Содержание к диссертации
Введение
Глава I: Обзор литературы 10
1.1. Проблема травматизма в Российской федерации 10
1.2.Механизмы репаративного остео - и хондрогенеза 12
1.2.1. Репаративный хондрогенез 12
1.2.2. Репаративный остеогенез 14
1.3. Хирургическое лечение переломов методами накостного остеосинтеза...16
1.4. Причины нарушения сращения костной ткани 21
1.5. Использование методов стимуляции остеогенеза в лечении переломов 24
1.6. Применение комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных
факторов роста при лечении переломов 26
Глава II: Общая характеристика экспериментальных групп и методов исследований 30
2.1. Организация экспериментального исследования на животных 30
2.2. Общая характеристика исследуемых групп 31
2.3. Клинические методы исследования 32
2.4. Лучевые методы исследований 33
2.4.1. Рентгенографическое исследование 33
2.4.2. Ультразвуковое исследование 34
2.5. Гистологические методы исследования 34
2.6. Статистическая обработка результатов исследований 35
Глава III. Хирургическое лечение переломов методом накостного остеосинтеза модифицированной пластиной с применением КАЛТФР 37
3.1. Предоперационное планирование 37
3.1.1. Технология изготовления комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста 38
3.1.2. Подготовка металлоконструкций для использования КАЛТФР 41
3.2. Анестезиологическое пособие 43
3.3. Техника накостного остеосинтеза бедра кролика без использования КАЛТФ и модифицированной пластины 45
3.4. Техника накостного остеосинтеза бедра кролика с применением КАЛТФР и модифицированной пластины 47
3.5. Ведение раннего послеоперационного периода у животных 54
Глава IV: Результаты хирургического лечения переломов в эксперименте 55
4.1. Результаты ультразвукового исследования 56
4.2. Результаты рентгенологического исследования 59
4.3. Морфолого-статистический анализ результатов лечения переломов в эксперименте 66
Заключение 77
Выводы 79
Практические рекомендации 80
Литература
- Репаративный хондрогенез
- Клинические методы исследования
- Технология изготовления комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста
- Морфолого-статистический анализ результатов лечения переломов в эксперименте
Введение к работе
Актуальность исследования. С развитием техники и ростом урбанизации число скелетных травм, в том числе высокоэнергетических, из года в год увеличивается (Артамошина М.П., 2007). При этом, несмотря на определенные научные и практические достижения в травматологии и ортопедии, тенденции к снижению частоты осложнений в виде замедленной консолидации костных отломков нет (Голка Г.Г., Белостоцкий А.И., Фадеев О.Г., 2013).
Сроки иммобилизации и степень восстановления функции конечности обусловлены скоростью репаративных процессов (Еликов А.В., Караваев С.А., Цапок П.И., 2009, 2012; Струков В.И., Прохоров М.Д., Елистратов Д.Г., 2013). В 1965 году Marshall R. Urist из Калифорнийского университета впервые применил для стимуляции остеогенеза богатую тромбоцитами плазму (АутоБоТП). При этом он исходил из результатов, полученных предшественниками, в которых имелись указания как на выраженную ангиогенную, так и на остеогенную активность веществ, содержащихся в гранулах тромбоцитов.
Данные вещества - (тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста - pi (TGF-(31) и трансформирующий фактор роста - р2 (TGF-(32)) полипептидной природы относятся к группе факторов роста. Тромбоцитарный фактор роста участвует в регуляции процессов острого воспаления, заживления ран и образования рубца, присутствует в нейронах ЦНС, где, как предполагают, он играет важную роль в процессе выживания и регенерации клеток, в опосредованнии пролиферации и дифференцировки глиальных клеток (Ballas M.S., ChachouaA., 2011).
С целью активизации заживления ран и остеогенеза сотрудниками кафедры травматологии и ортопедии ВГМА им. Н.Н. Бурденко в 2012 было предположено использовать комплекс аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста (КАЛТФР), получаемых из аутоплазмы больного путём лиофилизации («Технология лиофилизации обогащенной тромбоцитами плазмы с сохранением жизнеспособности факторов TGF PDGF VEGF» (Самодай В.Г., Полесский М.Г.,2014).
Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани и препараты без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 С). Лиофилизированые ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства (Гусаров Д.А., 2010).
