Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 9
1.1.Ишемически-реперфузионные повреждения при трансплантации трупной почки 9
1.2. Микродиализная технология - метод оценки ишемически реперфузионных повреждений трансплантированной трупной почки 13
1.3. Лабораторные и инструментальные методы диагностики функции почечного трансплантата 16
1.4. Особенности фармакологического прекондиционирования севорана и пропофола для профилактики ишемически-реперфузионных повреждений нефротрансплантата 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Общая характеристика больных 31
2.2. Методы анестезии 34
2.3.Методы исследования 36
2.4. Методы исследования биохимических показателей нефротрансплантата. Микродиализ . 37
2.5. Статистический анализ 45
ГЛАВА 3. Оценка эффективности метода микродиализа для ранней диагностики ишемически-реперфузионных повреждений и функции почечного аллотрансплантата 47
3.1. Оценка различий уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват между группами с первичной функцией и с дисфункцией почечного трансплантата.
3.2. Оценка предикторной значимости показателей уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват для предсказания в ранние сроки после трансплантации трупной почки риска развития дисфункции нефротрансплантата . 51
3.2.1. Оценка показателей уровня лактата 60
3.2.2. Оценка показателей уровня соотношения лактат/пируват 63
3.2.3. Характеристика моделей показателей-пердикторов для остальных точек наблюдения 68
ГЛАВА 4. Оценка ишемически-реперфузионных повреждений нефротрансплантата 72
ГЛАВА 5. Сравнение анестезии с использованием пропофола и севорана в качестве анестетиков 78
5.1. Оценка различий уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват между группами с применением севорана и пропофола в качестве интраоперационно вводимых анестетиков 78
Заключение 85
Выводы 91
Практические рекомендации 92
Список сокращений 93
Список литературы
- Особенности фармакологического прекондиционирования севорана и пропофола для профилактики ишемически-реперфузионных повреждений нефротрансплантата
- Методы исследования биохимических показателей нефротрансплантата. Микродиализ
- Оценка предикторной значимости показателей уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват для предсказания в ранние сроки после трансплантации трупной почки риска развития дисфункции нефротрансплантата
- Оценка различий уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват между группами с применением севорана и пропофола в качестве интраоперационно вводимых анестетиков
Особенности фармакологического прекондиционирования севорана и пропофола для профилактики ишемически-реперфузионных повреждений нефротрансплантата
Изначально микродиализ был создан для исследования тканевых эффектов и фармакокинетики лекарственных препаратов в ткани органа. Но в дальнейшем тканевой микродиализ стал использоваться как инвазивный метод непрерывного мониторинга концентрации биохимических показателей непосредственно в паренхиме органа [73,93].
В настоящее время наименее изученной областью клинического применения метода микродиализа является трансплантология. На данный момент эта область является наиболее значимой и заслуживает детального рассмотрения[140,89].
Вопросы ранней диагностики тканевой ишемии и повреждения клеток нефротрансплантата ещё до появления первых клинических признаков его дисфункции в периоперационном периоде имеют особую актуальность для разработки и стандартизации оптимальных схем послеоперационного ведения пациентов и дальнейшего прогнозирования качества жизни реципиентов с пересаженной почкой.
Микродиализ, как метод прямого определения концентрации веществ в паренхиме органа, был изначально создан для исследования метаболических изменений и фармакокинетики лекарственных препаратов [37, 89, 93]. Эта область применения остается значимой и в настоящее время, особенно для доклинических исследований новых лекарственных средств [97, 140]. Однако отдельный интерес представляет также возможность регистрации биохимических изменений в органах лабораторных животных при искусственно вызванных патологических процессах, например, создании моделей ИРП, воспаления, повреждений, опухолей [73, 101].
История микродиализной технологии (МДТ) берет свое начало в 60- е годы XX века, когда было опубликовано первое сообщение о свойствах микродиализной мембраны. Канадским ученным удалось выделить небольшое количество кортикостероидов из плазмы при помощи микродиализной мембраны. В 1966-67 гг. Bito L. и соавт. впервые имплантировали микродиализный катетер в мозг собаки для определения его биохимических параметров [130].
