Введение к работе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.
Научные направления, раскрывающие проблему лечения перитонита, характеризуются попытками расшифровать суть интоксикационного синдрома на уровне продуктов жизнедеятельности микробов, вторичные механизмы каскадных патофизиологических реакций и на этой основе предложить интенсивные методы лечения (Владыка А.С. с соавт.,1987, Utili, ).
Известно, что массивная антибиотикотерапия, проводимая при разлитых формах перитонита, может создавать состояние неуправляемой эндотоксемии (Кригер А.Г..Чугунов А.О.,1987, Wilkinson,1977) как в результате массовой гибели микробных тел, так и по причине резкой активизации микробной флоры в просвете желудочно-кишечного тракта (Caroll,Platteborse,1958,Elin, 1ГоШ,1976).
Эндотоксины грамотрицательной микрофлоры легко проникают в кровь и лимфу, сецернируют с тканевой жидкостью через стенки паралитической кишечной трубки в свободную брюшную полость и обратно (Hecht et al.,1975,Jacob et al.,1977), резко повышают концентрацию бактериальных липополисахаридов в системе воротной вены (Drives et al.,1976,Utlli,Abeniathy,1977) , создают синдром тотальной эндотоксемии. Очень важным обстоятельством при интоксикационном синдроме является значительное накопление эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры в тканевых структурах и ликворной системе головного мозга (Berman et al.,1976,Severin,1972). Длительность циркуляции и опсонизации токсинами мозга является решающим в выживании пациентов (Бобкова Е.Д., Шалыгина Н.Б.,1988).
Значительные успехи в области аффинной хроматографии и химии полимеров позволили разработать ряд тонких технологий получения композиционных сорбционных материалов для извлечения из растворов и биологических жидкостей строго целевых продуктов (Кулаев Д.В. с соавт.,1989, Лопаткин Н. А., Лопухин Ю.М.Л989, Gendtrlch, Holleimn,1985). С этих позиций практический интерес представляют разработки аффинных сорбентов для извлечения бактериальных экзо- и эндотоксинов (Мороз А.Ф. с соавт.,1988, Джавец Э. с соавт.,1982) из крови (Hanasawa et al.,1983), плазмы (Endo et al,1955, Надавала et al.,1988), ликвора, инфицированной брюшной полости (Беляков Н.А. с соавт.,1988) , просвета желудочно-кишечного тракта (Allan et al.,1984, Itoi et al.,1985).
Сложности успешного извлечения бактериальных токсинов из
биологических жидкостей человека заключаются в их макромолекулярной структуре, гидрофобных взаимодействиях с практически любыми клетками и тканями с высокой константной связывания. Классические методы санации крови, брюшной полости и просвета кишки при разлитом перитоните далеко не обеспечивают связывание бактериальных продуктов и направлены в целом на элиминацию низкомолекулярных веществ (Лопухин СМ., Молоденков М.Н.,1985 Филшщев П.Я., Кирхыан В.В.,1987). Высокая молекулярная масса бактериальных комплексов создает сложности при их извлечении уже известными углеродсодержащими, ионообменными и другими сорбентами. Структура макропористых углей, применяемых в гемосорбции , не позве чет полноценно абсорбировать крупные молекулы. Поэтому механизм шлечения основывается на физической адсорбции. Увеличение диаметра ор углей приводит к падению емкости по целевым продуктам, так как пористая структура начинает выполнять роль транспортных каналов. В этой связи особую практическую значимость приобретают комплементарные межмолекулярные взаимодействия. Таким образом, стало очевидным получение, испытание и внедрение в эфферентную хирургию высокоаффинных к бактериальным токсинам сорбентов.
