Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Костный мозг трупных доноров как источник получения стволовых клеток для клинического применения (обзор литературы) .
1.1 Стволовые клетки и источники их получения в клинической практике
1.2 Получение костного мозга от трупных доноров и оценка эффективности миелоаспирации .
1.2.1 Сбор трупного костного мозга как самостоятельная операция
1.2.2 Проведение миелоаспирации при эксплантации органов
1.2.3 Цитометрическое исследование клеток в миелоаспирате
1.3 Свойства прогениторных клеток костного мозга трупных доноров
1.4 Использование клеток костного мозга трупных доноров для изготовления комбинированных трансплантатов
Заключение к обзору литературы
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Характеристика и стратификация трупных доноров
2.2 Сбор костного мозга
2.2.1 Техника пункции крыльев подвздошных костей
2.2.2 Техника миелоаспирации
2.3 Оценка эффективности миелоаспирации .
2.4 Изучение клеток костного мозга в культуре .
2.4.1 Получение культуры прилипающих к пластику клеток
2.4.2 Критерии и методы характеристики клеток костного мозга в культуре 11 11
2.5 Статистическая обработка данных .
ГЛАВА 3. Новый хирургический метод сбора костного мозга от трупных доноров с бьющимся и 49 небьющимся сердцем .
3.1 Увеличение эффективности заготовки костного мозга от трупных доноров с небьющимся сердцем 49
3.1.1 Использование при аспирации повышенного разрежения 49
3.1.2 Комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием 56
3.2 Разработка способов установки троакаров в крыло подвздошной кости для сбора костного мозга при укладке трупного донора в положение «на спине»
3.3. Разработка одноразовой многоканальной закрытой системы для автоматизированного сбора костного мозга
3.3.1. Автоматизированный сбор костного мозга комбинированием простой аспирации и аспирации-промывания с использованием новой одноразовой многоканальной закрытой системы 82 Заключение к главе 3
ГЛАВА 4. Перспективы использования костного мозга трупных доноров в клинической практике
4.1 Взаимодействие ядросодержащих клеток костного мозга трупных доноров в условиях, приближенных к in vivo .
4.2 Сравнительная характеристика культуральных свойств прилипающих к пластику клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем
4.2.1. Совместимость ММСК костного мозга трупных доноров с аллогенными тканевыми трансплантатами
99 Заключение к главе 4 102
ГЛАВА 5. Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список сокращений и условных обозначений
Список использованной литературы
- Сбор трупного костного мозга как самостоятельная операция
- Изучение клеток костного мозга в культуре
- Комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием
- Сравнительная характеристика культуральных свойств прилипающих к пластику клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем
Введение к работе
Актуальность работы
В клинической практике для восстановления утраченной функции органов все чаще прибегают к методам «клеточной» терапии, подразумевающим достижение результата за счёт способностей стволовых клеток к самообновлению и дифференцировке в разных направлениях [Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998]. В зависимости от выраженности патологического процесса методы лечения включают стимулирование резидентных прогениторных клеток или их ауто-, аллотрансплантацию.
Традиционно трансплантацию прогениторных клеток применяют в лечении пациентов с онкогематологическими заболеваниями. Для них разработаны и постоянно совершенствуются протоколы подготовки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), дозы и схемы их введения [Felfly H., 2014]. В случае необходимости стимулирования регенерации соединительных тканей, как правило, используют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [Franchini M., 2003]. Однако, несмотря на интерес хирургов и травматологов-ортопедов к методам «клеточной» терапии, существует дефицит соответствующих унифицированных протоколов. Одной из причин этого является нехватка биологического материала, как для проведения научных исследований, так и для клинического применения.
По данным отечественной и зарубежной литературы, источником получения большого количества прогениторных клеток разных типов может быть костный мозг (КМ) трупных доноров (ТД) – людей, находящихся в состоянии биологической смерти или смерти мозга [Machaliski B 2006; Michalova J, 2011]. В настоящее время наибольшее распространение получили методы сбора КМ, основанные на принципе аспирации. В соответствии с инструкцией по заготовке и консервированию посмертного костного мозга, утвержденной Главным управлением лечебно-профилактической помощи Министерства здравоохранения СССР в 1989 г., аспирацию КМ у ТД с биологической смертью ре-
комендовано проводить шприцем через многочисленные проколы крыла подвздошной кости троакаром. Однако эффективность такого сбора у ТД часто ниже, чем у здоровых доноров, что связано с отсутствием деятельности сердца и наступающими вследствие этого изменениями реологических свойств крови.
