Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор 12
1.1 Химия и физика поверхности твердого тела. Остовная модель 12
1.2 Биоматериалы для медицинских имплантов. Характеристики поверхности 15
1.2.1 Общая характеристика биоматериалов. 15
1.2.2 Роль поверхности биоматериалов. 16
1.3 Титан как материал для медицинских имплантов 19
1.3.1 Механические свойства крупнозернистого, ультрамелкозернистого титана и сплавов на его основе 20
1.3.2 Особенности структуры и состава поверхности титана 25
1.4 Влияние рельефа поверхности на биомедицинские свойства титана 28
1.4.1 Микрорельеф 29
1.4.2 Нанорельеф 30
1.4.3 Гибридный и иерархический микро/нанорельеф. Синергетический эффект и биомиметика 33
1.5 Методы модификации поверхности биоматериалов. 35
1.5.1 Методы, направленные на модификацию рельефа и состава поверхности 35
1.5.2 Методы нанесения покрытий для улучшения биомедицинских свойств 43
1.6 Метод молекулярного наслаивания 46
1.6.1 Синтез нанопокрытий диоксида титана методом МН-ALD 50
1.7 Процесс остеоинтеграции 53
1.8 Методы исследования биомедицинских свойств имплантов in vitro и in vivo 55
1.9 Заключение по литературному обзору 57
Глава 2 Экспериментальная часть 59
2.1 Основные вещества, использованные в работе и их назначение. 59
2.2 Подготовка поверхности и химическое травление титана в сернокислом и аммиачном растворах пиранья. 60
2.3 Синтез покрытий на поверхности титана методом МН-ALD 61
2.4 Рентгенофазовый анализ. 63
2.5 Сканирующая электронная микроскопия. 65
2.6 Весовой анализ образцов (ТГА). 67
2.7 Метод эллипсометрии. 67
2.8 Атомно-силовая микроскопия. 69
2.9 Рентгенофлуоресцентный анализ 70
2.10 Метод лежащей капли. 72
2.11 Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия. 74
2.12 Времяпролетная вторично ионная масс-спектрометрия .76
2.13 Исследование биоактивности образцов in vitro. 77
2.13.1 Анализ адгезии клеток остеобластов МС3Т3-Е1 78
2.13.2 Определение жизнеспособности клеток остеобластов. 79
2.13.3 Определение пролиферации клеток остеобластов. 80
2.13.4 Определение дифференцировки клеток остеобластов. 80
2.14 Исследование биоактивности образцов in vivo. 82
Глава 3 Обсуждение результатов 85
3.1 Исследование скорости травления КЗ и УМЗ титана в основном и кислотных растворах пиранья 85
3.2 Исследование рельефа и морфологии поверхности КЗ и УМЗ титана после травления в кислотном и основном растворах пиранья 86
3.2.1 Сканирующая электронная микроскопия 86
3.2.2 Атомно-силовая микроскопия 91
3.2.3 Сравнительный анализ морфологии и рельефа поверхности травленного УМЗ и КЗ титана 95
3.3 Исследование состава поверхности КЗ и УМЗ титана после травления в кислотном и основных растворах пиранья. 97
3.3.1 Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия и рентгеновский флуоресцентный анализ 97
3.3.2 Времяпролетная вторично ионная масс-спектрометрия. 99
3.4 Общая характеристика травления КЗ и УМЗ титана 102
3.5 Оптимизация процесса травления УМЗ титана 103
3.6 Нанесение покрытий методом МН-ALD 107
3.6.1 Разработка методики нанесения пленок на подложках с развитой поверхностью. 107
3.6.2 Синтез нанопокрытий диоксида титана на поверхности травленного УМЗ титана. 110
3.7 Рельеф и морфология поверхности образцов с нанесенным покрытием 111
3.7.1 Сканирующая электронная микроскопия 112
3.7.2 Атомно-силовая микроскопия 114
3.8 Исследование состава и кристаллической структуры поверхности образцов с нанесенным покрытием 115
3.8.1 Анализ состава поверхности образцов 115
3.8.2 Анализ кристаллической структуры поверхности образцов 119
3.9 Анализ смачиваемости поверхности 120
3.10 In vitro испытания образцов модифицированного УМЗ титана 122
3.10.1 Оценка адгезии клеток остеобластов МС3Т3-Е1 122