Высокая летальность пациентов с разлитым перитонитом, обусловленная печеночной и мозговой комами, создает проблему разработки методов глубокой детоксикации органов. Сложность хирургических манипуляций, связанных с защитой головного мозга и печени при высокой эндотоксемии, очисткой ликвора, регионарной гемосорбцией головы, может быть оправдана с трех позиций: безнадежностью пациентов (Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н.,1978, Berk,1980,Schenker et al.,1974, Sato et al.,1983), высоким уровнем извлечения токсинов и известными фактами ретроградной динамики нарушений функций мозга, печени и почек в случае выздоровления (KarvountziB et al.,1974). Следовательно, изолированная гемосорбция при перитоните может занять достойное место в научной программе детоксикации головного мозга.
Установлено, что важное место в интоксикационном синдроме при разлитом перитоните занимает интестинальная фаза (Кригер А.Г., Чугунов А.О.,1987, Hecht et el., 1975). Массивное освобождение в просвете желудочно-кишечного тракта бактериальных продуктов распада приводит к паралитической кишечной непроходимости (Беляков Н.А.,1991, Белов В.А.,Шестопалов А.Е.,1985). В этой связи разгрузка кишечной трубки от содержимого (назо-интестинальная интубация) создает положительный эффект лечения(Кригер А.Г., Мельник И.П. ,1987, Попов В.А.,1985, Шуркалин Б.К. с соавт.,1987). Совершенно очевидно, что разработка и применение в такой ситуации ентеросорбцИонных материалов направлены на
улучшение конечных результатов дренирования. Существующие метода энтеросорбции при перитоните только начинают внедряться в клиническую " практику в связи с получением перспективных сорбционных материалов (Беляков Н.А.,1991, Зеысков B.C. с соавт.,1987, Павлов Ф.А. с соавт.,1988, Терновой К.С. с соавт., 1985). Особое место в разработке должны занимать нетоксичные природные полимеры, обладающие высоким сродством к бактериальным токсинам.
Хирургические методы санации инфицированной брюшной полости занимают первостепенное место. Практического разрешения требуют вопросы эффективного перитонеального лаважа.. В этой связи разработка гелевых ( жидких ) сорбционных материалов, обладающих высокой текучестью, прочным связыванием с бактериальными токсинами как в экссудате, так и на поверхности брюшинного покрова, представляется весьма важной проблемой. От ее решения во многом зависит эффективность классического лаважа брюшной полости. Экспериментального обоснования и внедрения результатов в клинику требуют комбинированные методы лечения, представляющие суть одновременной детоксикации крови, желудочно-кишечного тракта и свободной брюшной полости. Цель таких манипуляций - получение эффекта глубокой детоксикации.
В связи с широким внедрением эфферентных методов терапии в хирургию перитонита установлены факты иммунокоррекции при контакте крови или плазмы с поверхностью гранул сорбентов (Лопухин D.U. с соавт.,1986, Кашшн Н.Н. с соавт.,1980, Berger, В1влаеп,1981). В ряде случаев гемосорбция может создавать эффекты иммуносупрессии или стимуляции (Исхакова Х.И., Глеизер Л.С,1984, Хегулевцева А.П. с соавт.,1984, Пашутнн с соавт., 1984). Необходимость расшифровки иммунологических эффектов сорбции очевидна, так как связана с функцией рецепторов клеток, взаимоотношением рецепторов и бактериальных токсинов, возможностями делигандизации поверхности иммунокомпетентных клеток.
Связывание токсинов в просвете желудочно-кишечного тракта и в брюшной полости, их элиминация предполагают снижение .бактериальной опсонизации в крови и лимфе клеток иммунной системы и сохранение , таким образом, функций рецепторного аппарата. В этой связи первостепенное значение приобретают разработки методов точного контроля бактериальных токсинов, функций рецепторов иммунокомпетентных клеток.
