципрофлоксацина, равным 5,5-6 часов, становится очевидным, что эффективные концентрации ципрофлоксацина (выше МПК90 для большинства микроорганизмов) сохранятся как минимум в течение 12 часов после введения.
При оценке клинической эффективности сравниваемых режимов дозирования ципрофлоксацина 1000 мг антибактериальной профилактики инфекционно-воспалительных осложнений также отмечена несколько лучшая эффективность продленной внутривенной инфузии ципрофлоксацина 1000 мг в течение всей операции.
Так в 1 группе (n=15), получивших продленную инфузию антибиотика на протяжении всей операции, в раннем послеоперационном периоде отмечена кратковременная гипертермия до 37.0-38.0 С, без озноба, температуры тела нормализовалась уже ко вторым суткам, признаки системной воспалительной реакции не отмечались. В то время как во 2 группе (n=15), у пациентов, получивших болюсное введение ципрофлоксацина 1000 мг во время операции, в первые сутки у 2-х (13,3%) пациентов отмечалось гипертермия до 37.7 380 С, лейкоцитоз от 10 до 15,8 109/л, СОЭ - 25-30 мм/ч. Гипертермия продолжалась в течение четырех суток после операции, постепенно нормализуясь к пятым суткам после операции, нормализовались и показатели белой крови. В послеоперационном периоде этим пациентам в зависимости от чувствительности выделенных микроорганизмов назначали различные антибактериальные препараты. Развития септических осложнений не отмечалось ни у одного пациента. Различия в частоте инфекционных осложнений в послеоперационном периоде не достигли статистически значимого уровня (p=0,464).
Таким образом, при обоих представленных способах введения препарата (болюсное и продленное внутривенное) создаются значения максимальной концентрации (C max), превышающие минимально подавляющую концентрацию для большинства возбудителей мочевой инфекции, включая «проблемные» микроорганизмы, такие как P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii. Более стабильные значения сывороточной концентрации ципрофлоксацина 1000 мг в группе пациентов, получавших внутривенную капельную инфузию препарата на протяжении всей операции, позволяют предположить, что эффективность данного способа может быть несколько выше, чем его болюсное введение.
Эффективность антибактериальной профилактики назначенной на основании результатов бактериологических исследований мочи и камня взятых во время операции
Всего у 117 (61,5%) пациентов отмечен рост возбудителей в камне и в моче, взятой из лоханки во время операции и у 73 (38,5%) пациентов роста уропатогенов ни в камне, ни в моче не выявлено.
Наиболее часто встречающиеся микроорганизмы, выявленными при бактериальном исследовании камня были: Proteus mirabilis – 14 случаев, Enterоcoccus faecalis – 13, Escherichia coli – 12. (Таблица № 12)
Таблица № 13 демонстрирует картину, выявленную при бактериальном исследовании мочи взятой из лоханки во время операции. Наиболее часто встречающиеся микроорганизмы, выявленные при бактериальном исследовании мочи из лоханки у исследуемых пациентов Escherichia coli – 15 случаев, Enterococcus faecalis – 15 случаев и Proteus mirabilis – 10 случаев.
Как видно из рисунка № 2, при бактериологическом исследовании камня взятой во время операции, бактерии в клинически значимых титрах 105 КОЕ\мл встречается чаще и выявлены в первой группе у 32 (55,1%) пациентов, во второй группе у 24 (40,6%) пациентов, составляя 56 (29,4%) пациента.
Следует отметить, что при бактериологическом исследовании камня микроорганизмы выявлялись чаще, чем при исследовании мочи из лоханки: 102 (53,6%) против 88 (46,4%). Виды микроорганизмов в камне и моче из лоханки в основном не различались.
Как иллюстрирует таблица №14, несоответствие результатов бактериологического исследования мочи из лоханки и камня отмечалось у 45 (23,7%) пациентов.
Анализируя таблицу №15, можно подтвердить мнение о необходимости бактериологического исследования мочи из лоханки и камня, т.к. анализ средней порции мочи до операции недостаточно информативен.
Отсутствие роста микрофлоры после выписки регистрировали в 1-ой группе – у 36 (62.0%) пациентов, во 2-ой группе у 45 (76.2%) пациентов и в 3-ей группе у 65 (89,0%) пациентов. Различия между 1 и 2 группами находились на уровне статистической тенденции (p=0,007), различия между 1 и 3 группами были статистически достоверны (p=0,01) и значимых различий между 2 и 3 группами не отмечалось (p=0,45). (p1а-2а=0,007, p1а-3а 0,001, p2а-3а=0,458)
Как видно из Таблицы № 16 и Рисунка № 3, микрофлора при бактериологическом исследовании мочи после выписки выявлена у 22 (37.9%) пациентов в первой группе, у 14 (23.7%) пациентов во второй группе и у 8 (10.9%) пациентов в третьей группе. Следует отметить, что при бактериологическом исследовании мочи после выписки в сроки 6-18 месяцев микроорганизмы выявлялись чаще у пациентов 1 группы, составляя ровно половину случаев встречаемости по сравнению со 2-й и 3-й группами.
