Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные возможности иммуномодулирующей терапии хронического бактериального цистита у женщин 14
1.1. Актуальные вопросы этиологии и патогенеза хронического бактериального цистита 14
1.2. Методы оценки иммунной системы организма
1.2.1. Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов 28
1.2.2. Методы определения эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов) 31
1.3. Роль иммунотерапевтических препаратов в лечении хронического
бактериального цистита 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .47
2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 47
2.2. Методы обследования больных
2.2.1. Методы общеклинического и урологического обследования 56
2.2.2. Специальные методы обследования
2.3. Характеристика методов лечения .62
2.4. Статистическая обработка данных .64
ГЛАВА 3. Состояние врожденного и адаптивного иммунитета у женщин с хроническим бактериальным циститом .65
Глава 4. Влияние препарата бактериального лизата штаммов кишечной палочки на показатели иммунного статуса больных хроническим бактериальным циститом .77
4.1. Влияние препарата бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки на параметры адаптивного клеточного и гуморального иммунитета .77
4.2. Влияние препарата бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки на показатели врожденного системного и местного (мукозального) иммунитета у больных хроническим бактериальным циститом 88
ГЛАВА 5. Сравнительная оценка иммунотерапии препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки и стандартной антибактериальной терапии на параметры иммунного статуса и эффективность лечения женщин, страдающих хроническим бактериальным циститом 98
5.1. Сравнительная оценка влияния иммунотерапии препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки и стандартной антибактериальной терапии на показатели состояния иммунитета больных хроническим рецидивирующим циститом 98
5.2. Оценка клинической эффективности иммунотерапии препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки в сравнении со стандартной антибактериальной терапией женщин с хроническим рецидивирующим циститом 117
ГЛАВА 6. Заключение 129
Выводы .143
Практические рекомендации .145
Литература
- Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов
- Методы общеклинического и урологического обследования
- Влияние препарата бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки на показатели врожденного системного и местного (мукозального) иммунитета у больных хроническим бактериальным циститом
- Оценка клинической эффективности иммунотерапии препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки в сравнении со стандартной антибактериальной терапией женщин с хроническим рецидивирующим циститом
Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов
При происшедшей адгезии нормальный ток мочи не смывает бактерии, в результате чего происходит колонизация микроорганизмов на слизистой оболочке мочевого пузыря [97]. Условиями персистенции являются определенные биологические свойства микроорганизма и дефектность иммунной защиты хозяина, что обусловливает бактерионосительство (персистенция возбудителей, асимптоматическая бактериурия) и хронизацию воспалительного процесса (частые рецидивы заболевания). Снижая вирулентность или изолируясь в очагах локального иммунодефицита, бактерии могут уклоняться от действия факторов защиты человека. Подавление же факторов защиты хозяина идет за счет повышения вирулентных свойств бактерий или в результате диссеминации в иммунокомпрометированном организме [70, 89]. Уропатогенные штаммы E. coli имеют факторы вирулентности, с помощью которых они способны преодолевать защитные механизмы слизистой мочевого пузыря у женщин, что зависит от состояния врожденного иммунного ответа слизистых оболочек [118, 115, 136]. Высокая приспосабливаемость микроорганизмов к постоянно меняющимся условиям существования особенно проявляется при антибиотикотерапии – обесцениваются целые классы антибиотиков за счет селекции резистентных штаммов микроорганизмов [71].
В настоящее время в литературе активно обсуждается концепция внутриклеточных бактериальных сообществ. Многие виды бактерий способны паразитировать внутриклеточно, проявляя тропность к различным клеткам хозяина – факультативный паразитизм. E. coli, проникая в эпителиальную клетку мочевого пузыря, может формировать в цитоплазме внутриклеточные бактериальные сообщества (ВБС) [71, 133].
Наличие фимбрий и ферментативная активность микроорганизмов обеспечивают им проникновение в клетку или межклеточное пространство. Растущие колонии бактерий, окруженные матриксом биопленки, формируют в стенке мочевого пузыря скопления в виде «коконов», выпячивающихся в его просвет. Время от времени «коконы» разрываются и бактерии, попадая в мочу, вызывают повторные эпизоды инфекции мочевыводящих путей [72, 127, 171].