Методика взятия проб внеклеточной жидкости при помощи стеклянного катетера (диалитрод) Delgado, Urgenstedt и Pycock в 80- е гг xx века явилась прототипом современного микродиализа [58, 141]. 1987 году P. Lonnroth и соавт. устанавливали катетер в подкожную жировую клетчатку добровольцам и показал возможность определения глюкозы во внеклеточной жидкости методом микродиализа [88].
В 90-е годы, при появлении современных катетеров и портативных анализаторов, микродиализ постепенно стал самостоятельным видом мониторинга [40, 55, 75, 97]. Современный микродиализный катетер имеет мембранный участок, через который происходит пассивная диффузия веществ по градиенту концентрации из межтканевой жидкости в полость катетера, заполненную перфузионным раствором, близким по своему ионному составу к тканевой жидкости и подаваемым со стандартной скоростью при помощи помпы. Оттекающий раствор (диализат) изучается с помощью биохимического анализатора [46, 86]. Экспресс анализ основных клинических маркеров (глюкоза, лактат, пируват, соотношения лактат/пируват, глицерол) производится энзиматическим колориметрическим методом при помощи портативного анализатора у постели больного. Преимущественное использование вышеупомянутых маркеров обусловлено доступностью [59, 69, 96].
В основе метода микродиализа лежит пассивная диффузия веществ по градиенту концентрации через полунепроницаемую мембрану. Катетер представляет собой двуполостную концентрическую полиуретановую трубочку с наружным диаметром 1мм, конечный отдел которой представлен полунепроницаемой мембраной (стандартной длиной 10мм). Катетер имплантируется в ткань мониторируемого органа (в нашем случае, нефротрансплантата).
Концентрации и соотношение в диализате основных маркеров ИРП: глюкозы и ее метаболитов отражают состояние аэробного энергетического метаболизма в нефротрансплантате. При нарушении доставки кислорода и функции митохондрий метаболизм глюкозы переключается на анаэробный путь с преимущественным синтезом лактата. Проявлениями развивающейся ишемии с точки зрения микродиализа являются снижение концентрации глюкозы, постепенное снижение концентрации пирувата и повышение концентрации лактата. Изменения концентрации лактата и пирувата должны рассматриваться в контексте изменений в концентрации глюкозы и других параметров, так как они могут быть лишь проявлением уровня метаболизма или доставки субстрата (например, при гиперемии), а не свидетельствовать о преобладании анаэробного гликолиза. Кроме того, в связи с тем, что очень многие факторы оказывают влияние на извлекаемое количество вещества и не всегда могут быть приняты в расчет, концентрации метаболитов в диализате могут значительно отличаться от истинной тканевой концентрации [35, 72, 124]. Использование коэффициентов, а не абсолютных концентраций снижает вероятность неправильной интерпретации. Одним из наиболее распространенных коэффициентов является соотношение между концентрациями лактата и пирувата (СЛП = лактат/пируват). При недостаточности окислительного фосфорилирования наблюдается повышение СЛП за счет увеличения концентрации лактата и/или снижения концентрации пирувата. Как было показано во многих исследованиях, СЛП является чувствительным маркером ишемии.
Менее часто используемое соотношение концентраций лактата и глюкозы (СЛГ = лактат / глюкоза) отражает степень метаболизма глюкозы и преобладание продукции лактата и также повышается при ишемии, тканевой гипоксии и гипергликолизе.
Чувствительность маркеров энергетического метаболизма к нарушениям перфузии или оксигенации органа получила подтверждение при совместном применении микродиализа и других методов диагностики в клинике (УЗИ, лабораторных показателей, КТ брюшной полости).
Методы исследования биохимических показателей нефротрансплантата. Микродиализ
Пациенты были сопоставимы по возрасту, физическому статусу, времени холодовой ишемии, времени анестезии (Таблица 3).