Оптимальное решение проблемы местного воздействия лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста представляется возможным на основе модификации пластин для металлостеосинтеза с целью создания условий депонирования препаратов в зоне перелома.
Цель исследования: улучшить результаты хирургического лечения переломов костей различных сегментов в условиях металлостеосинтеза модифицированной пластиной с нанесенным на нее комплексом аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста в эксперименте на кроликах.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Провести анализ результатов традиционного накостного остеосинтеза переломов диафиза бедренной кости в эксперименте на кроликах.
-
Разработать и применить в эксперименте способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины с нанесенным на нее препаратом комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста.
-
Изучить динамику процесса консолидации переломов в экспериментальной и контрольной группах кроликов в разные сроки наблюдения методами лучевой диагностики.
-
Гистологически оценить темпы и качество формирования костной ткани при использовании комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста.
-
Провести сравнительную оценку процесса регенерации костной ткани контрольной и экспериментальной групп методом морфолого-статистического анализа.
Научная новизна исследования:
1. Разработан способ аккумуляция биологически активных сухих веществ
на металлоконструкциях для накостного остеосинтеза;
-
Применен способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины и комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитар-ных факторов роста для лечения переломов в эксперименте;
-
Установлена эффективность применения комплекса аутогенных лиофилизированных факторов роста для стимуляции консолидации переломов (заявка на изобретение № 2014154475 от 30.12.2014 «Способ накостного остеосинтеза с применением комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста»).
Практическая значимость. Разработан способ хирургического лечения переломов длинных трубчатых костей, основанный на применении модифицированных накостных металлоконструкций с использованием комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста, позволяющий повысить эффективность и сократить сроки хирургического лечения переломов.
Основные положения, вынесенные на защиту:
-
Предложенная модифицированная пластина для накостного остеосинтеза способствует фиксации комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста, стимулирующих остеогенез, в зоне перелома.
-
Разработанный способ применения КАЛТФР позволяет улучшить результаты хирургического лечения переломов в эксперименте.
Методы исследования. Для решения поставленных задач в работе использовались экспериментальные методы моделирования переломов костей с последующим накостным остеосинтезом костных фрагментов, лучевые и гистологические методы исследования тканей в зоне перелома. Размеры образовавшейся грануляционной ткани, хрящевой и костной мозолей оценивали с использованием системы анализа изображений Q550W (Германия) и программы «ImageJ». Для информационной интерпретации полученных результатов морфометрии проведен морфолого-статистический анализ на ПЭВМ, с помощью пакетов программ:
Statistica 8.0, SSPS 13, с использованием параметрических критериев. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение р<0,05.
Достоверность и обоснованность результатов исследований обеспечены тщательностью проведенного эксперимента, качественным и количественным анализом данных применяемых исследований, системностью исследовательских процедур, применением современных методов статистической обработки информации.
Внедрение результатов исследования. Разработанный способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины и КАЛТФР применен для лечения переломов в эксперименте, а так же включён в научно-педагогический процесс кафедры травматологии и ортопедии ГБОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно практических конференциях: «X Юбилейный всероссийский съезд травматологов-ортопедов» (Москва, 2014), «Вклад молодых учёных в развитие травматологии, ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2014), «Современные принципы и технологии остеосинтеза костей конечностей, таза и позвоночника» (Санкт- Петербург, 2015 ), на заседании научно-практического общества травматологов и ортопедов Воронежской области (2014).
Личный вклад автора состоит в его участии на всех этапах процесса исследования: им изучены и систематизированы материалы по оценке проблемы травматизма и замедления консолидации костных отломков, разработан дизайн исследования и поставлен эксперимент на лабораторных животных (кроликах), разработана и использована в эксперименте модифицированная пластина для остеосинтеза, осуществлен забор костного материала для гистологических исследований, проведена аналитическая и статистическая обработка полученных данных, подготовлены публикации.
Публикации. Основные положения и результаты диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 3 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 101 странице и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, двух глав описывающих ход экспериментального исследования и его результаты, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 205 источников, из которых 127 отечественных и 78 зарубежных.