Во внутриклеточных бактериальных сообществах резистентность к антибиотикам может быть обусловлена как ограниченным проникновением антимикробных веществ в ВБС, так и низкой метаболической активностью бактерий. [141, 144].
Существует мнение, что у кишечной палочки в процессе формирования ВБС важную роль играют гликозаминогликаны, а именно – полимер poly-beta-(1-6)-Nacetylglucosamine (PNAG/PGA). Глюкозаминогликаны представляют собой длинные неразветвленные цепи гетерополисахаридов, состоящие из гиалуроновой кислоты и сульфатной группы. Глюкозаминогликаны входят в состав межклеточного матрикса, выполняя роль барьера. Традиционно считалось, что капсула бактерий является своего рода защитным фактором, которая препятствует опсонофагоцитозу и комплемент-опосредованному захвату. Исследования показали, что кислотосодержащие капсулы выступают как защитная губка, которая изолирует и нейтрализует антимикробные пептиды (АМП). Слизистые оболочки являются естественной первой линией противомикробной защиты от факторов внешней среды. Быстрое развитие иммунных реакций обеспечивается врожденным иммунным ответом, который распознает патогены при помощи специальных рецепторов [44, 179, 107, 177]. Эти рецепторы распознают молекулярные структуры, общие для целых групп инфекционных возбудителей. Первыми открытыми рецепторами врожденного иммунитета были, так называемые, Toll подобные рецепторы (TLR), позднее были идентифицированы другие семейства рецепторов – NOD-like и RIG-like, каждые из которых выполняют свою роль и распознают «предназначенные им» патогенные структуры. Рецепторы врожденного иммунитета расположены на поверхности слизистых и основных клеток врожденной иммунной системы – фагоцитов (нейтрофилов, моноцитов и макрофагов, дендритных клеток и др.). Последние играют роль посредников между врожденным и адаптивным иммунитетом [53, 104, 106, 164].
Описание указанных рецепторов послужило основанием для формирования концепции «новой иммунологии» — иммунологии образ-распознающих рецепторов. Согласно этой концепции, рецепторам придается системообразующая роль в регуляции как специфических, так и неспецифических механизмов системы иммунобиологического надзора (СИБН) [69, 168].
Методы общеклинического и урологического обследования
На первом этапе исследования всем пациенткам было проведено общеклиническое и урологическое обследование. Выполнялись следующие общепринятые клинические методы исследования, такие как: 1. сбор жалоб, анамнеза заболевания и анамнеза жизни больных рецидивирующим бактериальным циститом; 2. субъективная оценка клинического состояния пациентки; 3. объективный осмотр, физикальное обследование; 4. общеклиническое обследование (общий анализ крови и общий анализ мочи); 5. культуральное исследование мочи на флору и чувствительность к антибиотикам; 6. консультация гинекологом и микроскопическое исследование мазка из уретры и цервикального канала; 7. ПЦР диагностика на инфекции, передаваемые половым путем; 8. УЗИ мочевого пузыря и почек (по показаниям); 9. урофлоуметрия (по показаниям). Для клинического и бактериологического анализов мочи пациентки сдавали среднюю порцию утренней мочи, после тщательного туалета наружных половых органов и рук. Определяли микробиологическую обсемененность мочи и чувствительность к антибактериальным препаратам выделенных уропатогенов. Этиологически значимым считали микробное число 103 КОЕ/мл.
Кроме того, всем пациенткам выполняли влагалищное исследование, в ходе которого оценивали состояние слизистой оболочки уретры и влагалища, определение топографии наружного отверстия уретры, оценивалось наличие или отсутствие пролапса стенок влагалища при натуживании. Проводилась пальпаторная оценка состояния мочеиспускательного канала, шейки мочевого пузыря и парауретральных тканей. Ультразвуковое исследование мочевого пузыря и почек проводилось трансабдоминальным способом с наполненным мочевым пузырем с использованием абдоминального датчика 3 МГц. В ходе исследования в первую очередь проводилась оценка формы мочевого пузыря, толщина стенки, а также содержимого мочевого пузыря и количество остаточной мочи. При УЗИ почек исключались аномалии развития, новообразования почек и мочекаменная болезнь.