У ТД со смертью мозга, благодаря сохраненной деятельности сердца, есть возможность компенсировать грубые патологические изменения гомеостаза путем проведения интенсивной терапии [Хубутия М.Ш., 2011]. Однако активное развитие клинической трансплантологии способствовало смещению приоритетов к получению органов, пригодных для пересадки. В результате из-за отсутствия способов миелоаспирации, приспособленных для выполнения в ходе операции мультиорганного забора, КМ остаётся несобранным.
Таким образом, до настоящего времени особенности посмертного сбора КМ наиболее изучены только для ТД с небьющимся сердцем. При этом существующие методы заготовки имеют ряд недостатков, которые негативно отражаются на эффективности сбора и качестве получаемого биоматериала. Разработка нового, соответствующего современным техническим возможностям, хирургического способа миелоаспирации от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем, а также сравнительная характеристика клеток получаемого КМ и оценка возможности использования их в лечебной практике, вероятно, позволит сократить дефицит клеточного материала и даст импульс к клиническому исследованию эффективности его применения.
Цель исследования
Разработать хирургический способ заготовки костного мозга от трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем и оценить возможность использования получаемых костномозговых прогениторных клеток в клинической практике.
Задачи исследования
1. Определить пути увеличения эффективности заготовки костного мозга от трупных доноров с небьющимся сердцем.
-
Оптимизировать методику установки троакаров в крыло подвздошной кости для обеспечения одновременной заготовки от трупного донора костного мозга и других тканей, органов.
-
Разработать одноразовую многоканальную закрытую систему заготовки костного мозга, позволяющую получить от трупного донора большое количество жизнеспособных стволовых клеток.
-
Сравнить морфофункциональные свойства прогениторных клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем.
-
Оценить возможность использования клеток костного мозга трупных доноров для изготовления клеточно-тканевых композиций на основе биологических аллотрансплантатов, применяемых в клинической практике.
Научная новизна
Экспериментально обосновано использование большего разрежения и комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием для увеличения эффективности заготовки КМ от ТД. Определены критерии системы для автоматизированного сбора КМ от ТД. На основании полученных результатов разработана одноразовая многоканальная закрытая система заготовки костного мозга, позволяющая проводить автоматизированную миелоаспирацию и получать от ТД большое количество жизнеспособных стволовых клеток. Показана возможность получения от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем стволовых клеток в количестве, сопоставимом с терапевтической дозой для системного применения взрослому человеку.
Проведена сравнительная характеристика морфофункциональных свойств клеток КМ ТД с бьющимся и небьющимся сердцем. Показано, что клетки КМ ТД с бьющимся и небьющимся сердцем имеют схожую пролиферативную активность и соответствуют минимальным международным критериям мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток. Однако, в миелоаспирате от ТД с бьющимся сердцем количество КОЕ-Ф и продолжительность фазы «пролифе-ративного покоя» прилипающих к пластику клеток близки к показателям здо-
ровых доноров. Выявлена совместимость клеток КМ ТД с аллогенными тканевыми трансплантатами, применяемыми в клинической практике.
Практическая значимость
Использование при сборе КМ разрежения 0,6-0,7 Атм увеличивает эффективность миелоаспирации и не влияет на жизнеспособность получаемых клеток. Применение метода аспирации-промывания позволяет получить от ТД с небьющимся сердцем биоматериал с большим содержанием прогениторных клеток. Последовательное выполнение методов простой аспирации и аспирации-промывания обеспечивает сбор жизнеспособных стволовых клеток в количестве, сопоставимом с терапевтической дозой для системного применения взрослому пациенту.