Проблема эфферентных методов иммунокоррекции при перитоните органично связана с возможностями афферентной иммунореанимации. Возможности разработки фармакологической иммунокоррекции при перитоните были значительно расширены в связи с получением в первой
половине 70-х годов и широким внедрением препаратов, возмещающих утраченные функции тимуса и костного мозга. Было установлено, что препараты вилочковой железы (Тактивин) способны осуществлять не только иммунологический (Арион В.Я. ,1989, Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я. ,1979, Levai, Utermohlen,1983) , но и биохимический надзор (Арион В.Я.,1989,1990, Ефремова О.И. с соавт.,1982, Скрипник А.Ю. с соавт.,1984). При ряде онкологических, аутоиммунных, вирусных заболеваний полипептидные продукты тимуса оказывают иммуномодулирующий эффект (Арион В.Я.,1989,1990) и должны использоваться в зависимости от функционального поражения тимуса (Арион В.Я.,1990, Агіоп, 1989). В то же время, известно, что благодаря полипептидной природе биорегуляторных молекул, вырабатываемых вилочковой железой, возможна их быстрая деградация в системе циркуляции. Поэтому представляется важной разработка путей и доз введения препаратов, точек приложения их в иммунной системе, внедрение результатов исследований в клиническую практику лечения перитонитов.
цель настоящей работы: Разработать методы экстракорпоральной и корпоральной детоксикации и иммунокоррекции крови при разлитом перитоните с помощью аффинных к бактериальным токсинам сорбентов на твердых и жидких матрицах. Внедрить результаты исследований в клиническую практику. Разработать вариант интенсивной иммунокоррекции с помощью Тактивина и внедрить его в клиническую практику.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:
1. Выбрать технологию химического синтеза противомикробных
антитоксических сорбентов на основе кремнеземных матриц для
плазма-гемосорбции и провести экспериментальные испытания их
эффективности.
-
Разработать технологию химического синтеза и способ применения противомикробных сорбентов на жидких матрицах, пригодных для лаважа инфицированной брюшной полости.
-
Выбрать технологию химического синтеза и провести испытания противомикробных сорбентов на основе твердых и гелевых форм хитозана с целью энтеросорбции. Внедрить результаты исследований в клиническую практику лечения перитонита.
-
Разработать способ моделирования разлитого острого перитонита у крыс.
5. Разработать экспериментальные способы иммунологического
контроля эффективности эфферентных методов лечения разлитого
перитонита.
-
Разработать способ твердофазного иммунофэрментного анализа бактериального липополисахарида (ЛПС) грамотрицательной микрофлоры.
-
Изучить кинетику ЛПО при разлитом перитоните и определить эффективность детоксикации крови сорбентами на твердых и кидких основах.
-
Разработать модель изолированной гемосорбции головного мозга у крыс и определить принципиальную возможность его эффективной детоксикации с помощью аффинных сорбентов.
-
Определить возможность экстракорпоральной сорбционной коррекции фенотипа клеточной поверхности лимфоцитов человека в условиях эндотоксвмии.
-
Определить возможность корпоральной сорбционной коррекции фенотипа клеток белой крови в условиях разлитого перитонита.
-
Определить иммунокорригирупцие возможности препарата тимуса Тактивина при его эндолимфатической инфузии и эффективность в условиях высокой эндотоксвмии при перитоните у человека.
-
Передать технологию химического синтеза противомикробных сорбентов на основе сшитых декстранов в опытное производство и внедрить в клиническую практику с целью перитонеалыюго лаважа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Определена технология химического синтеза противомикробных
сорбентов на основе силохрома и силикагеля и установлена высокая
эффективность извлечения ими микробных токсинов из цельной крови,
плазмы и поверхности клеток.
2. Доказана принципиальная возможность эффективной детоксикации
головного мозга при высокой степени эндотоксвмии с помощью аффинных
сорбентов.
3. Установлено, что нарушения экспрессии рецепторов на
иммунокомпетентных клетках любой локализации при перитошіте связаны с
опсоїшзацией микробными токсинами клеточной мембраны.
4. Определена технология синтеза и эффективность жидких сорбентов
на полисахаридных основах, повышающих качество перитонеального лаважа.
Б. Доказана необходимость комбинированного применения энтеросорбции и перитонеального лаважа при разлитом перитоните.
6. Разработан вариант иммунореанимации при перитоните, основанный на эндолимфатических инфузиях Тактивина и доказана необходимость его применения в любой стадии развития заболевания.