Для исключения нарушений мочеиспускания проводили урофлоуметрию, позволяющую оценить процесс опорожнения мочевого пузыря, наличие или отсутствие препятствий к оттоку мочи в области шейки и в уретре. Всем пациенткам урофлоуметрия выполнялась при наличие естественного позыва к мочеиспусканию в спокойной обстановке без присутствия медперсонала. Объективным считалось мочеиспускание объемом не менее 150 мл и не более 400 мл. Оценивались следующие показатели: максимальная объемная скорость потока, время мочеиспускания, выделенный объем мочи, средняя скорость потока, характер кривой урофлоуметрии.
Оценка показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа в сыворотке крови и в слизистых мочевых путей на 0 день, 30 день лечения, 3 мес. лечения и через 3 мес. наблюдения после окончания лечения (на каждом визите 1, 2, 3, 4). Выполнялись следующие специальные методы исследования: 1. забор биоматериала (соскоб) из уретры для оценки параметров врожденного иммунитета слизистых оболочек до начала лечения, во время и спустя 3 месяца после окончания лечения; 2. забор крови для определения изменения динамики плазмацитоидных и миелоидных дендритных клеток, дефенсинов и иммуноглобулинов периферической крови больных с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей до начала и в ходе терапии.
Исследования показателей врожденного иммунитета в слизистых оболочках уретры, определение клеточного профиля периферической крови и гуморального профиля иммунной системы больных с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей в ходе иммунотерапии проводились на базе ГУ НИИ Вакцин и Сывороток им. И.И. Мечникова.
Забор материала для исследования показателей врожденного иммунитета в крови, слизистых оболочках уретры и мочевого пузыря. Забирали материал слизистой уретры для определения показателей врожденного иммунитета. Забор биоматериала осуществлялся строго в середине менструального цикла в группе пациенток репродуктивного возраста. У пациенток постменопаузального периода забор материала осуществлялся в день визита. Перед взятием материала наружное отверстие уретры обрабатывалось тампоном, смоченным физиологическим раствором. В уретру зонд вводился на глубину 1.5-2.0 см и совершалось несколько вращательных движений. После чего зонд погружался в пробирку типа «Эппендорф» с находящимся в ней буфером для консервации образцов «RNAlater» (Sigma-Aldrich, Cat# R0901). Пробирка с полученным материалом слизистой помещалась в холодильник и хранилась при температуре от +4 до +2С в течение 2-4 часов, после чего перемещалась в морозильную камеру для глубокой заморозки и хранения при температуре –80С. Исследование включало определение уровня экспрессии мРНК гена HBD-1-3 (human beta-Defensin-1,2,3) на слизистой оболочке уретры посредством количественной ПЦР. Также был исследован уровень экспрессии мРНК генов Tоll-подобных рецепторов (TLR s- 2,4,3,7,8,9) в клетках слизистой уретры. Помимо исследования уровня экспрессии транскриптов выше описанных генов, параллельно нами были исследованы показатели состояния врожденного и адаптивного иммунитета в крови и мононуклерных клетках периферической крови (PBMC s) у описанных групп пациентов. Забор крови осуществляли строго натощак из локтевой вены обследуемых в стерильных условиях. Фракцию мононуклеарных клеток белой крови предварительно выделяли на градиенте Фикола (плотностью 1,077 г/см3, ЗАО «ПанЭко», кат.№ 17-1440-03) с последующей отмывкой в среде RPMI-1640 (ЗАО «ПанЭко», кат.№ С330п). Для долговременного хранения осажденную клеточную фракцию подвергали последующей заморозке при -80С.
Влияние препарата бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки на показатели врожденного системного и местного (мукозального) иммунитета у больных хроническим бактериальным циститом
Таким образом, иммунотерапия бактериальным лизатом штаммов кишечной палочки не только способствовала нормализации количества TLR-позитивных клеток, но и нормализовала экспрессию генов, кодирующих их синтез. Правда, этот эффект после прекращения терапии постепенно проходил.
Другим важным компонентом системы распознавания чужеродных антигенов являются дендритные клетки циркулирующей крови. Их количество у больных циститом также оказалось достоверно сниженным. Иммунотерапия бактериальным лизатом штаммов кишечной палочки способствовала нормализации этого показателя как в процентном отношении к общему количеству лейкоцитов, так и в абсолютных значениях (Таблица 17). Примечание: М± - средняя арифметическая±стандартное отклонение; Me -медиана значений, LQ-UQ - нижний и верхний квартили.