Использование оптимизированной хирургической техники пункции кости при укладывании ТД в положение «на спине» позволяет проводить одновременно сбор КМ и других тканей. При этом объединение троакаров с помощью ОМЗС обеспечивает возможность проводить сбор КМ одновременно из нескольких точек пункции кости методами простой аспирации, аспирации-промывания с использованием разрежения 0,6-0,7 Атм. Конструктивные особенности ОМЗС позволяют автоматизировать сбор и переходить от одного метода сбора к другому, не разгерметизируя накопительный контур.
Получаемые из КМ трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем ГСК и ММСК можно использовать для изготовления клеточно-тканевых конструкций на основе аллогенных тканевых трансплантатов.
Положения, выносимые на защиту
1. При сборе костного мозга от трупных доноров с небьющимся сердцем увеличение разрежения с 0,4 до 0,6-0,7 Атм и комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием позволяет повысить эффективность заготовки без ущерба для жизнеспособности получаемых клеток.
-
Для сбора костного мозга от трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем методами простой аспирации, аспирации-промывания с применением увеличенного разрежения целесообразно использовать разработанную одноразовую многоканальную закрытую систему.
-
Стволовые клетки костного мозга трупных доноров сохраняют способность к пролиферации и дифференцировке и могут быть использованы для изготовления клеточно-тканевых конструкций на основе ал-логенных тканевых трансплантатов.
Внедрение результатов работы
Методика сбора костного мозга, разработанная в ходе данного исследования, внедрена в практику отделения консервирования тканей и производства трансплантатов НИИ СП им. Н. В. Склифосовского. Получен патент РФ на изобретение 2 523 563 С 1 «Технология получения костного мозга от доноров-трупов с бьющимся и небьющимся сердцем».
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на 5-й международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых в 2010 г., 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» в 2010 г., 5-м симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических клеток» в 2011 г., 6-м Всероссийском съезде трансплантологов с международным участием в 2012 г., 1-м Евразийском конгрессе «Трансплантация стволовых клеток» в 2013 г, а также на заседании проблемно-плановой комиссии № 8 НИИ СП им. Н.В. Склифосовского 22.06.2015г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ – 2. Патент РФ на изобретение 2 523 563 С 1 «Технология получе-
ния костного мозга от доноров-трупов с бьющимся и небьющимся сердцем» опубликован в Официальном бюллетене Федеральной службы по интеллектуальной собственности (Роспатент) «Изобретения. Полезные модели» №20 от 20.07.2014 г.
Личный вклад соискателя
Автор непосредственно участвовал в планировании и проведении всех этапов исследования, выборе методов исследования, заготовке КМ от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем, оптимизации техники хирургических манипуляций, разработке одноразовой многоканальной закрытой системы для сбора КМ и её испытании, изучении и сравнении свойств стволовых клеток, получаемых от ТД, систематизации и интерпретации полученных клинических и экспериментальных данных, их анализе. Аналитический обзор литературы также выполнен автором.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.
Диссертация содержит 131 страницу, 6 таблиц, 31 рисунок. Библиографический указатель включает 111 источников, из них 25 - отечественных и 86 -зарубежных.
Сбор трупного костного мозга как самостоятельная операция
В зависимости от выраженности патологического процесса методы терапии могут подразумевать стимулирование стволовых клеток или их трансплантацию.
Для активации пролиферации и дифференцировки прогениторных клеток in situ, как правило, используют сигнальные молекулы [46, 87]. Однако сложность формирования из них стабильной лекарственной формы выражается в высокой стоимости лечения. При этом в случае гибели резидентных прогениторных клеток или утраты ими способности воспринимать и адекватно отвечать на посланные сигналы - «стимулирующая» терапия будет не эффективна.
Трансплантацию клеток традиционно применяют в лечении пациентов с онкогематологическими заболеваниями [59]. Для них разработаны и постоянно совершенствуются протоколы подготовки ГСК, дозы и схемы их введения [55]. Трансплантат вводят в кровеносное русло и в случае его приживления достигают реконвалесценции. В хирургии, травматологии и ортопедии, когда требуется замещение соединительных тканей, как правило, используют ММСК [7, 27, 92]. При этом вне зависимости от типа применяемых стволовых клеток для оценки эффективности и стандартизации протоколов лечения используют унифицированный термин «терапевтическая доза» - оптимальное количество клеток, позволяющее достичь ожидаемого эффекта [84, 62].