3.10.2 Оценка жизнеспособности и пролиферации клеток остеобластов МС3Т3-Е1 124
3.10.3 Оценка дифференцировки клеток остеобластов МС3Т3-Е1 125
3.11. In vivo испытания образцов модифицированного УМЗ титана 127
3.11.1 Клинические наблюдения 128
3.11.2 Рентгенологические испытания 128
3.11.3 Анализ приживляемости имплантов. 129
3.11.4 Анализ поверхности образцов после извлечения 130
3.12 Взаимосвязь между морфологией, рельефом, составом и цитологическим откликом 131
3.13 Сравнение полученных результатов с литературными данными . 134
Заключение 138
Список сокращений и условных обозначений .139
Благодарности 140
Список литературы 141
Приложение 156
- Механические свойства крупнозернистого, ультрамелкозернистого титана и сплавов на его основе
- Метод молекулярного наслаивания
- Анализ состава поверхности образцов
- Сравнение полученных результатов с литературными данными
Механические свойства крупнозернистого, ультрамелкозернистого титана и сплавов на его основе
Несмотря на целый ряд преимуществ, имплантаты на основе титана не идеальны, так как обладают недостаточно высоким сроком службы из-за низкой усталостной прочности и большим значением модуля Юнга в сравнении с костной тканью (таблица 1.2). Низкая усталостная прочность приводит к разрушению имплантата после 10-15 лет использования и необходимости повторного хирургического вмешательства. Величина модуля Юнга также является важным фактором успеха, так как если материал обладает модулем превышающем модуль костной ткани (15-55 ГПа), то возникает эффект «экранирования напряжения» [2] и, в конечном итоге, происходит резорбция кости вокруг имплантата, его ослаблению и отторжению [5].
Для улучшения механических свойств титана обычно используют два подхода: изменение состава (сплавы) и структуры (наноструктурирование). К настоящему моменту, основываясь на этих подходах, было разработано несколько классов материалов для медицинских имплантатов, основные из которых вместе с преимуществами и недостатками перечислены в таблице 1.2.
Сплавы титана разделяются на две группы в соответствии с типом допантов: -сплавы содержат обычно Al, Sn, N и стабилизируют плотноупакованную гексагональную кристаллическая структуру титана (-форма), в то время как -сплавы содержат V, Mo, Cr, Nb, Fe, которые стабилизируют объемноцентрированную кубическую структуру титана (-форма).
Механические свойства сплавов значительно различаются. Сплавы, содержащие большую долю -формы титана, отличаются высокой прочностью и пластичностью, однако они более хрупкие, обладают большим значением модуля Юнга и меньшей усталостной прочностью по сравнению с -сплавами [2].
Сплав Ti-6Al-4V (Ti64), содержащий 6% алюминия, 4% ванадия и относящийся к + типу сплавов, является наиболее изученным и широко используемым [2]. Ti64 обладает достаточно высокой статической и усталостной прочностью, однако недостаточная эластичность, значительное истирание материала в процессе длительной эксплуатации [32], а также опасность растворения токсичных элементов ванадия и алюминия [33] значительно снижают возможности его применения.
В последние годы значительно возрос интерес к -сплавам, которые обладают малой величиной модуля Юнга, трещиноустойчивостью и низким коэффициентом трения. В конце XX века было рассчитано [34], что наиболее подходящими -стабилизирующими элементами, снижающими модуль Юнга и практически не ухудшающими прочность, являются Nb, Zr, Mo, Ta. Затем было экспериментально доказано [35], что данные элементы вплоть до определенных концентраций действительно уменьшают величину модуля Юнга (рисунок 1.3) и обладают удовлетворительной прочностью на разрыв (рисунок 1.4).