Репаративный хондрогенез
Существует два главных аспекта в вопросе хондрогенеза: репаративные возможности самих хондроцитов и функция соединительной ткани, окружающей их. По данным современной литературы (Т.А. Ступина, М.М. Шудло, 2007 г.; СП. Миронов, Н.П. Омелъяненко, 2008 г. и др.) мы знаем, что при нарушении целостности хрящевой ткани регенерация происходит непосредственно в результате влияния этих двух факторов. Первичным звеном ответной реакции при повреждении хряща служит окружающая его соединительная ткань, значит, интенсивность репарации напрямую зависит от локализации хряща. Важным моментом является глубина поражения и степень вовлечения в процесс субхондрального слоя кости. В случае внутрисуставных повреждений источником репарации, являются камбиальные элементы кости и костного мозга, а при поверхностных повреждениях главную роль имеет синовиальная оболочка сустава. Хрящевая ткань, ставшая свободными фрагментами в результате травматизации, сохраняет жизнеспособность и принимает активное участие в процессе репарации хряща. Этот механизм проявляется преимущественно в пролиферации хондроцитов, которая скорее мешает полноценной регенерации в виду своей чрезмерной активности. Новообразованные хондроциты ограничены в способности к синтезу полисахаридов и созданию межуточного вещества (М.А. Колесников, И.Ф. Ахтямов, 2012 г.). Трансформация молодых клеток хрящевой ткани происходит при помощи макромолекул «старого матрикса» и «факторов роста», которых значительно больше, и они более активны в субхондральной зоне.
Как и все клетки человеческого организма, клетки хрящевой ткани способны к делению. Часть изогенных групп хондроцитов после завершения формирования своей клеточной структуры приступает к синтезу коллагена и протеоглика-нов. Кравченко И.В. (2007 г.) указывает, что главным фактором в индукции процесса регенерации является комплексное влияние элементов матрикса и изменчивость скорости диффузии питательных веществ и гуморальных факторов, в том числе и «факторов роста». Выше описанный механизм патогенеза позволяет хрящу восстанавливать постоянно возникающие незначительные повреждения, а при более объемных травмах создавать благоприятное микроокружение и локализо 14 вать деструкцию (Л.А. Наумова, СВ. Пушкарев, 2009 г.; И.В. Майбородин, А.И. Шевела, 2011 г.; P.P. Ахмеров, Р.Ф. Зарудий, З.М. Аминова, 2013 г. и др.). Важно отметить, что процесс пролиферации и активации - это лишь «попытки» хондроцитов восстановить матрикс, и они недостаточны для полноценного заживления посттравматического дефекта. Необходимо присоединение экзогенных факторов по отношению к хрящевой ткани, а именно, влияние гистогенетических компонентов перихондра, соединительной и костной ткани, сосудов, стромальных клеток костного мозга.
Во многих работах, посвященных хондрорегенерации, отводится важная роль репарация суставного хряща. Доказано, что пролиферация хондроцитов и синтез веществ матрикса можно спровоцировать трансплантацией в область повреждения блоков или суспензии хондроцитов из эпифизов кости (Ю.М. Ирьянов, Е.Н. Горбач, 2006 г.). Но главная трудность состоит не в стимуляции пролиферации, а в необходимости усиления функции по созданию упорядоченной структуры матрикса, обеспечивающей нормальную функцию суставного хряща, особенно в области, граничащей с полостью сустава (Ю.М. Чернякова, Л.С. Пинчук, 2007 г.; О.С. Лаврукова, 2013 г.). Именно поэтому стимуляция «факторами роста», вызывающая активность самого хряща в условиях повреждения, представляет большой интерес для практической медицины.
В результате влияния травматического агента на кость и окружающие ткани в зоне перелома запускается каскадный механизм, представляющий собой сложную цепь биохимических и нейрогуморальных реакций. Пусковым механизмом ответа организма, является афферентный импульс в кору головного мозга, что подчеркивает главенствующую роль ЦНС в описываемых процессах. Из всех полученных мозгом сигналов выделяется часть, инициирующих при своем прохождении через подкорковую структуру комплекс связей так называемого «транзи-торного нейронального ансамбля» (Р.Г. Есин, 2006 г.). Такая ассоциация из эво-люционно древних и новых структур генерирует крайне сложный по своей природе эфферентный поток импульсов, результатом которого является спазм стенки сосудов малого калибра в зоне повреждения, приводящий к клеточному стазу и гибели клеток. Подобного рода реакция в той или иной степени происходит во всём организме. Следствием случившегося является неизбежный сбой гомеоста-таза по причине необычно большого выброса лизосомальных ферментов, биоактивных веществ и продуктов клеточного детрита, что только усугубляет нарушение регионарного кровообращения. Но эти же самые вещества и их продукты метаболизма приводят к началу общих и местных репаративных реакций. В месте перелома, происходит формирование благоприятных условий для регенерации поврежденных тканей.