Таким образом, препарат на основе лизата 18 штаммов кишечной палочки способствовал улучшению системы распознавания чужеродных микробных антигенов в течение периода лечения, но этот эффект оказался не стойким.
Следующим звеном в реализации иммунного ответа является система цитокинов, продукция которых резко усиливается после активации рецепторов иммунокомпетентных клеток.
Исследования показали, что среди Th1 цитокинов уровень TNF- и IL-1 у больных в острый период был резко повышен. Под влиянием иммунотерапии лизатом 18 штаммов кишечной палочки отмечалась тенденция к их снижению, но изменения до уровня нормы не происходило (за исключением IL-1 через 1 мес. после применения лизата 18 штаммов кишечной палочки). Противоположная картина отмечалась в отношении других Th1 цитокинов: IL-2, IFN-, IL-12p70. Изначально их уровни были существенно ниже границ нормы. Препарат приводил к нормализации уровней IL-2, IFN- и IL-12 на протяжении всего периода, за исключением IFN-, когда показатели снова начинали снижаться ниже контрольных значений уже через 4 месяца после лечения (Таблица 18).
Уровень Th1 цитокинов в сыворотках больных с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей до и после лечения препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки.
В отношении Th2 цитокинов - IL-4, IL-6 и IL-10 достоверного снижения их изначально повышенных уровней не происходило, при этом концентрации IL-5 статистически значимо снижались, но не достигали уровня контрольных значений здоровых лиц. Значимое снижение повышенных концентраций наблюдалось только в отношении IL-13 (Таблица 19). То есть, в случае Th2 цитокинов наблюдалась малозначимая корреляция иммунного ответа.
Уровень Th2 цитокинов в сыворотках больных с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей до и после лечения препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки.
В отношении цитокинов Th9/17/22 при терапии бактериальным лизатом 18 штаммов кишечной палочки происходила постепенная нормализация показателей, причем эта тенденция сохранялась даже после прекращения приема препарата (до 6 месяцев) (Таблица 20).
Уровень Th9/17/22 цитокинов в сыворотках больных с рецидивирующей инфекцией нижних мочевых путей до и после лечения препаратом бактериального лизата 18
Результаты исследования цитокинового профиля свидетельствуют, что бактериальный лизат 18 штаммов кишечной палочки способствует приближению к нормальным значениям Th1-цитокинов, участвующих в реализации клеточных иммунных реакций и не оказывает существенного влияния на профиль Th2-цитокинов, опосредующих реакции гуморального иммунитета. Нормализация профиля Th9/17/22-цитокинов свидетельствует об уменьшении под влиянием «Уро-Ваксома» аутоиммунного и аллергического компонентов иммунного ответа, что может положительно сказаться на эффективности иммунной защиты организма от мочевой инфекции.
Определение профиля иммуноглобулинов на фоне терапии бактериальным лизатом не выявило его достоверного влияния на уровни IgA и IgM в сыворотке крови больных в течение всего срока исследования, как на фоне приема препарата, так и в течение 3 месяцев после его прекращения (Рисунок 2 и 3 ). Если до начала лечения уровни IgA и IgM составили 708±48,5 мкг/мл и 462,9±27,9 мкг/мл соответственно, то через 6 месяцев их уровень был 727±37,51 мкг/мл и 473,8±40,7 мкг/мл. соответственно, что оставалось достоверно выше нормальных значений (423±38,8 мкг/мл и 466,5±50,3 мкг/мл соответственно).
Оценка клинической эффективности иммунотерапии препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки в сравнении со стандартной антибактериальной терапией женщин с хроническим рецидивирующим циститом
При оценке антибиотикограммы через 1 месяц лечения в группе терапии бактериальным лизатом чувствительность возбудителя, а именно E.Coli и Klebsiella pn., к антибиотикам в сравнении с исходными данными не изменилась.
Таким образом через 1 месяц иммунотерапии бактериальным лизатом 18 штаммов кишечной палочки положительный бактериологический результат достигнут в 96,7% случаев.