В операционной после катетеризации центральной вены начинали инфузию кристаллоидных растворов, ориентируясь на показатели центрального венозного давления (ЦВД) и темп диуреза. Качественный состав использованных инфузионных сред был идентичен у всех пациентов. Основными компонентами инфузии являлись кристаллоидные растворы (физиологический раствор натрия хлорида 0,9%, 5% раствор глюкозы). Основным компонентом инфузионной терапии являлся физиологический раствор натрия хлорида 0,9% позволивший избежать риска развития гиперкалиемии. Скорость и объем инфузии зависели от состояния пациента, исходного проведения сеанса программного гемодиализа и от этапа операции. При необходимости через шприцевые дозаторы Perfusor Space (B.Braun, Германия) вводили допмин - 2–5 мкг/кг/мин. Дозы препаратов корригировали в зависимости от клинической ситуации.
В 1-ой группе индукцию анестезии проводили фентанилом (ФГУБ «Московский эндокринный завод», Россия) - 0,003 мг/кг, цисатракурием бензилатом (GlaxoSmithKline, Италия) - 0,15 мг/кг и дормикумом (мидазолам, F.Hoffmann-La Roche Ltd., Швейцария) - 0,15-0,2 мг/кг. На этапе перфузии нефротрансплантата анестезию поддерживали ингаляцией севорана, стараясь поддерживать допустимую глубину анестезии. За 10 минут до реперфузии трансплантата концентрацию севорана увеличивали до 1 МАК, дозу допамина меняли для поддержания уровня среднего АД (ср.АД) не ниже 70 мм рт. ст. Снижение BIS до 35 Ед. считали допустимым.
Во второй группе индукцию выполняли пропофолом-липуро (B.Braun Melsungen AG, Германия) в дозе 1,5-2 мг/кг, фентанилом (ФГУБ «Московский эндокринный завод», Россия) - 0,003 мг/кг и цисатракурием бензилатом (GlaxoSmithKline, Италия) - 0,15 мг/кг. После интубации трахеи анестезию поддерживали внутривенной инфузией пропофола по целевой концентрации (ИЦК) 2-6 мкг/мл. Управление целевой концентрацией пропофола проводили по фармакодинамической реакции пациента (BIS -35 Ед., поддержание уровня среднего АД (ср АД) не ниже 70 мм.рт.ст.).
Далее проводили анализ данных о концентрации глицерола, глюкозы, лактата и пирувата из проб диализата, полученных методом микродиализа при проведении трансплантации почки, в двух группах: с основным анестетиком севораном (группа 1) и пропофолом (группа 2).
Спектр стандартного интраоперационного мониторинга включал в себя непрерывный контроль электрокардиограммы (ЭКГ), измерение частоты сокращения сердца (ЧСС), пульсоксиметрию (SpO2), температурный мониторинг, неинвазивное измерение артериального давления (АДс, АДд, АДср), инвазивное измерение центрального венозного давления (ЦВД), мониторинг глубины гипнотического состояния с помощью регистрации биспектрального индекса электроэнцефалограммы (BIS) а также мониторинг глубины нервно-мышечного блока (TOF). Непрерывный мониторинг ЭКГ выполняли в двух отведениях, во II и вV5. Артериальное давление измеряли неинвазивным способом, манжету размещали на руке, не имеющей фистулы. Интервал измерений АД составлял 5 минут. Фистула была тщательно защищена от сдавления и случайной травмы в течение всей операции.
Мониторинг ЦВД проводили после индукции анестезии и интубации трахеи. В стерильных условиях проводили пункцию и катетеризацию верхней полой вены на стороне руки, не имеющей артериовенозной фистулы. Для пункции использовали подключичную или внутреннюю яремную вену.
Температурный мониторинг. Для предупреждения потерь тепла и развития интраоперационной гипотермии применяли комплекс мероприятий, включающий: использование согревающего матраца с рабочей температурой, согревание инфузионных растворов до 370С. Температуру контролировали в ротоглотке.
Мониторинг газообмена. Проводили анализ параметров вентиляции (минутного объема дыхания (МОД), дыхательного объема (ДО), частоты дыхательных движений (ЧДД), пикового давления вдоха (P peak), положительного давления конца выдоха (ПДКВ) и газообмена (концетрация кислорода, углекислого газа, ингаляционного анестетика на вдохе и выдохе) в дыхательном контуре при помощи газоанализатора Drager Primus (Германия).
В лаборатории экспресс-диагностики проводили анализ: показателей кислородного статуса (SO2%, pO2, ctHb, ctO2); показателей КОС венозной крови (pH, pCO2, cHCO3, ABE, SBE); электролитов (K+, Na+, Ca++, Cl-); осмоляльности; определяли уровень лактата, глюкозы, креатинина, билирубина.
В основе метода микродиализа лежит пассивная диффузия веществ по градиенту концентрации через полунепроницаемую мембрану. Катетер для микродиализа представляет собой двуполостную концентрическую полиуретановую трубочку (СМА 70, CMA Microdialisys, Sweden) с наружным диаметром 1мм, конечный отдел которой представлен полунепроницаемой мембраной (стандартной длиной 10мм). (Рисунок 3)
Оценка предикторной значимости показателей уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват для предсказания в ранние сроки после трансплантации трупной почки риска развития дисфункции нефротрансплантата
По результатам анализа были признаны значимыми (при p=0,05) показатели концентрации лактата во временных интервалах с 9 по 20-й часы и в 3-й час наблюдения. Однако лучшими показателями чувствительности и специфичности и их объединенной оценки – то есть способности теста, верно, классифицировать случаи первичной функции и дисфункции ПАТ – явились уровни концентрации лактата в диализате на девятый и двенадцатый часы исследования.
Для девятого часа наблюдения точность прогноза\площадь под кривой (OFC Overall Fraction Correct) составила 0,959 (ДИ 95% 0,896; 1,000). Точкой отсечения явился уровень 3,5 ммоль\л, для которой чувствительность теста составила 0,882 (ДИ 95% 0,711; 0,882), специфичность 1,00 (ДИ 95% 0,912; 1,000), их объединенная оценка - индекс Юдена 0,882.
Другие характеристики предикторной значимости для теста «лактат/девятый час наблюдения; значение больше 3,5 мкмоль\л – тест положительный; значение меньше 3,5 ммоль\л – тест отрицательный» составили: - отношение шансов (Odds Ratio-OR) бесконечно велико (ДИ 95% 25,5; бесконечная величина) - относительный риск (Relative Risk-RR) 17,5 (ДИ95% 5,8; 17,5); - диагностическая ценность положительного результата теста (Positive Predictive Value-PPV) 1,000 (ДИ 95% 0,806; 1,000); - диагностическая ценность отрицательного результата теста (Negative Predictive Value-NPV) 0,943 (ДИ«отличным» маркером-классификатором; 95% 0,860 0,943); - балансовая точность прогноза 0,941; тест является - балансовая точность диагноза 0,941; тест является «отличным» маркером-диагностом в соответствии с общепринятой шкалой оценки качества предиктора.
То есть вероятность развития дисфункции нефротрансплантата у пациентов с уровнем лактата, превышающим 3,5 ммоль\л на девятый час после начала реперфузии донорской почки (тест положительный), в 17,5 раза выше по сравнению с пациентами, у которых уровень лактата ниже этого значения и составляет 100%. При этом 88,2% пациентов с предиктором «лактат\девятый час наблюдения» ниже 3,5 ммоль\л (тест отрицательный) будут верно классифицированы как пациенты с развитием первичной функцией трансплантированной почки (ПФ) в последующем послеоперационном периоде. В целом, тест позволяет правильно предсказать характер начальной функции ПАТ у любого случайно выбранного пациента в 95,9 случаев. Мощность исследования для alfa=0,05 (ошибки 1 рода), то есть вероятность, что полученный результат исследования будет работать в популяции, составила 1,000.
Для двенадцатого часа наблюдения точность прогноза\площадь под кривой (OFC Overall Fraction Correct) составила 0,987 (ДИ 95% 0,963; 1,000). Точкой отсечения явился уровень 3,1 ммоль\л, для которой чувствительность теста составила 0,941 (ДИ 95% 0,764; 0,995), специфичность 0,970 (ДИ 95% 0,879; 0,997), их объединенная оценка - индекс Юдена 0,911.
Другие характеристики предикторной значимости для теста «лактат/двенадцатый час наблюдения; значение больше 3,1 ммоль\л – тест положительный; значение меньше 3,1 ммоль\л – тест отрицательный» составили: - отношение шансов (Odds Ratio-OR) 512 (ДИ 95% 23; 71051) - относительный риск (Relative Risk-RR) 31,1 (ДИ 95% 6,3; 371,0); - диагностическая ценность положительного результата теста (Positive Predictive Value-PPV) 0,941 (ДИ 95% 0,764; 0,995); - диагностическая ценность отрицательного результата теста (Negative Predictive Value-NPV) 0,97 (ДИ 95% 0,879; 0,997); - балансовая точность прогноза 0,956; тест является «отличным» маркером-классификатором; - балансовая точность диагноза 0,956; тест является «отличным» маркером-диагностом в соответствии с общепринятой шкалой оценки качества предиктора. То есть вероятность развития дисфункции нефротрансплантата у пациентов с уровнем лактата, превышающим 3,1 ммоль\л на двенадцатый час после начала реперфузии донорской почки (тест положительный), в 31,1 раза выше по сравнению с пациентами, у которых уровень глицерола ниже этого значения и составляет 97%. При этом 94,1% пациентов с предиктором «лактат\двенадцатый час наблюдения» ниже 3,1 ммоль\л (тест отрицательный) будут верно классифицированы как пациенты с развитием первичной функцией трансплантированной почки (ПФ) в последующем послеоперационном периоде. В целом, тест позволяет правильно предсказать характер начальной функции ПАТ у любого случайно выбранного пациента в 98,7% случаев. Мощность исследования для alfa=0,05 (ошибки 1 рода), то есть вероятность, что полученный результат исследования будет работать в популяции, составила 1,000.
Оценка различий уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват между группами с применением севорана и пропофола в качестве интраоперационно вводимых анестетиков
Полученные результаты позволяют предположить определенную эффективность метода микродиализа, как нового вида мониторинга внутриорганного метаболизма ПАТ, для раннего прогнозирования его начальной функции. Практически наиболее значимым представляется тот факт, что метод позволяет определять функцию трансплантата в первые часы после его реперфузии. У пациента после реваскуляризации нефротрансплантата развивается реперфузионный синдром, проявляющийся не только гемодинамическими, но и метаболическими сдвигами.
В контексте колебаний концентрации основных маркеров ишемии и гипоксии – лактата и пирувата, можно судить о доставке и потреблении главного энергетического субстрата – глюкозы, а, значит, и об адекватности метаболизма в трансплантате. Кроме того, использование не только абсолютных концентраций лактата и пирувата, но и их коэффициентов – СЛП, в значительной мере снижает вероятность ошибочной интерпретации полученных результатов, поскольку СЛП является чувствительным маркером клеточной ишемии и дисфункции.
По уровню содержания глицерола возможно оценить степень нарушения барьерной функции мембран и, как следствие, степень клеточной дисфункции нефротрансплантата. Метод позволяет определять ранние изменения метаболических показателей в нефротрансплантате.
Оценка различий уровня глицерола, глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат\пируват между группами с применением севорана и пропофола в качестве интраоперационно вводимых анестетиков
Результаты нашего исследования посредством использования микродиализа в клинических условиях позволили изучить влияние анестетиков на профилактику ишемического и реперфузионного повреждения пересаженной трупной почки.
Значение р для критерия Фишера относительно представленной пропорции составляет р=0,55, критерия Пирсона р=0,37, что указывает на отсутствие различий в распределении пациентов с первичной функцией трансплантата и дисфункцией при использовании различных анестетиков.
В первые 24 часа после трансплантации трупной почки собирали и анализировали пробы диализата, полученные при помощи микродиализного катетера. В диализате, собранном через 1 час, 2 часа, 3 часа, 7 часов, 12 часов, 16 и 20 часов определяли концентрацию глюкозы, лактата в ммоль\л, глицерола и пирувата в мкмоль\л; рассчитывали соотношение лактат\пируват для каждой точки исследования. Средние значения и меры рассеяния представлены в таблицах. Из 40 показателей различия выявляются только для двух с уровнем значимости р=0,013 для показателя «глюкоза - 16 час» и р=0,035 для показателя «пирувата-1 час». Для остальных показателей различия отсутствуют.
Средние значения, стандартные отклонения, медиана и квартильный размах (1; 3 квартили) глицерола в диализате в группах сравнения севоран и пропофол
Достоверные различия в группах сравнения «севоран» и «пропофол» выявлены для значения показателя «глюказа - 16 час» исследования (р=0,013). Таблица 17
Средние значения, стандартные отклонения, медиана и квартильный размах (1; 3 квартили) лактата в диализате в группах сравнения севоран и пропофол
Показа тели/ча сы СеворанN= 25 ПропофолN=25 р медиана 25,00% 75,00% медиана 25,00% 75,00% 1 3,75 3,1 4,09 4,3 2,95 4,95 0,12
Достоверные различия лактата при сравнении в группах «севоран» и «пропофол» в течение всего периода наблюдения получены не были. Таблица 18 Средние значения, стандартные отклонения, медиана и квартильный размах (1; 3 квартили) пирувата в диализате в группах сравнения севоран и пропофол
При анализе результатов исследования нами были выявлены значимые различия в группах «севоран» и «пропофол» по следующим биохимическим показателям: «глюкоза - 16 час» и «пируват 1-й час» наблюдения. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что эффективность фармакологического прекондиционирования севорана и пропофола равнозначна при трансплантации трупной почки.
По данным литературы, полученным в экспериментальных исследованиях, защитный эффект анестетиков связывают со снижением апоптоза тубулярных клеток нефротрансплантата и регуляцией ответа на ишемически реперфузионные повреждения медиаторов клеточного сигнала, таких как гипоксия-индуцируемый фактор-1а транскрипции (ГИФ 1а) [48, 76, 142], который активирует ответ при низкой концентрации кислорода, чтобы защитить клетку от кислородного голодания. Описаны и другие пути, которые включают влияние на трансформируемый фактор роста 1 (ТФР 1), который генерирует аденозин, мощную цитопротективную молекулу, через экто-5–нуклеотидазу (CD73) и сфингозин киназу и сфингозин-1-фосфат (S1P).
Севоран обладает противовоспалительным и антиапоптозным эффектом путем активации внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK), которая приводит к росту активности митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), транслокации сигнал-регулируемой киназы 2 (ERK2) в ядро и увеличению пролиферации эпителиальных клеток в проксимальных канальцах почек [23].
Пропофол наиболее широко применяемый внутривенный анестетик для индукции и поддержания общей анестезии. Основное действие пропофола осуществляется путем воздействия на ГАМК рецепторы и в недавних работах подтверждено, что воздействие на эти рецепторы позволяет индуцировать и поддерживать анестезию. Пропофол также исследовали на способность вызывать нефропротективный эффект. Так, H. Wang и соавт. в 2015 г., используя пропофол в экспериментальной работе на крысах, получили снижение уровня мочевины и креатинина при модели ишимически - реперфузионного повреждения почки. В ряде исследований отмечены протективные свойства пропофола при ишемии головного мозга, сердца и легких [131]. В результате проведенного исследования не выявлены различия в распределении пациентов с первичной функцией и дисфункцией трансплантата при использовании разных анестетиков.