Самым важным и, наверное, наиболее сложным является процесс активации индуцируемых остеогенных клеток предшественников - ИОКП (И.А. Кирилова, В.Т. Подорожная, И.П. Ардашев, СВ. Черницов, 2008 г.; Л.М. Панченко, А.В. Калашников, В.А. Боер, А.Г. Зубенко, Ю.А. Ставинский, В.В. Тимочук, 2013 г. и др.). В процессе разрушения тромбоцитарных пластин в зону перелома выделяются альфа-гранулы, представляющие собой сгустки лизосомальных ферментов и факторов роста (И.М. Устьянцева, 2008 г.). Генетическая информация об активизации этих веществ находится в 22 паре хромосом и функционирует постоянно, на протяжении всей жизни человека. Этот локус входит в состав многочисленных генных оперонов, участвующих в выработке большой группы гистоиндуктивных веществ. При адгезии (при травме) и распаде тромбоцитов, вследствие нарушения стереоструктуры, происходит дегрануляции их а-гранул и «факторы роста» мгновенно влияют на рецепторы первого и, вероятно, второго типов цитолемм стро-мальных клеток предшественников именно в зоне повреждения (Н.А. Петинати, И.Н. Шипунова и др., 2013 г.), но существует мнение, что и по всему организму (А.И. Бычков, А.С. Иванов, 2012 г.) Данная цепь реакций длится около десяти дней и вызывает быстрый рост митотической активности в популяциях клеток-предшественников (ИОКП и ДОКП), создавая морфофункциональный пул «ос-теобластического клеточного дифферона» (Ю.М. Ирьянов, Т.А. Силантьева, 2007 г.). Пройдя несколько этапов развития, стромальные клетки предшественники трансформируются в проостеобласты. Похожие процессы происходят и в фибробластах, находящихся в гематоме и капиллярной сети вблизи нее. Так как факторы роста воздействуют только на мембранные рецепторы клеток, они не вызывают никаких изменений в хромосомах.
Существует информация, что факторы роста, воздействуя на проостеобла-сты и остеобласты, тем самым вызывают ускорение процесса консолидации (А.А. Шумилова, Е.И. Шишацкая, 2014 г.; В.И. Шемонаев, В.В. Новочадов, А.Ю. Алек-сеенко, 2014 г.). Немалая роль так же принадлежит костноморфогенетическому протеину (BMP), значительно ускоряющему трансформацию кости и хряща (Г.М. Кавалерский, В.Г. Германов, З.А. Черкашина, В.А. Семенов, 2006 г.; A.M. Савин-цев, А.Б. Смолянинов, Д.В. Булгин, М.А. Булатов, 2007 г.). Зная большую роль и участие тромбоцитарных «факторов роста» в процессе репаративного остеогенеза, трудно переоценить их значение как в остеоиндукции, так и в остеокондукции. По образному выражению В. Г. Самодая (2005 г.) тромбоцитарные «факторы роста» являются «командой SOS» не только для остеогенных клеток предшественников, но и для всех производных мезенхимальной ткани.
Клинические методы исследования
Метод накостного остеосинтеза заключается в адекватной репозиции и стабильной фиксации отломков. Достижение поставленной задачи осуществляется при соблюдении основных требований, рекомендованных ассоциацией AO/ASIF. Пластины должны быть прочными, жесткими и в достаточной степени длинными, чтобы противостоять силам напряжения мышц. Во избежание электрохимической коррозии винты должны быть из того же сплава, что и сама пластина. Пластины и винты создают единую жесткую конструкцию, удерживающую отломки в репонированном положении до полного их срастания, что создается временным переносом механических нагрузок на пластину с винтами, тем самым, разгружая место перелома. После подбора металлоконструкций для нашей экспериментальной работы все пластины были подвергнуты модификации, необходимой для использования КАЛТФР.