Научная новизна. Впервые синтезированы аффинные сорбенты на основе кремнезешшх матриц, эффективно извлекающие бактериальные эндотоксины
грамотрицательной микрофлоры при гемо-плазмасорСции.
В результате детоксикации плазмы такими сорбентами обнаружено полное сохранение функции ряда рецепторов на лимфоцитах человека и животных. При контакте клеток иммунной системы с аффинными противомикробными сорбентами обнаружен дифференцированный эффект делигандизации клеточной поверхности; высокая эффективность цитосорбции лимфоцитов и низкая - нейтрофилов.
Впервые синтезированы жидкие аффинные к бактериальным токсинам сорбенты с комбинированным действием, повышающие качество классического перитонеального лаважа при разлитом перитоните.
Впервые определена ценность использования в качестве энтеросорбентов при перитоните гелевых форм хитозана.
Впервые показана принципиальная возможность эффективного снижения концентрации бактериального эндотоксина в крови головного мозга при его изолированной гемосорбции иммуно-аффинными сорбентами в условиях высокой эндотоксемии.
Впервые предложены иммунологические методы контроля у крыс, основанные на определении фенотипа клеточной поверхности и получении монослоя клеток.
Впервые предложена удовлетворительная модель разлитого перитонита у крыс, позволяющая осуществлять иммунологический и бактериальный мониторинг.
На основании экспериментальной разработки путей, времени и доз введения препарата вилочковой железы Тактивина определена высокая эффективность его эндолимфатических инфузий в комплексной терапии разлитого перитонита, возможности иммунокоррекции и перспективы использования.
Практическая ценность работы и внедрение результатов
исследования.
-
Разработана модель бактериальной эндотоксемии у крыс (авторское свидетельство СССР Jt 1424582).
-
Разработан способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований (авторское свидетельство СССР J» 1756822).
-
Разработаны способы выявления розеткообразупцих клеток крыс ( авторское свидетельство СССР X 1501723, положительные решения на изобретения JW 4117625/28-14, 4139052/28-14, 4125801/28-14, 4118860/28-14, 4131452/28-14, 4122448/28-14 ).
-
Разработан и запатентован способ получения аффинных сорбентов
на основе сшитых декстранов для лаважа инфщированной брюшной полости ( патент РФ * Гос. регистрации 5032101 ).
-
Разработан и запатентован способ сорбционной корпоральной детоксикации (патент РФ № Гос. регистрации 5032220 ).
-
Технология получения противомикробных сорбентов на основе сшитых декстранов внедрена в опытное производство в 1992 году на Одном предприятии г. Москвы.
-
Гелевая форма крабового хитозана в качестве энтеросорбента внедрена в хирургической клинике и кафедре факультетской хирургии им.С.И.Спасокукоцкого РГМУ им.Н.И.Пирогова (г. Москва).
Апробация работы. Результаты исследования доложены на I Всесоюзном иммунологическом съезде в г. Сочи (1989), Всероссийской конференции " Эфферентные методы в медицине" в г. Анапа (1992). Апробация основных положений диссертации проведена на объединенных конференциях НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР (1990, 1991, 1992), Российского государственного медицинского университета им.Н.И.Пирогова (1990), НИИ Уха, Горла, Носа МЗ РСФСР (1991).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 22 работах ( все - в центральной печати). Данная работа выполнялась по заданию ГКНТ (0.69.07).
Совместные работы проводились с сотрудниками лабораторий синтеза и испытания сорбентов, экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации, прикладной иммунохимиии, молекулярной иммунологии, биохимии и автоанализа, цитологии НИИ ФХМ МЗ РФ, ряда лабораторий и хирургических кафедр РГМУ им.Н.И.Пирогова, Красноярского государственного медицинского института, НИИ биофизики РАН (Красноярск), НИИ вакцин и сывороток им.Г.Н.Габричевского, НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, НИИ вакцин и сывороток им.Н.Ф.Гамалеи, НИИ питания РАН (Москва).