В группе больных, получавших стандартную антибактериальную терапию, из 25 пациенток, у которых до начала лечения в моче высевалась E.coli, эрадикация возбудителя достигнута в 20 случаях (80%). У 3 пациенток (12%) при повторном бактериологическом исследовании снизилось микробное число незначительно – с 106до 105 КОЕ/мл, а у 2 больных (8%) даже повысился на 2 lg– с 104 и 105 КОЕ/мл до 106 и 107 КОЕ/мл. У 1 больной, у которой до начала терапии в моче высевался Proteus mirabilis в титре 106 КОЕ/мл, при повторном исследовании титр возбудителя снизился лишь незначительно – до 105 КОЕ/мл. Похожая картина выявлена у пациентки, у которой до лечения в моче высевался Enterococcus faecalis – титр возбудителя в моче снизился с 106 до 105 КОЕ/мл. У остальных 2 больных, у которых в моче обнаруживали Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus spp. при повторном бактериологическом исследовании роста микрофлоры не обнаружили.
В этой группе антибиотикограмма выделенных возбудителей осталась такой же, как и до начала терапии, несмотря на то, что отмечено снижение титра возбудителя на 2-3 логарифма. Учитывая, что пациентки этой группы получали антибиотики, обладающие бактерицидным действием (фосфомицина трометамол, фторхинолоны), цель которых – добиться полной эрадикации возбудителей из мочевых путей, выявление роста микроорганизмов в моче при повторном микробиологическом исследовании следует рассматривать как неудачу проведенной антибактериальной терапии. Исходя из этого, эффективность традиционной антибактериальной терапии оказалась равной 73,3%.
После завершения курса иммунотерапии бактериальным лизатом (3 месяца) при обследовании у 5 женщин этой группе в моче высеяли кишечную палочку в титре 103- 105 КОЕ/мл, однако, по сравнению со значениями титра до начала лечения эти показатели были все же ниже на 1-3 логарифма. При этом у всех 5 этих женщин E.coli выделяли в моче и через 1 месяц после начала терапии. При этом у 3 женщин он остался на прежнем уровне (у 2 – 103 и у 1 – 105 КОЕ/мл), а у 2 он повысился с 103 КОЕ/мл до 104 и 105 КОЕ/мл. У остальных женщин, у которых ранее в моче выделяли E.coli, после 3-месячной терапии моча оказалась стерильной.
У всех 3 пациенток, у которых до начала лечения в моче высевалась Klebsiella pneumonia, этот возбудитель высеян и через 3 месяца в титре 103, 105 и106 КОЕ/мл. То есть, у 1 больной титр возбудителя остался на том же уроне, что и через 1 месяц после начала лечения, а у 2 – повысился на 2 и 3 логарифма.
Таким образом, если в отношении E.coli иммунотерапия препаратом бактериального лизата 18 штаммов кишечной палочки показала достаточно высокую эффективность – эрадикация возбудителя достигнута в 76,1%, а еще у 14,3% микробное число стойко снизилось, то в отношении Klebsiella pneumonia результаты оказались существенно хуже – у всех 3 пациенток возбудитель продолжал высеваться из мочи, причем только в 1 случае – в постоянном титре, а у 2 других женщин микробное число в моче возрастало. Общая эффективность иммунотерапии в этой группе составила 73,3%.
Анализ чувствительности и резистентность к антибиотикам при выявлении бактериурии в эти сроки и после окончания терапии оценивали по следующим антибактериальным препаратам: нитрофурантоин, цефалексин, ко-тримоксазол, ципрофлоксацин, фосфомицина триметамол, амикацин, фуразидин\ фуразидин калия. При оценке спектра чувствительности и резистентности к антибиотикам в данной группе изменений не получено в сравнении с исходными данными.
В группе пациенток, получавших стандартную антибактериальную терапию, через 3 месяца у 4 пациенток в ранее стерильной моче вновь стала высеваться E.coli в титре 104-106 КОЕ/мл. Еще у 4 больных титр возбудителя незначительно снизился по сравнению со значениями, полученными через 1 месяц лечения – с 105-106 КОЕ/мл до 104-105 КОЕ/мл. У 2 больных, у которых ранее высевался протей и стафилококк, эти возбудители продолжали высеваться из мочи примерно в том же титре.
Таким образом, у 10 из 30 больных этой группы после 3-месячной антибактериальной терапии в моче продолжали высеваться бактериальные возбудители, преимущественно кишечная палочка. Чувствительность и резистентность выделенных возбудителей при этом не менялась по сравнению с исходными характеристиками. Соответственно эффективность антибактериальной терапии к этому сроку в данной группе составила 66,7%.