На рабочей контактирующей с костью поверхности пластины, планируемой для выполнения остеосинтеза перелома, инструментально производится нанесение цилиндрических углублений диаметром 0,5-1,0 мм и глубиной 0,3- 0,5 мм, в количестве 10-15 на см . Примерный суммарный объем полученных полостей можно рассчитать по формуле объема цилиндра (И.М. Виноградов, 1977
Мы знаем, что концентрация тромбоцитов крови у кроликов, использованных в эксперименте, составляет от 200 тыс/мкл до 400 тыс/мкл, при норме 130-900 тыс/мкл (В. Риган, Т. Сандерс, Д. Деникола, 2000 г.). Для изготовления лио-филизата из тромбоцитарной массы нами использовано 3-5 мл (1 мл = 10 мкл) цельной крови, соответственно количество тромбоцитов в аутоБоТП примерно от 6 до 20 10 /мкл. Соответственно это же количество сухого вещества из тромбоцитов сохраняется в КАЛТФР. Зная, что в каждом тромбоците около 1200 молекул PDGF массой 26-30 кДа, получаем массу PDGF цельной крови от 18,72 1012 кДа до 72 10 кДа. Сухой остаток плазмы крови составляет 8-10 %, это означает, что при изготовлении лиофилизата из тромбоцитарной массы мы получаем сухое вещество объемом 240 - 500 мкл, при сохранении того же количества сухого вещества из тромбоцитов, с сохранением массы PDGF. Известно, что кДа примерно равен 1,66043 ± 0,00031 10"12 нг, полученная нами концентрацию PDGF составляет 31,08 - 119,55 нг/мкл. Для стимуляции направленного действия достаточно содержание PDGF 0,1-0,2 нг/мкл (Siegbahn A. and Clin J., 1990 г.). Объем полости, созданной на пластине, способен аккумулировать достаточное количество факторов роста для стимуляции остеогенеза. Размеры использованных реконструкционных пластин: толщина 3,0 мм, ширина 10,0 мм, длина 49 - 73 мм (per. номер № 29/12010198 /4892-01) Незначительные размеры сделанных слепых отверстий не уменьшают прочность конструкции, но способны механически аккумулировать достаточный объем биологически активного вещества - КАЛТФР (рис. 6).
Модифицированная нами пластина, обеспечивает накопление тромбоцитарных факторов роста непосредственно в зоне перелома. При накостном прилежании пластины, благодаря имеющимся улублениям, полностью исключена миграция лиофилизата тромбоцитарной массы из места её размещения, что уменьшает потери действующего вещества. На этот способ накостого остеосинтеза модифицированой платиной с использование КАЛТФР нами оформлена заявка на патент №2014154475 от 30.12.2014 г.
При проведении оперативного вмешательства важной задачей является выбор оптимального наркозного препарата, отвечающего всем необходимым требованиям. Анестезиологические средства для животных, применяемые в экспериментальной практике, могут влиять на функцию не только центральной нервной системы, но и сердца, а также нарушать выработку гормонов в организме животных. Необходимо также отметить, что используемый общий анестетик должен быть разрешен к использованию на территории Российской Федерации и не должен оказывать значимого влияния на исследуемые показатели лабораторных животных. В доступных нам литературных источниках найдена информация о возможности применения препарата «Золетил» в качестве средства для неингаляционного наркоза в экспериментальном хирургическом исследовании (И.А. Савенко, Ю.В. Усманский и др., 2012 г.).
При выполнении оперативного вмешательства нами применялся препарат «Золетил 100», широко известный и активно применяемый в ветеринарной практике. Данный препарат относится к группе Б, но при этом находится в свободной продаже, что упрощает условия его приобретения и использования. Золетил 100 представляет собой общий анестетик для неингаляционного наркоза, включающий в себя тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид. Тилетамин - это общий анестетик диссоциативного типа действия, обладающий выраженным анальгетическим, но не достаточно сильным миорелаксирующим эффектами, что исключает угрозу остановки дыхания. Золазепам, вызывая анксиолитическое и седативное действие за счет угнетения подкорковых областей мозга, потенцирует наркозный и миорелаксирующий эффекты тилетамина, а также уменьшает выраженность болевых реакций после выхода из наркоза. Наркозный эффект достигается через 6-7 минут после однократного внутримышечного введения препарата в дозе до 15-30 мг/кг. Длительность хирургической стадии наркоза (при условии отсутствия выраженных внешних раздражителей) до 2-3 часов. В нашем случае, предполагая более короткую продолжительность оперативного вмешательства, мы использовали дозировку 15 мг/кг, достигая тем самым длительность стадии хирургического наркоза около 1 часа. Препарат выпускается в стеклянных флаконах, содержащих лиофилизат действующих веществ, который необходимо перед использованием развести прилагаемым растворителем.