Как видно из Таблицы №17, при бактериологическом исследовании мочи после выписки в сроки 6-18 месяцев, бактерии в клинически значимых титрах 105 КОЕ\мл встречается чаще и выявлены в первой группе у 13 (22.5%) пациентов, во второй группе у 10 (17%) пациентов и третьей группе у 6 (8.2%) пациентов.
Таблица № 18 демонстрирует микроорганизмы, отсутствующие в данных бактериального исследования мочи, взятой из лоханки во время операции, но обнаруженные при посеве мочи после выписки.
У трех пациентов отмечалось совпадение микрофлоры впервые появившейся в посеве мочи после выписки в сроки 6-18 месяцев с микрофлорой камня (Таблица №19). Следует отметить, что все три случая относились к 1 группе, т.е. у этих больных антибиотикопрофилактика назначалась с учетом исследования микрофлоры именно камня.
Развитие рецидивных камней за период наблюдения
За 6 – 18 месяцев после операции из 190 (100%) наблюдаемых пациентов возникли рецидивы камней у 43 (22,6%) пациентов.
Таким образом, наибольшая частота рецидивов отмечалась у больных 1 группы у 21 (36,2%) пациентов, во 2 группе частота рецидивов была у 10 (16,9%) пациентов, в 3 группе у 12 (16,4%) пациентов. Различия между 1 и 2 группами находились на уровне статистической тенденции (p=0,032), различия между 1 и 3 группами были статистически достоверны (p=0,01); между группами 2 и 3 значимых различий не выявлено (p=0,676). (Рисунок № 6)
Из них – «ложные» рецидивы (рост оставшихся фрагментов после операции) в 1 группе отмечены у 13 (22,4%) пациентов, во 2 группе у 6 (10,2%) пациентов и в 3 группе у 6 (8,2%) пациентов. Истинные рецидивы в 1 группе возникли у 8 (13,8%) пациентов, во 2 группе у 4 (6,8%) пациентов и в 3 группе у 6 (8,2%) пациентов. (Рисунок № 7)
При «ложных» рецидивах оценивали рост камней по данным ультразвукового исследования в течение наблюдаемого периода. Наиболее выраженный рост «ложных» рецидивов камней почек наблюдали у 13 (22,4%) пациентов 1-й группы пациентов на 5,5 [5,1; 6,3] мм, во 2-й группе у 6 (10,2%) пациентов отмечался рост конкрементов на 2,9 [2,6; 3,8] мм и в 3-й группы у 6 (8,2%) пациентов на 4,1 [3,0; 4,6] мм. Различия между 1-й и 2-й группами по данному показателю достигли статистически значимого уровня (p=0,007); между 1-й и 3-й группами находились на уровне статистической тенденции (p=0,041).
В послеоперационном периоде после перкутанной нефролитотрипсии в сроки от 6-18 месяцев у 43 пациентов наблюдали рецидивы камней, как истинных, так и «ложных». Встречаемость камней «инфекционного генеза» (струвит; карбонатапатит; струвит+карбонатапатит) наблюдалась у 23 (53,4%) пациентов от общего числа рецидивных камней – 43 (100%) или у 12,1% от общего числа пациентов (n=190), подвергшихся перкутанной нефролитотрипсии. В то время как, камни почек, изъятые во время операции у 82 пациентов (43,1%) из 190 (100%) пациентов были камни инфекционного генеза.
Таблица № 28 представляет значимые предикторы возникновения рецидивов. Статистически достоверные отношения шансов для выявленных предикторов представлены в Таблице №29.
Как показывают таблицы №28-29, наличие в моче микрофлоры в послеоперационном периоде является немаловажным, вторым по значимости, предрасполагающим фактором для повышения вероятности возникновения рецидивных камней.
Так общее количество рецидивов при бактериурии в послеоперационном периоде достоверно выше, по сравнению с таковыми в случае отсутствия бактериурии (21 (47,5%) и 22 (15,1%)), соответственно, p 0,001. ОШ=5,06 [2,36; 10,88]. (Рисунок № 8)
Таким образом, отсутствие микрофлоры служит значимым благоприятным фактором, позволяющим избежать рецидива инфекционных камней после перкутанной нефролитотрипсии. Наличие микрофлоры было статистически значимым фактором риска рецидива камней после перкутанной нефролитотрипсии.
Так же доказано, что бактериурия в послеоперационном периоде является фактором, способствующим развитию истинных, так и росту «ложных» конкрементов.
Таким образом, выявлено преимущество режима послеоперационной антибактериальной терапии и профилактики, основанного на результатах бактериологического исследования мочи взятой из лоханки при проведении ПНЛТ для уменьшения рецидива инфекционных камней почек. На основании анализа полученных данных можно отметить, что у больных с инфицированными камнями почек или бактериурией во время операции шанс возникновения резидуальных камней заметно возрастает ОШ=2,78 [1,14; 6,76].