Среди сплавов для медицины особое значение имеет сплав никеля и титана (нитинол), являющийся чрезвычайно перспективным благодаря эффекту памяти формы, сверхпластичности, отличной биосовместимости, и хорошими амортизационными свойствами [36]. In vitro и in vivo испытания NiTi имплантатов, вживленных в мягкие ткани, продемонстрировали превосходную биосовместимость [37,38]. Тем не менее, даже незначительное количество никеля, при попадании в организм может вызывать аллергическую реакцию, а в больших концентрациях приводит к серьезному раздражению и воспалению окружающих тканей и в конечном счете к некрозу.
Перспективной альтернативой титановых сплавов является наноструктурированный или ультрамелкозернистый (УМЗ) титан. Размер зерен в «обычном» крупнозернистом (КЗ) титане равен единицам и десяткам микрон, в то время как для УМЗ титана эта величина достигает десятков или сотен нанометров. Зерна такого размера обладают большим соотношением доли поверхностных атомов к объемным и, соответственно, большим значением поверхностной энергии [39]. В связи с этим, свойства наноструктурированного титана сильно отличаются от КЗ аналогов. УМЗ титан обладает повышенной прочностью, пластичностью и меньшим значением модуля Юнга [5,6]. Такой титан получают методами интенсивной пластической деформации (ИПД) [40]. Данные методы позволяют создавать наноструктуру непосредственно в объеме металлических материалов и основаны на проведении деформации в условиях интенсивного механического воздействия при относительно низких температурах (не более 300-400С). В этих условиях может происходить существенное измельчение структуры материала (зерен металлов), то есть развиваться процессы фрагментации вплоть 100 нм и менее [6]. Формирование структуры в ходе ИПД определяется сочетанием множества параметров, таких как: исходная структура, условия деформации и особенность напряженно-деформированного состояния [41]. Наиболее эффективными условиями деформации являются те, при которых обеспечивается однородность напряженно - деформированного состояния по всему объему материала.
К числу методов ИПД относят такие как: кручение под квазигидростатическим давлением [42], равноканальное угловое прессование (РКУП) [43], всесторонняя изотермическая ковка [44], экструзия [45].
Кручение под квазигидростатическим давлением (рисунок 1.5) основано на методике, разработанной Кузнецовым в 80-х годах XX века [46]. Деформацию проводят на наковальнях Бриджмена при давлении 5-10 ГПа с использованием заготовок-образцов в форме дисков (толщиной 0,2-0,5 и диаметром от 5 до 15 мм). Наноструктурирование достигается после деформации образца в несколько оборотов. Конечный размер зерен изменяется в пределах 50-200 нм. Величина определяется условиями деформации - скоростью деформации, давлением, температурой и видом обрабатываемого материала. Образцы, полученные данным методом, имеют неоднородность структуры, вызванную неравномерностью деформации по радиусу заготовки. Также к недостаткам этого метода можно отнести малые размеры получаемых объектов.
Схема деформации методом РКУ прессования [47] РКУП позволяет формировать наноструктуру со средним размером зерен от 100 до 500 нм. К недостаткам метода можно отнести необходимость изготовления дополнительной оснастки и наличие концевых участков с дефектной структурой, которые в конечном итоге удаляются, что ведет к потере материала.
Метод РКУП в настоящий момент активно используется для получения УМЗ алюминия, магния, титана, а также их сплавов. В последние годы было показано, что наноструктурированные металлы имеют широкие перспективы для их использования в медицине вследствие их уникальных механических свойств [3-6], а также положительного влияния наноструктурирования на цитологический отклик и бактерицидные свойства [48].
Метод молекулярного наслаивания
Метод молекулярного наслаивания был разработаны в 60-х годах XX века В.Б. Алесковским и С.И. Кольцовым [94], а технология запатентована в 1974 году финским ученым Т. Сунталой под названием атомно-слоевая эпитаксия (atomic layer epitaxy - ALE) [95]. В современной англоязычной литературе метод известен как атомно-слоевое осаждение (atomic layer deposition - ALD). В дальнейшем тексте для обозначения данного метода используется термин МН-ALD.
Основы метода базируются на «остовной» гипотезе Алесковского, описанной в разделе 1.1. Метод МН позволяет синтезировать нанопленки и нанопокрытия по принципу химической сборки путем проведения поверхностных химических реакций с функциональными группами подложки. Реализация метода МН-ALD технологически похожа на метод CVD. Подвод реагентов к поверхности подложки производится из газовой фазы, однако метод МН-ALD включает как минимум две химические реакции, происходящие последовательно и циклически. Каждый цикл МН-ALD должен заканчиваться химической реакцией, восстанавливающей функциональные группы, находившиеся на поверхности подложки перед началом цикла. Химические реакции должны быть необратимыми в условиях проведения процесса и каждая из них протекать только после полного завершения предыдущей и удаления летучих продуктов реакции и исходных реагентов. В результате одного цикла не может вырасти более одного мономолекулярного слоя нового соединения, однако повторяя циклы МН-ALD необходимое количество раз можно выращивать пленки толщиной от единиц до десятков и сотен нанометров по принципу «слой-за-слоем».
Рассмотрим в качестве примера процесса МН-ALD получение тонких пленок TiO2 на поверхности кремния с использованием хлорида титана (IV) и воды в качестве реагентов (Рисунок 1.21). На первом этапе синтеза, подложка, содержащая гидроксильные группы на поверхности, обрабатывается парами хлорида титана - стадия 1. Гидроксильные группы замещаются на оксотитанхлоридные. Поверхность насыщается и реакция завершается - стадия 2. Продукты реакции и избыток реагентов удаляются из реактора путем продувки инертным газом - стадия 3. Затем в реактор напускаются пары второго реагента – воды. Хлоридные группы замещаются на гидроксильные - стадия 4. Реакция продолжается до полного восстановления гидроксильных групп на поверхности. Избыток реагентов и продуктов реакции удаляется из реактора - стадия 5. Операции 1-5 составляют один цикл МН-ALD. - напуск элементсодержащего реагента; 2 - насыщение поверхности; 3 удаление избытка реагента и продуктов реакции; 4 - напуск второго реагента; 5 насыщение поверхности и удаление избытка реагента и продуктов реакции; 6 повторение процедуры 1 Рисунок 1.21 - Схема синтеза TiO2 методом МН-ALD
В результате на поверхности подложки в идеальных условиях вырастает один мономолекулярный слой оксида титана и при этом восстанавливаются исходные гидроксильные группы, что дает возможность циклически повторять операции 1-5 и наращивать оксидное покрытие. Протекающие химические реакции можно представить следующим образом: x(SiOH) + TiCl4 (Si-O-)xTiCl4-x + xHCl, (1.13) (Si-O-)xTiCl4-x + (4-x)H2O (Si-O-)xTi(OH)4-x + (4-x)HCl, (1.14) где - подложка («остов»), а красным цветом обозначены поверхностные функциональные группы. Следует отметить, что представленное описание процесса МН-ALD является идеализированным. Практически за один цикл МН-ALD вырастает менее одного молекулярного слоя [96]. Причинами могут служить: обратимость поверхностных химических реакций, стерические затруднения, возникающие при хемосорбции молекул с относительно крупными лигандами, а также неоднородность ФГ на поверхности и различия в их реакционной способности (рисунок 1.22).
Кроме того, низкая скорость роста и неоднородность пленок может быть вызвана низкой реакционной способностью реагентов, их нестабильностью при определенных температурах, обратимостью химических реакций, физической адсорбцией реагентов и продуктов реакции на поверхности и т. д. В связи с этим, для успешного проведения синтеза методом МН-ALD необходимо определить оптимальные условия проведения процесса – так называемое «окно синтеза» (рисунок 1.23), то есть условия, при которых протекающие химические реакции самоограничивающиеся, скорость роста постоянна и не зависит от концентрации и количества используемых реагентов [16].
Следует особо отметить, что метод МН-ALD позволяет выращивать тонкие пленки с высочайшей точностью по толщине на всей площади поверхности подложки. Проведение химических реакций исключительно на поверхности и отсутствие реакций между реагентами в газовой фазе позволяет наносить сплошные равномерные покрытия на подложках самой разнообразной формы (рисунок 1.24), что практически невозможно реализовать другими методами.
К настоящему моменту метод МН-ALD нашел широкое применение как в научно-исследовательских целях, так и в практических [14,16,98,99]. Особый интерес он представляет для нанесения нанопленок на поверхности наночастиц, а также пористых объектов и узких каналов (рисунок 1.25) [100,101]. Однако несмотря на множество преимуществ МН-ALD, его применение в медицине слабо исследовано [102], а исследования по модификации поверхности имплантов ограниченны лишь кратким изучением in vitro характеристик МН-ALD покрытий оксида титана [103] и гидроксиапатита [104]. Тем не менее, даже имеющиеся результаты свидетельствуют о значительных перспективах использования данного метода для нанесения равномерных, сплошных покрытий и улучшения биомедицинских свойств имплантов.
Анализ состава поверхности образцов
В соответствии с данными РФлС все исследуемые образцы состоят из титана ( 99%) – таблица 3.4. Содержание примесей Fe – 0.22–0.25%, O – 0.10– 0.24%, Cu – 0.09–0.15%.
Обзорные спектры РФЭС показали присутствие на поверхности образцов титана, кислорода и углерода. Ионное травление образцов в вакуумной камере установки РФЭС привело к исчезновению пика углерода (рисунок 3.29). Таким образом, углерод в исследуемых образцах присутствует только в приповерхностном слое и, вероятно, вызван исключительно адсорбцией углеродсодержащих молекул из воздуха [134].
Результаты измерения РФЭС Ti2p спектров продемонстрировали наличие пиков Ti2p3/2 и Ti2p1/2 с максимумами 459,2 и 464,9 эВ для всех исследуемых образцов (Рисунок 3.30). Максимумы соответствуют состоянию Ti4+ [135]. Попытки разложения пиков на отдельные компоненты не показали присутствия Ti3+ и Ti2+ при меньших энергиях, что свидетельствует о том, что покрытия полученные методом МН-ALD состоят из диоксида титана.
Пик в районе 454 эВ, соответствующий Ti0 присутствует на спектрах для образца исходного титана (рисунок 3.31) и полностью исчезает после травления в H2SO4\H2O2 [79], однако присутствует для образцов подвергнутых травлению в NH4OH\H2O2. Более подробное описание и обсуждение данного явления описано в разделе 3.3.1. Исчезновения пика Ti0 наблюдается после нанесения покрытия методом МН-ALD, что может свидетельствовать о полном заполнении поверхности сплошным слоем TiO2 [134].
Для всех исследованных образцов характерен несимметричный РФЭС O1s пик, который раскладывается на две компоненты (рисунок 3.32): 1) 530,5 эВ, соответствующая связи Ti–O и 2) компонента в области 532 эВ, соответствующая поверхностным гидроксильным группам и химически сорбировавшимся молекулам воды [135]. Интенсивность последней компоненты выше для образцов, травленных H2SO4\H2O2 в сравнении с образцами NH4OH\H2O2, однако после нанесения покрытий методом МН-ALD интенсивность снижается и выравнивается для обоих типов образцов. Различие в интенсивности второй компоненты может быть вызвано как изменением концентрации гидроксильных групп на поверхности образцов, так и различием их удельной поверхности [121,134].
Масс спектры образцов УМЗ титана, модифицированного методом МН-ALD (рисунок 3.33), также как и образцы без покрытий (рисунок 3.15), содержат на поверхности посторонние ионы как органической (CO+, C+, C2H2-), так и неорганической (Fe+, K+) природы. Зафиксировано значительное содержание гидроксильных групп на поверхности (ионы OH-, TiOH+, TiOOH+), а также Ti+, TiO+, TiO2+, TiO-, TiO2-, TiO3-, соответствующие нанесенному слою оксида титана.
Для образцов, модифицированных МН-ALD характерно снижение концентрации ионов ОН- при увеличении времени профилирования с помощью ионного травления (рисунок 3.34), а также относительное увеличение числа ионов TiO- в сравнении с TiO2-, что может быть вызвано наличием переходного кислороддефицитного слоя оксида титана переходящего в металлический Ti [1].
Сравнение полученных результатов с литературными данными
Важной задачей анализа текущих результатов была оценка перспективности предложенного подхода к модификации поверхности в сравнении с результатами ведущих мировых исследований. Среди многообразия литературных данных наибольшего интереса заслуживают in vitro исследования иерархических или гибридных микро/наноструктур. Параметры жизнеспособности, пролиферации, и дифференцировки текущего исследования и литературных данных были тщательно проанализированы и суммированы в таблице 3.7.
Результаты сложно сравнивать, так как авторами использовались различные клетки и образцы сравнения, использовались различные методы получения образцов и методики in vitro испытаний (особенно это касается контрольных времен измерений). Тем не менее представленные в литературе данные позволяют сделать ряд сравнений и выводов. Ветронэ и коллеги также как и в данном исследовании использовали растворы NH4OH/H2O2 и H2SO4/H2O2 для модификации поверхности титана [79]. Морфология поверхности образцов была похожа на полученную в данной работе, однако рельеф не был подробно изучен. Авторы обнаружили, что H2SO4/H2O2 травление приводит к улучшению адгезии и пролиферации, в то время как NH4OH/H2O2 ухудшает жизнеспособность клеток МC3T3-E1 и минерализацию. Следует отметить, что Ветронэ и коллеги использовали для травления КЗ титан характеристики которого могут значительно отличаться от УМЗ аналогов [144]. В ряде других работ множество разнообразных методов было использовано для получения иерархических микро/наноструктур, включая анодирование, химическое травление, спекание в плазме искрового разряда. В результате полученные структуры значительно различаются по морфологии, рельефу, составу и in vitro характеристикам.
Тем не менее, если среди результатов данной работы учитывать наилучшие (образцы серии ХТ+МН-ALD), то результаты дифференцировки очень схожи с лучшими показателями зарубежных коллег. Показатели жизнеспособности и дифференцировки образцов серии ХТ+МН-ALD равны или превосходят показатели большинства исследователей. Однако следует признать, что текущие результаты не являются рекордными. Например, жизнеспособность полученных в данной работе образцов меньше иерархических структур полученных Ли и коллегами [66], однако превосходят по дифференцировке их, а также ряд результатов других исследователей [68,69,146,147]. Тем не менее, самые большие показатели дифференцировки были зафиксированы в работах Кубо и Жуанга [148,149].
In vivo результаты показали, что все образцы нетоксичны и обладают хорошей приживляемостью. Комбинация химического травления и МН-ALD (образцы NH4OH/H2O2-2ч+МН-ALD) продемонстрировала лучшие параметры для формирования связей с окружающими тканями. Таким образом наибольшее утолщение кортикального слоя и сила извлечения наблюдались для образцов с иерархическими микро/наноструктурами. Это может указывать на ускоренный остеогенез в области контакта кости с поверхностью имплантата. Степень осстеоинтеграции (измеренная с использованием метода измерения крутящего момента извлечения) сравнима с результатами, опубликованными ранее Сулом [150], где импланты с фторсодержащими нанотрубками TiO2 внедренные в бедренные кости кроликов продемонстрировали значительную остеоинтеграцию (крутящий момент извлечения 41 против 29 Н см) и формирование новой костной ткани (65,5% против 57,5%,) по сравнению с имплантатами без покрытия. Считается, что превышение крутящего момента извлечения свыше 20 Н см свидетельствует об успешной остеоинтеграции [151], а результаты в районе 45-48 близки к идеальным [109]. В данной работе для лучшего образца момент равен 38,83±1,17 Н см, что свидетельствует о чрезвычайно высокой степени остеоинтеграции и периоде приживляемости значительно меньше 8 недель, которые являются стандартным периодом для исследований in vivo [1,109].
Подводя итог, можно с уверенностью утверждать, что предложенный в данной работе подход, объединяющий использование методов ИПД, химического травления и МН-ALD, имеет большие перспективы для создания ортопедических имплантов с ускоренным временем приживления и высокой надежностью. Однако он требует значительной доработки в оптимизации процессов химического травления и МН-ALD и более подробных in vitro и in vivo испытаний, а также клинических исследований.
Несмотря на то, что в данной работе не проводилось сравнение c in vivo испытаниями коммерчески доступных имплантов, результаты сравнения модифицированных образцов с необработанными, позволяют судить о том, что характеристики наших образцов сравнимы с показателями лучших коммерческих в области надежности и скорости приживляемости.