Перед наркозом животному осуществлялась премедикация внутримышечным введением раствора Рометар в дозе 0,1 мл/кг. Это седативное лекарственное средство в форме раствора для инъекций, содержащее в 1 мл 20 мг ксилазина гидрохлорида, а также вспомогательные компоненты: метилпарабен и воду для инъекций. Данный препарат является антагонистом центральных а2 45 адренорецепторов, и оказывает успокаивающее, миорелаксирующее и обезболивающее действие, стимулирует центральные и периферические а-рецепторы. Рометар оказывает пролонгирующие действие наркозных препаратов, обеспечивая плавный выход животного из наркоза.
Животные приходили в сознание не ранее чем через 5-10 минут после завершения всех манипуляций, оставаясь при этом под анальгетическим и седативным действием рометара, что исключало возможность ощущения ими каких либо острых болей. Осложнений общей анестезии не было.
Техника накостного остеосинтеза бедра кролика без использования КАЛТФ и модифицированной пластины.
Для соблюдения условий экспериментального исследования все кролики, как контрольной, так и экспериментальной группы, были одной породы, примерно одинакового возраста и находились в идентичных условиях содержания. Распределение особей по группам выполняли путем слепого рандомизированого отбора. У всех животных контрольной группы мы применяли фиксацию отломков при помощи пластин для накостного остеосинтеза (реконструкционных) с использованием фиксации 4-6 кортикальными винтами.
Оперативный доступ осуществляли по переднебоковой поверхности бедра. Тупо выполняли расслоение мышц с выделением средней трети диафиза бедра (рис. 7).
Моделирование поперечного перелома выполняли во всех исследуемых группах в области диафиза бедра при помощи фрезы диаметром 1 мм, после чего производили репозицию полученных отломков. Осуществляли обнажение бедренной кости в объеме, минимально требуемом для помещения металлоконструкции. После предварительного моделирования по форме бедра, пластину укладывали на кость, удерживали костодержателем и фиксировали 4-6 винтами диаметром 2,5 и 3,5 мм (рис. 8). Затем, сняв костодержатели и убедившись в стабильности удержания отломков, мы ушивали рану послойно кетгутом. При проведении оперативного вмешательства на всем протяжении выполняли тщательный контроль гемостаза. Кожные покровы ушивали капроном, при необходимости рану дренировали перчаточным выпускником. На рану укладывали стерильную салфетку, смоченную спиртовым раствором хлоргексидина, и наклеевали аспетиче-скую повязку «Круподерм». При необходимости дополнительно применяли бинтование.
Технология изготовления комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста
По литературным данным известно, что процесс заживления переломов бедра у кроликов в естественных условиях завершается в сроки от 28 до 35 дней. Именно этот временной диапазон можно считать нормальным сроком консолидации. Формирование костной мозоли является сложным и многоэтапным процессом, на который способны повлиять множество различных факторов. В связи с этим актуальным является выявить нарушения остеогенеза в хронодинамике эксперимента по результатам гистологического исследования.
Аутопсийный материал прооперированной бедренной кости кроликов, с расположенной на ней металлоконструкцией извлечен спустя 7; 14; 21; 28 суток с момента операции, соответственно исследуемой подгруппе (рис. 25).
Из полученного материала выпиливали по три фрагмента костной мозоли толщиной четыре - пять мм. Эти фрагменты фиксировали в 10% забуференном растворе цинк-формалина в течение трех суток, затем декальцинировали в растворе «Трилон-В» в течение трех недель, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Изготавливали пара 67 финовые срезы толщиной 4,0 мкм и окрашивали несколькими методиками: гематоксилином-эозином; по Массону - анилиновым синим; альциановым синим - рН 2.5. Микроскопическое исследование проводили на светооптическом микроскопе Leica DMR (Германия), с использованием видеоискателя Leica DFC295, при увеличении 50;100;200;400. Изображения получены с использование лицензионного программного обеспечения Leica Application Suite Version 4.4.0 производства Leica Microsystems (Switzerland) Limited и Leica Microsystems CMS GmbH. Морфометрию исследуемых критериев (размеры образовавшейся грануляционной ткани, хрящевой и костной мозоли) оценивали с использованием системы анализа изображений Q550W (Германия) и программы «ImageJ».