Планируя трансплантацию, специалисты так же принимают решение от кого будут получены стволовые клетки. Это обусловлено тем, что реакция организма пациента на трансплантат в значительной степени зависит от схожести генотипов донора и реципиента. В случае сбора биоматериала от самого пациента операцию называют аутотрансплантацией, а образцы - аутологичными. Преимуществом этого варианта является идентичность геномов реципиента и клеток трансплантата, что способствует приживлению последнего в организме [35, 110]. Однако при генетической детерминированности патологического процесса для достижения реконвалесценции необходимо использовать клетки от донора, не имеющего атипичные гены, и относящегося к одному биологическому виду с реципиентом. В этой ситуации процедуру называют аллотрансплантацией, а образцы - аллогенными. При этом для снижения вероятности иммуноопосредованного повреждения трансплантата, которое может выразиться в снижении эффективности его применения, проводят тщательный подбор пары донор-реципиент исходя из степени их гистосовместимости [56]. С целью сокращения сроков поиска биоматериала, подходящего для пересадки, специалисты формируют реестры потенциальных доноров и банки пуповинной крови. Однако в случае отсутствия возможности подобрать пару донор-реципиент или сформировать терапевтическую дозу клеток из консервированных образцов длительность ожидания пациентом трансплантации может значительно увеличиваться. Таким образом, в современном понимании стволовые клетки являются универсальными стабильными модулями, которые могут создавать устойчивые ростки новой здоровой ткани в больных органах. Однако естественные ограничения направлений дифференцировки стволовых клеток, получаемых от человека в постнатальном периоде, обуславливают необходимость взвешенного подхода к их клиническому применению. При этом от схожести генотипов донора и реципиента в значительной степени зависит судьба пересаженной клетки и её потомков в организме пациента.
Формально в большинстве тканей организма человека содержатся резидентные прогениторные клетки, которые in situ обеспечивают физиологические процессы регенерации. Однако использовать для получения клеток в количестве, достаточном для формирования «терапевтической дозы», возможно лишь некоторые из них. В частности, жировую ткань специалисты рассматривают в качестве богатого источника ММСК [29]. Клетки выделяют из биоматериала, получаемого в результате хирургической операции. Ткань гомогенизируют, обрабатывают растворами ферментов и помещают в специализированные ростовые среды. Затем клетки, мигрировавшие из неё на ростовую поверхность, длительно масштабируют до накопления необходимого количества. В итоге получают культуру, состоящую из клеток, соответствующих международным минимальным критериям ММСК [4, 93]. Основным преимуществом использования жировой клетчатки является возможность получения аутологичных стволовых клеток из, как правило, утилизируемой иссеченной ткани. Однако в случае её отсутствия проводить хирургическое вмешательство специально для сбора биоматериала не целесообразно.
Идея получать стволовые клетки из невостребованных тканей получила развитие в работах с пуповиной и пуповинной кровью, остающимися после рождения ребенка. Этому способствует доступность биоматериала и достаточное его количество. Выделение клеток из «Вартонова студня» пуповины специалисты зачастую проводят способом, аналогичным применяемому в работе с жировой тканью [80]. Результатом работы является получение клеток, соответствующих международным минимальным критериям ММСК [45], но, как правило, аллогенных по отношению к потенциальному реципиенту. Общим недостатком использования жировой ткани и пуповины в качестве источника стволовых клеток является возможность получение только ММСК. При этом в случае необходимости накопления значительного количества клеток требуется длительное культивирование биоматериала [94]. В итоге активная пролиферация может истощить клетки, а многократные пассирования увеличивают вероятность спонтанного изменения их генотипа. Пуповинная кровь, в отличие от «Вартонового студня», содержит преимущественно ГСК [21, 79]. Биоматериал после сбора, оценки консервируют и в случае необходимости применяют, как правило, не разделяя на фракции [33]. Однако из-за сложности масштабировать ГСК, их общего количества в пуповинной крови порой недостаточно для формирования терапевтической дозы [28, 34, 98]. В результате для изготовления трансплантатов, позволяющих с высокой вероятностью достичь требуемого результата, наиболее часто прибегают к получению биоматериала от взрослых аллогенных доноров.
Изучение клеток костного мозга в культуре
Для пункции КПК вблизи ушковидной поверхности («задний отдел» КПК) -прокол кожи костной иглой выполняли на границе между внутренней и средней частями линии. Троакар ориентировали перпендикулярно коже и проводили через мягкие ткани до упора в кость. Вращая инструмент вдоль продольной оси и продвигая вперед, преодолевали сопротивление компактного вещества и пунктировали компактное вещество вглубь на 1-1,5 см. При необходимости перестановки троакара, его извлекали из кости, смещали 1-1,5 см по поверхности КПК и вновь устанавливали в неё.
Способы пункции КПК при укладке ТД в положение «на спине» являются оригинальной разработкой и описаны в главе 3.2 «Новые хирургические способы установки троакаров в крыло подвздошной кости для сбора костного мозга при укладке трупного донора в положение «на спине».
Сбор КМ проводили методами простой аспирации и аспирации-промывания [14]. При простой аспирации сбор КМ осуществляли путём создания и поддержания в накопительной емкости разрежение, при аспирации-промывании – эксфузию биоматериала дополняли перфузией в кость изотоничного 0,9% раствора NaCl из экстракорпорального источника.
В случае аспирации КМ шприцем его перед сбором каждой порции биоматериала обрабатывали раствором гепарина - 5000 Ед. в 50 мл 0,9% раствора NaCl. Шприц подключали к контактной части троакара, а затем вытягиванием поршня обеспечивали сбор биоматериала. При заполнении шприца его заменяли новым или опорожняли в накопительную емкость и повторно использовали. При этом фиксировали объем каждой порции биоматериала.
При автоматизированной миелоаспирации использовали системы, обеспечивающие объединение 2 троакаров (в одной кости), или новую одноразовую многоканальной закрытой системы (ОМЗС), позволявшей соединить в накопительный контур 4 троакара. Для аспирации биоматериала разрежение в накопительной емкости создавали и поддерживали с помощью хирургического электрического отсоса. Для подачи рабочего раствора (при аспирации-промывании) емкость, содержащую его, устанавливали выше уровня донора на 50-70 см или подключали к ОМЗС через волюметрический насос (при испытании новой системы). Порядок работы с ОМЗС при сборе КМ методами аспирации, аспирации-промывания и их комбинированием подробно описан в разделе «3.3.1 Автоматизированный сбор костного мозга комбинированием простой аспирации и аспирации-промывания с использованием новой одноразовой многоканальной закрытой системы». Для предотвращения коагуляции КМ стабилизировали раствором гепарина – 5000 Ед. на 400 мл биоматериала.
В зависимости от цели эксперимента от одного ТД получали 2 или 4 образца КМ. Всего исследовано 119 образцов КМ. Для оценки эффективности сбора КМ использовали стандартные и дополнительные критерии.
Объем образца. Стандартный критерий оценки миелоаспирата. В случае аспирации КМ шприцем количество биоматериала вычисляли суммированием объема каждой порции. При автоматизированном сборе оценку проводили прямым или непрямым измерением с сохранением стерильности биоматериала. Прямое измерение выполняли при количестве материала менее 100 мл - КМ помещали в стерильную градуированную ёмкость. По уровню биоматериала определяли его количество. Непрямое измерение выполняли при количестве биоматериала более 100 мл. Исследование подразумевало вычисление объема по разнице веса пустой и заполненной накопительной ёмкости. Разницу в граммах принимали за объем. Результат исследования выражали в миллилитрах.
Концентрация и общее количество ядросодержащих клеток. Стандартные критерии оценки миелоаспирата. Концентрацию ядросодержащих клеток оценивали с помощью стандартного гематологического анализатора в автоматическом режиме. Для исследования биоматериал собирали в пробирки с антикоагулянтом K3EDTA. Результат выражали в количестве клеток на единицу объема (х10/л).
Общее количество ядросодержащих клеток рассчитывали умножением показателя концентрации ядросодержащих клеток на значение объема образца. Результат выражали в абсолютном значении (х109).
Доля жизнеспособных клеток. Стандартный критерий оценки миелоаспирата. В настоящее время для оперативной оценки жизнеспособности клетки используют критерии отражающие степень проницаемости цитоплазматической и ядерной мембран. Для этого используют красители, не способные проникать через неповрежденные мембраны [31]. В миелоаспирате подсчёт доли жизнеспособных клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием ДНК-специфического красителя 7 амино-актиномицина D (7-AAD) (Рисунок 2.2) при оценке концентрации клеток с фенотипом CD45l0WCD34+ (ГСК, см. далее) [43].
Концентрация и общее количество прогениторных клеток. Дополнительные критерии оценки миелоаспирата. Для определения количества прогениторных клеток, доли среди них жизнеспособных клеток КМ собирали в пробирки с антикоагулянтом K3EDTA, а культуру клеток помешали в «сухие» пробирки. После пробоподготовки прогениторные клетки идентифицировали с помощью проточного цитометра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter) по фиксации на цитоплазматической мембране специфических моноклональных антител, меченных флюорохромами. Для исключения искажения результатов неспецифическим связыванием клетками красителя анализ образца проводили с формированием индивидуального «отрицательного контроля» (Рисунок 2.2) [44].
Комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием
Получение КМ методами, основанными на аспирации, наиболее распространено в клинической практике. Сбор клеток осуществляется за счет вымывания их из губчатого вещества средой, протекающей через кость. У здоровых доноров этому способствует давление в кровеносном русле. Однако у ТД с небьющимся сердцем основной силой, обеспечивающей аспирацию, является вакуум, создаваемый в накопительной емкости. При использовании закрытых систем рекомендованная величина разрежения составляет 0,4 Атм (300 мм рт. ст., стандартный режим). Однако в некоторых случаях его применение не позволяет провести эффективный сбор биоматериала. Наиболее вероятно, что это обусловлено изменением реологических свойств крови, наступающих при биологической смерти. В этой ситуации для преодоления сопротивления поступлению крови в кость логичным представляется использование при сборе разрежения больше, чем рекомендовано.
С целью оценить влияние на эффективность сбора КМ использования при аспирации повышенного до 0,6-0,7 Атм разрежения провели исследование на 12 ТД с небьющимся сердцем. Донора укладывали в положение «на животе». Затем ему в «задние отделы» каждого КПК устанавливали по две костные иглы. Троакары, установленные в одну кость, объединяли в самостоятельный накопительный контур с помощью отдельной герметичной системы. К каждой системе подключали индивидуальную накопительную емкость, соединённую с хирургическим электрическим отсосом. Сбор костного мозга из одного КПК проводили, используя стандартный режим 0,4-0,5 Атм, а из второго КПК повышенное до 0,6-0,7 Атм разрежение. Автоматизированную миелоаспирацию проводили параллельно из обеих костей в течение 30 минут. В полученном биоматериале определяли объем, концентрации ядросодержащих клеток и ГСК, долю жизнеспособных клеток (Таблица 3.1). m – доверительный интервал Обработка результатов исследования показала, что больший объем был характерен для образцов, полученных с применением повышенного разрежения -176±34 мл. Используя стандартное разрежение, в среднем заготавливали 128±30 мл биоматериала. Несмотря на то, что различие не достоверно, аналогичную тенденцию отмечали во всех опытах. При этом по концентрации ядросодержащих клеток образцы, полученные при разных режимах, значительно не различались между собой: 0,4-0,5 Атм – 34,1±6,1 х109/л; 0,6-0,7 Атм – 36,8±3,9 х109/л.
В итоге, общее получаемое из одного КПК количество ядросодержащих клеток при применении разрежения 0,6-0,7 Атм составляло 5,2±0,7 х109, что на 65,6% достоверно больше чем при использовании режима 0,4-0,5 Атм (3,2 ±0,5 х109) (Рисунок 3.1).
Схожее взаимоотношение отмечено между показателями объема образца и общего количества получаемых ГСК. В КМ, собранном при увеличенном разрежении, концентрация CD45lowCD34+ была несколько выше (572±73 х106/л), чем в заготовленном при 0,4-0,5 Атм (477±77 х106/л). В итоге из-за большего объема образцов, полученных при использовании режима 0,6-0,7 Атм, общее количество прогениторных клеток в них на 87% было достоверно больше, чем при применении стандартного режима (88,2±13,2 х106 и 47,1±8,6 х106, соответственно). Важно отметить, что аналогичное соотношение показателей клеточности между аспиратами, полученными от одного донора при разных значениях разрежения, отмечали в каждом отдельном эксперименте. При этом доли жизнеспособных клеток в образцах, заготовленных с применением стандартного и увеличенного режимов, значительно не различались между собой: 0,4-0,5 Атм - 85,9±1,6 %; 0,6-0,7 Атм - 84,6±1,9 % (Рисунок 3.2).
Таким образом, использование увеличенного до 0,6-0,7 Атм разрежения, позволяло достоверно увеличить эффективность миелоаспирации, которое выражалось в получении на 65,6% больше ядросодержащих клеток и на 87% больше ГСК, чем при стандартном режиме. При этом режим увеличенного разрежения не оказывал отрицательного влияния на качество получаемого биоматериала.
Исходя из полученных данных, с целью изучить возможность развития выявленной тенденции провели дополнительное исследование с применением ещё более увеличенного разрежения (0,9 Атм). В исследовании задействовали 6 ТД с небьющимся сердцем. Донора укладывали в положение «на животе». Затем ему в «задние задние» каждого КПК устанавливали по две костные иглы. Троакары, установленные в одну кость, объединяли закрытой системой с накопительной емкостью, подключенной к хирургическому электрическому отсосу. Из одной кости сбор проводили, используя разрежение 0,6-0,7 Атм, из другой - 0,9 Атм. Автоматизированную миелоаспирацию выполняли параллельно из обеих КПК в течение 30 минут. В полученном биоматериале определяли объем, концентрации ядросодержащих клеток и ГСК, долю жизнеспособных клеток (Таблица 3.2).
Сравнительная характеристика культуральных свойств прилипающих к пластику клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем
В настоящее время для автоматизированного сбора КМ в некоторых практических руководствах рекомендовано использовать аппарат взятия и трансплантации костного мозга (АВИТ-1). Однако его конструктивные особенности не раскрывают в полной мере потенциал автоматизации основных процессов, обеспечивающих миелоаспирацию. В частности, система, устанавливаемая в устройство, позволяет проводить заготовку биоматериала только методом аспирации-промывания через один двухпросветный троакар, что требует выполнения многочисленных пункций кости. В результате хирург остается постоянно задействованным в процессе миелоаспирации и не может приступать к заготовке органов или других тканей до её окончания. Кроме того, использование двухпросветного троакара, совмещающего каналы для отвода биоматериала и нагнетания рабочего раствора, приводит к получению в значительной степени разведенного КМ. Установка в одну кость нескольких однопросветных троакаров дает возможность одновременно задействовать весь её объем при сборе.
С учетом недостатков прототипов и результатов изучения способов увеличения эффективности заготовки КМ от ТД с небьющимся сердцем сформулировали следующие требования к системе для автоматизированной миелоаспирации: Универсальность - возможность использовать для сбора КМ методы простой аспирации и аспирации-промывания. Многоканальность - объединение в один накопительный контур нескольких троакаров и обеспечение возможности параллельного сбора КМ из нескольких точек пункции. Герметичность - исключение контакта биоматериала с окружающей средой, в том числе при использовании для аспирации повышенного разрежения и переходе от одного метода сбора к другому. Совместимость со стандартной хирургической аппаратурой, способной автоматизировать процессы аспирации и перфузии рабочего раствора.
Исходя из актуальных требований к изделиям медицинского назначения и системе для автоматизированного сбора КМ разработали одноразовую многоканальную закрытую (герметичную) систему (ОМЗС, Рис. 3.16). Для унифицирования ее производства в конструкции использовали стандартные компоненты, применяемые в изготовлении медицинских изделий для практического здравоохранения:
Узлы разного назначения - сертифицированные пластиковые приспособления: Y-образные тройники, коннекторы Luer-Lock male и female, клипсы, инъекционные порты.
Объединяющие каналы - трубки из ПВХ, сертифицированного для применения в изделиях медицинского назначения. Внешний диаметр каналов обеспечивал их плотное соединение с узлами, а толщина стенки - сохранение проходимости системы при создании в ней разрежения до 1,0 Атм (Рисунок 3.16).
Места соединения компонентов системы дополнительно герметизировали. Соединенные в определённой последовательности узлы и каналы образовывали функциональные блоки: Блок подключения к троакарам (2 штуки, Рис. 3.17, А) – предназначен для соединения накопительного контура с костными иглами. Для одновременного сбора КМ из нескольких точек в каждый блок включали по 2 узла соединения с троакарами - порты «Luer-Lock male» (Рисунок 3.17, а.1). К каждому узлу присоединяли по отдельному «троакарному» каналу (Рисунок 3.17, а.2), ко второму концу которого, фиксировали отдельный Y-образным тройник (Рисунок 3.17, а.3). Затем Y-образные тройники одного блока объединяли между собой «соединительным» каналом (Рисунок 3.17, а.4). В зависимости от того какой из Y-образных тройников в каждом блоке в последующем будет ближе к накопительной ёмкости, один из них условно принимали за «ближний», другой за «дальний». При этом на всех каналах устанавливали по узлу для регулирования тока раствора - пластиковую клипсу (Рисунок 3.17, а.5).
Блок «отвода аспирата» (Рисунок 3.17, В) - предназначен для соединения блоков подключения к троакарам с модулем аспирации-накопления. Он начинался двумя параллельными каналами (Рисунок 3.17, b.1), идущими от «ближних» Y-образных тройников обоих блоков подключения к троакарам. При этом для введения препаратов и отбора проб, в каждый канал интегрировали по одному инъекционному порту (Рисунок 3.17, Ь.2). Каналы объединяли Y-образным тройником (Рисунок 3.16, Ь.3), к которому подсоединяли канал (Рисунок 3.17, Ь.4) соединённой с узлом для подключения ОМЗС к накопительной ёмкости - портом «Luer-Lock male» (Рисунок 3.17, b.5). При этом на всех каналах устанавливали по узлу для регулирования тока раствора - пластиковую клипсу (Рисунок 3.17, Ь.6).
Блок «подачи рабочего раствора» (Рисунок 3.17, С) - предназначен для соединения блоков подключения к троакарам с модулем перфузии. Блок начинался параллельными каналами (Рисунок 3.17, с.1), идущими от «дальних» Y-образных тройников каждого блока «подключения к троакарам». Каналы объединялись Y-образным тройником (Рисунок 3.17, с.2). К тройнику подключали канал (Рисунок 3.17, с.З) соединённый с узлом для подключения ОМЗС к системе для инфузии -портом «Luer-Lock female» (Рисунок 3.17, с.4). При этом на всех каналах устанавливали по узлу для регулирования тока раствора - пластиковую клипсу (Рисунок 3.17, с.5).
Схема новой одноразовой многоканальной закрытой система для автоматизированного сбора костного мозга В итоге конструктивные особенности ОМЗС подразумевают проведение автоматизированного сбора КМ методами простой аспирации, аспирации-промывания и их комбинированием с сохранением стерильности биоматериала. Результат достигается за счёт своеобразного объединения в один накопительный контур нескольких однопросветных троакаров, которое дает возможность проводить эксфузию КМ одновременно из разных точек пункции кости и параллельно нагнетать в неё рабочий раствор. При этом компоненты ОМЗС сохраняют герметичность накопительного контура в случае использования для аспирации повышенного разрежения или переходе от одного метода сбора к другому, что обеспечивает стерильность биоматериала, а также безопасность задействованного медицинского персонала.
Внедрение в систему специальных портов для соединения её со стандартным хирургическим электроотсосом и волюметрическим насосом позволяет автоматизировать процессы аспирации КМ и перфузии рабочего раствора. При этом интеграция в блок отвода биоматериала специальных инъекционных портов обеспечивает возможность в процессе получения биоматериала выполнять отбор проб или введение фармакологических препаратов, с сохранением стерильности. Это позволяет контролировать и, при необходимости, влиять на качество миелоаспирата.