В контрольной подгруппе № 2.1 на седьмые сутки отмечалась выраженная параоссальная реакция, с активным вовлечением надкостницы с прорастанием из нее сосудов для развития репаративного остеогенеза, констатированы признаки воспалительного процесса на фоне рубцовой соединительной ткани (рис. 26). соединительнотканный рубец с клетками фибробластического ряда, макрофагами и лимфо цитами. Микроскопическая характеристика зоны перелома экспериментальной подгруппы исследуемых кроликов № 1.1 с применением КАЛТФР констатировала наличие клеток хондробластического ряда и фрагменты молодого хряща, а также зрелого, представленного изогенными группами. Присутствовали клетки моноци-тарного ряда и остатки рубцовой соединительной ткани с окружающими сосудами (рис. 27).
Таким образом, спустя семь суток зона перелома у кроликов экспериментальной подгруппы №1.1, которые испытывали воздействие КАЛТФР, в сравнении с контрольной подгруппой № 2.1 отличалась ускоренным репаративным процессом с признаками хондрогенеза - началом образования хрящевой мозоли.
В зоне перелома у кроликов контрольной подгруппы № 2.2 спустя 14 суток заметны формирующиеся пластины и трабекулы хрящевой ткани (рис. 28). У кроликов экспериментальной подгруппы № 1.2 в условиях воздействия КАЛТФР спустя 14 суток отмечался процесс оссификации хряща, с признаками формирования первичной костной мозоли (рис. 29, 30). Рисунок 28. Зона перелома бедра кролика спустя 14 суток с момента операции. Контрольная подгруппа № 2.2, окраска гематоксилином-эозином, (хЮО).
Препарат зоны перелома бедра кролика спустя 14 суток с момента операции. Экспериментальная подгруппа № 1.2, окраска гематоксилином-эозином, (х50). Спустя 21 сутки у кроликов контрольной подгруппы № 2.3 в зоне перелома при микроскопировании, на фоне провизорного хряща было обнаружено незначительное количество гипертрофированных хондроцитов, свидетельствующих об изменении их синтетической активности и о существенном изменении транскрипционного профиля, индуцирующего переключение экспрессии основного коллагена хрящевой ткани на его экспрессию для костной и формирование костной мозоли (рис. 31).
В экспериментальной подгруппе кроликов № 1.3 спустя 21 сутки необходимо отметить фрагменты перихондральной манжетки и компактного вещества костной ткани кортикального слоя кости, на фоне восстановленной гемапоэтиче-ской паренхимы красного костного мозга (рис. 32).
Таким образом, спустя 21 сутки у контрольной подгруппы № 2.3 в области перелома наблюдалось завершение формирования костной грубоволокнистой мозоли, а в экспериментальной подгруппе № 1.3 на тех же сроках были обнаружены пластинки компактной костной ткани. Зона перелома бедра кролика спустя 28 суток с момента операции. Контрольная подгруппа № 2.4, окраска альциановым синим - рН 2.5. (хЮО).
У экспериментальной подгруппы кроликов № 1.4 в зоне перелома спустя 28 суток при микроскопировании видны трабекулы губчатой кости имеющие пластинчатое строение. Восстановлена сосудистая система. Отмечаются некоторые очаги резорбции костной ткани, как избыточной. Можно отметить завершающийся процесс перестройки регенерата в костную мозоль (рис. 34) с формирующимися остеонами (рис. 35).
Зона перелома бедра кролика спустя 28 суток с момента операции. Экспериментальная подгруппа № 1.4, окраска по Массону с анилиновым синим, ув. х50. 1: кровеносный сосуд. Рисунок 35. Зона перелома бедра кролика спустя 28 суток с момента операции. Экспериментальная подгруппа № 1.4, окраска по Массону с анилиновым синим, (х200). 1: осте он; 2: гаверсов канал. Описанная выше гистологическая картина подтверждается данными мор-фолого-статистического анализа. Для информационной интерпретации полученных результатов морфометрии проведен морфолого-статистический анализ на ПЭВМ, с помощью пакетов программ: Statistica 8.0, SSPS 13, с использованием параметрических критериев. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение р 0,05.
Площадь первичной хрящевой мозоли, образованной хондробластами и фибробластами в экспериментальной (опытной) группе достоверно больше относительно контрольной группы на 7 сутки эксперимента, а затем снижается в хро-нодинамике наблюдения до минимальных значений к 28 суткам, оставаясь достоверно ниже таковых значений в контроле (рис. 36.).
Морфолого-статистический анализ результатов лечения переломов в эксперименте
Во введении обоснована актуальность изучения проблемы повышения эффективности хирургического лечения переломов на основе стимуляции процессов консолидации и увеличении скорости репаративных процессов, сформулированы цель и задачи исследования, его научная новизна и практическая значимость
В первой главе работы выполнен обзор литературы, описаны наиболее известные на текущий момент методы накостного остеосинтеза. Рассмотрены основные причины замедления или несращения переломов и пути оптимизации регенерации с помощью использования комплекса факторов роста, содержащихся в лиофилизате АутоБоТП
Во второй главе представлен алгоритм экспериментального исследования. Все кролики были прооперированы с соблюдением технологии накостного остеосинтеза, рекомендованной AO/ASIF. У 16 кроликов экспериментальной группы на пластину для остеосинтеза, специальным образом модифицированную, наносили КАЛТФР. Послеоперационный период в экспериментальной и контрольной группе протекал без осложнений.
В третьей главе диссертации подробно изложена оперативная техника выполнения накостного остеосинтеза с использованием КАТФР. Дано описание способа изготовления лиофилизата и нанесение его на модифицированную пластину. Предложенный нами новый способ оперативного вмешательства, описанный в третьей главе, позволил ускорить интенсивность репаративного остеогенеза на ранней его стадии, тем самым снизив сроки лечения перелома бедра кроликов.
Четвертая глава диссертации посвящена сравнительному анализу результатов лечения исследуемых групп. Важнейшим показателем эффективности представленной методики остеосинтеза является снижение сроков консолидации переломов. В качестве методов исследования использовались лучевая диагностика (рентген, УЗИ), гистологическое исследование и морфолого-статистический анализ тканей зоны перелома. Показано, что у кроликов, при оперативном лечении которых применялось нанесение на металлическую пластину для остеосинтеза КАЛТФР, уже на сроках в 14 дней отмечается четкое ускорение репаративного остеогенеза по сравнению с контрольной группой. Структура рубцовой ткани экспериментальной группы отличается от контрольной не только темпами своего роста, но и интенсивностью трансформации в полноценную кость. Таким образом, благодаря стимулирующему действию комплекса аутогенных лиофилизиро-ванных тромбоцитарных факторов роста в зоне перелома значительно раньше происходит формирование и организация полноценной костной мозоли, опережая контрольные сроки на 5-7 дней, что происходит за счет усиленного неоангиогене-за и остеогенеза в зоне повреждения и подтверждается результатами гистологического исследования. В результате применения предложенного способа накостного остеосинтеза с использованием КАЛТФР, аккумулированного на специально модифицированной пластине, происходит адресное воздействие на репаративный остеогенез в зоне перелома. Все вышесказанное позволяет рекомендовать использование КАЛТФР при выполнении накостного металлостеосинтеза для снижения риска развития замедленной консолидации, сокращения сроков лечения переломов. ВЫВОДЫ.
Для изготовления комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоци-тарных факторов крови используется тромбоцитарная масса, полученная из ауто-плазмы. Объем забора венозной крови определяется исходя из контактирующей с поверхностью кости площади модифицированной пластины, подобранной для от-дельного случая. Достаточным является количество из расчета 1 мл крови на 1 см контактной площади пластины.
Модификация пластины заключается в придании ей способности аккумулировать КАЛТФР на своей поверхности и достигается путем нанесения мини-углублений диаметром 0,5-1,0 мм и глубиной 0,3-0,5 мм, количеством 15-20 на см2.
При выполнении оперативного вмешательства требуется полное соблюдение техники накостного остеосинтеза согласно рекомендациям AO/ASIF, обеспечивающей стабильность фиксации. Помимо этого, рекомендуется максимальное сохранения надкостницы костных отломков.
Материалы выполненного экспериментального исследования рекомендованы для внедрения в учебный процесс студентов, интернов и ординаторов в рамках цикла травматологии и ортопедии на базе Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко.