Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль лабораторных биомаркеров при трансплантированного сердца (обзор литературы)
1.1. Клинические результаты трансплантации сердца
1.2. Биомаркеры, участвующие в патогенезе повреждения трансплантата и отторжении трансплантированного сердца
1.2.1. Патофизиологическое и клиническое значение растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L) при трансплантации сердца
1.2.2. Биологическая роль биомаркеров неоангиогенеза (PDGF-BB, VEGF-A) у реципиентов сердца
1.2.3. Диагностическое значение биомаркера ремоделирования миокарда - стимулирующего фактора роста (ST2) у реципиентов сердца
1.3. Мультимаркерный подход к диагностике отторжения трансплантированного сердца
1.4. Заключение
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Характеристика пациентов, включенных в исследование
2.2. Методы обследования пациентов
2.3. Методы измерения концентрации биомаркеров
2.3.1. Мультиплексный анализ концентрации sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A
2.3.2. Измерение концентрации ST2
2.4. Определение диагностической значимости лабораторных тестов
2.5. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3. Анализ связи уровней sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A и ST2 в плазме крови с клиническими и лабораторными данными реципиентов сердца
3.1. Определение связи уровней биомаркеров в плазме крови с демографическими и клиническими данными реципиентов сердца
3.2. Изучение связи уровня биомаркеров в плазме крови с лабораторными данными реципиентов сердца
Глава 4. Исследование связи уровней sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A и ST2 с наличием и выраженностью гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантированного сердца
4.1. Изучение связи уровней биомаркеров с наличием и выраженностью гистологических и иммуногистохимических признаков отторжения пересаженного сердца
4.2. Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантированного сердца в ранние и отдаленные сроки после трансплантации
Глава 5. Оценка диагностической значимости биомаркеров при остром отторжении трансплантированного сердца в отдаленные сроки после трансплантации
5.1. Анализ диагностической значимости sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 при остром отторжении
5.2. Сравнительная оценка диагностической значимости комплексных тестов, включающих сочетания биомаркеров
5.3. Анализ диагностической значимости ST2 и его сочетаний с биомаркерами при остром клеточном отторжении трансплантированного сердца
5.4. Примеры индивидуальных различий в содержании ST2 92 и PDGF-BB у реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации
Обсуждение 98
Выводы 108
Практические рекомендации 110
Список сокращений 111
Список литературы
- Биологическая роль биомаркеров неоангиогенеза (PDGF-BB, VEGF-A) у реципиентов сердца
- Мультиплексный анализ концентрации sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A
- Изучение связи уровня биомаркеров в плазме крови с лабораторными данными реципиентов сердца
- Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантированного сердца в ранние и отдаленные сроки после трансплантации
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В настоящее время, несмотря на эффективность современной медикаментозной
терапии, а также методов реваскуляризации и ресинхронизации миокарда,
заболеваемость хронической сердечной недостаточностью (ХСН) остается высокой
и среди населения РФ, и во всём мире. Согласно данным крупных
эпидемиологических исследований ЭПОХА-ХСН и ЭПОХА-О-ХСН
распространенность терминальной ХСН в РФ составляет 2,1% взрослого населения (2,4 млн. человек). Смертность в течение первого года у пациентов с терминальной ХСН составляет 12%, даже при условии их лечения в специализированном стационаре [Мареев В.Ю. и соавт., 2013].
Ортотопическая трансплантация сердца (ТС) в настоящее время является единственным эффективным и радикальным методом лечения терминальной стадии ХСН [Hullin R., 2014]. В последние годы не только многократно увеличилось число трансплантаций, выполняемых в нашей стране, но и улучшились показатели качества и продолжительности жизни реципиентов сердца [Готье С.В. и соавт., 2015].
Одним из наиболее грозных осложнений как в ранние, так и в отдаленные сроки после трансплантации, остается острое клеточное и гуморальное (антителоопосредованное) отторжение [Готье С.В. и соавт., 2014, 2015; Yusen R.D. et al., 2015]. Диагностика указанных осложнений осуществляется по результатам исследований эндомиокардиальных биоптатов.
В последнее десятилетие активно ведется поиск неинвазивных
(малоинвазивных) методов исследования для ранней доклинической диагностики, персонификации лечения осложнений у реципиентов сердца [Шевченко А.О. и соавт., 2015, Crespo-Leiro M.G. et al., 2015; Wang T.G. et al., 2011]. Измерение концентрации в крови ряда специфических молекул – биомаркеров, может быть полезным для понимания патогенетических основ процессов, происходящих в организме реципиента.
В числе первых обнаруженных биомаркеров, концентрация которых в плазме крови предположительно связана с выраженностью морфологических признаков
4 острого отторжения трансплантата, был неоптерин – индикатор активации
макрофагов [Шевченко О.П. и соавт., 2009]. В последующих исследованиях
рассматривалась роль таких биомаркеров, как NT-proBNP (мозговой
натрийуретический пептид), тропонинов, маркеров неоангиогенеза (плацентарный
фактор роста-1, PlGF-1), костимуляции Т-клеток - растворимая форма лиганда CD40
(sCD40L) и др. в развитии отторжения трансплантированного сердца [Lupn J. et al.,
2013; Battes L.C. et al., 2015].
Несмотря на определенные успехи в этой области, целесообразность
использования биомаркеров по отдельности или в составе комплексных тестов для
диагностики посттрансплантационных осложнений у реципиентов сердца
не доказана; необходимы исследования их диагностической эффективности.
Цель исследования
Определить диагностическую значимость биомаркеров неоангиогенеза, костимуляции Т-лимфоцитов и ремоделирования миокарда при остром отторжении трансплантированного сердца и сформировать комплексный лабораторный тест для диагностики острого отторжения сердечного трансплантата.
Задачи исследования
1. У реципиентов сердца оценить связь содержания в плазме крови
биомаркеров неоангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A), фактора
роста тромбоцитов (PDGF-ВВ); костимуляции Т-лимфоцитов - растворимой формы
лиганда CD40 (sCD40L); ремоделирования миокарда - стимулирующего фактора
роста (ST2) с клиническими, демографическими и лабораторными данными.
-
Определить связь уровней биомаркеров, определяемых в плазме крови у реципиентов сердца в день проведения эндомиокардиальной биопсии, с наличием гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантата.
-
Провести сравнительный анализ связи уровней биомаркеров с наличием гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения в ранние и отдаленные сроки после трансплантации.
4. Определить пороговую концентрацию ST2, значимую для диагностики
острого отторжения трансплантированного сердца.
5. Провести сравнительный анализ диагностического значения
комбинированных тестов, включающих, помимо ST2, sCD40L, PDGF-BB и VEGF-A,
при остром отторжении сердечного трансплантата.
Научная новизна
Впервые на основании результатов комплексного анализа концентраций
биомаркеров (sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A и ST2), потенциально значимых
в патогенезе повреждения трансплантата, охарактеризована связь уровня
исследуемых биомаркеров в плазме крови, взятой в день проведения
эндомиокардиальной биопсии, с наличием гистологических
и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантата сердца.
Новыми являются данные о связи уровня ST2 в плазме крови с наличием острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, а уровня PDGF-BB с острым антителоопосредованным отторжением.
Впервые определена диагностически значимая концентрация ST2 (19,7 нг/мл)
при остром (клеточном и антителоопосредованном) отторжении
трансплантированного сердца в отдаленные сроки после трансплантации.
На основании сравнительного анализа диагностического значения сочетаний биомаркеров сформирован комплексный тест (ST2+PDGF-BB), позволяющий выявлять пациентов с повышенным риском (в 4,6 раза) наличия острого отторжения пересаженного сердца в отдаленные сроки после трансплантации.
Теоретическая и практическая значимость
Выявленная связь содержания стимулирующего фактора (ST2)
и тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) в плазме крови реципиентов сердца с наличием гистологических и/или иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантата указывает на патогенетическую роль указанных биомаркеров в развитии посттрансплантационных осложнений.
Важным для практического использования являются рассчитанное диагностически значимое в отношении острого отторжения трансплантированного
6 сердца в отдаленные сроки после трансплантации пороговое значение концентрации
ST2.
Измерение уровней ST2 и PDGF-BB может быть использовано в качестве
малоинвазивного лабораторного индикатора для выявления реципиентов сердца
с острым отторжением в отдаленные сроки после трансплантации.
Методология и методы исследования
В исследовании представлен сравнительный анализ концентраций
биомаркеров, определяемых в плазме крови реципиентов сердца, взятой в день
проведения эндомиокардиальной биопсии, в различные сроки после
трансплантации. Охарактеризована связь уровней биомаркеров с наличием и выраженностью гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения. Для определения уровней биомаркеров были использованы мультиплексная технология, сочетающая принципы проточной флюорометрии и иммуноферментного анализа, а также классический иммуноферментный анализ. Для обобщения и оценки результатов исследования применялись статистические методы.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Уровень ST2 в плазме крови достоверно различается у реципиентов сердца с наличием признаков острого клеточного отторжения и без таковых; уровень PDGF-BB достоверно различается у реципиентов с наличием признаков острого гуморального отторжения и реципиентов без таковых.
-
ST2 обладает диагностической значимостью в отношении острого отторжения трансплантированного сердца в отдаленные сроки после трансплантации.
-
PDGF-BB и sCD40L не обладают самостоятельной диагностической значимостью в отношении острого отторжения трансплантированного сердца, но их использование в составе комбинированного теста с ST2 повышает диагностическую значимость последнего. Наилучшими диагностическими характеристиками обладает комбинированный тест, включающий ST2 и PDGF-BB.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность результатов определяется объемом проведенных исследований (269 образцов плазмы крови, полученной от 201 реципиента сердца; гистологический и иммуногистохимический анализ 269 образцов биопсийного материала), использованием современных стандартизованных высокоспецифичных методов иммунохимического анализа и статистической обработки результатов.
Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России
на осуществление научных исследований и разработок на 2015-2017 гг. по теме
«Разработка биотехнологических, биомедицинских, клинических подходов
к повышению эффективности трансплантации сердца и легких».
Апробация работы состоялась 24 июля 2017 года на совместной конференции
научных и клинических подразделений ФГБУ «Национальный медицинский
исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени
академика В.И. Шумакова» Минздрава России (НМИЦ ТИО им. ак. В.И.
Шумакова), кафедры трансплантологии и искусственных органов лечебного
факультета ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский
университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет),
кафедры кардиологии факультета дополнительного профессионального образования
ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский
университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на VIII Всероссийском
съезде трансплантологов (Москва, 2016 г.), Третьем Российском национальном
конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 2017 г.),
18 Международном конгрессе Европейского общества трансплантологов (ESOT, Барселона, Испания, 2017 г.).
Внедрение в практику
Результаты исследования используются в кардиологическом отделении, в лаборатории иммунологического мониторинга НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова, в учебном процессе на кафедре трансплантологии и искусственных органов лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
8 Минздрава России (Сеченовский Университет); в лечебно-диагностическом
процессе ГБУЗ «Волгоградский областной клинический кардиологический центр» и
ГБУЗ СО «Свердловская областная клиническая больница № 1».
Личный вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в разработке концепции и постановке задач исследования; самостоятельно осуществляла сбор материала для исследования, выполнила определение концентрации биомаркеров с помощью мультиплексной технологии и классического иммуноферментного анализа. Автором самостоятельно сформирована база данных, проведены статистическая обработка, анализ и интерпретация полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 2 публикации в зарубежных изданиях, получено 2 патента РФ на изобретение.
Объем и структура работы
Биологическая роль биомаркеров неоангиогенеза (PDGF-BB, VEGF-A) у реципиентов сердца
Фактор роста тромбоцитов (Platelet-derived growth factor, PDGF), представляющий гидрофильный белок с молекулярной массой 30 кДа, состоит из двух полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидными мостиками. Было описано четыре различные PDGF-цепи: PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C и PDGF-D. Эти цепи могут формировать 5 изоформ: PDGF: -АА, -ВВ, -АВ, -СС и -DD. Все изоформы синтезируются как неактивные молекулы-предшественники, которые активируются протеолизом после клеточной секреции [80]. PDGF может синтезироваться в тромбоцитах, фибробластах, эндотелиальных клетках и клетках гладкой мускулатуры. Он оказывает сильное хемотаксическое действие на фибробласты и гладкомышечные клетки и может стимулировать образование матрикса в соединительной ткани. Существует множество доказательств его участия в процессах фиброза, атеросклероза и иммунологических процессах после трансплантации солидных органов [1, 86, 142].
PDGF взаимодействует с двумя типами специфических трансмембранных тирозинкиназных рецепторов (PDGFR) – и . А-, В- и С- цепи PDGF связываются с -рецептором, а В- и D-цепи – с -рецептором. После того, как PDGF связывается с рецептором, комплекс рецептор-лиганд активирует различные белки (например, протеинкиназу C) и некоторые факторы транскрипции. Оба рецептора обладают выраженным митогенным эффектом: -рецептор стимулирует хемотаксис фибробластов человека; при этом -рецептор похоже обладает ингибирующим действием. Митогенная активность зависит от изоформы и количества рецепторных субъединиц на поверхности клетки.
Sack и соавт. показали, что системы PDGF AA / BB и PDGFR / после трансплантации сердца экспрессируются в основном на эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудистой системы, слабо выражены на кардиомиоцитах и не обнаружены в интерстициальном пространстве. Они обнаружили повышенную экспрессию PDGF через одну неделю после трансплантации и значительное увеличение его продукции у реципиентов с тяжелой степенью отторжения через две недели после ТС [145].
PDGF обладает сильным хемотаксическим действием в отношении фибробластов, гладкомышечных клеток, лейкоцитов и моноцитов, поэтому он играет ключевую роль в воспалительных реакциях после трансплантации сердца. Он вызывает миграцию нейтрофилов, моноцитов и фибробластов, активацию макрофагов и фибробластов с последующим синтезом цитокинов, факторов роста и белков внеклеточного матрикса de novo и реорганизацию интерстициального коллагена, участвует в процессах репарации и заживления ран, оказывает антиапоптозный эффект на кардиомиоциты [116, 117]. Механизм секреции PDGF после трансплантации сердца недостаточно изучен, вероятно, ишемия и последующая реперфузия вызывают его продукцию эндотелиальными клетками.
Эксперименты Lemstrom K.B. и соавт. на грызунах показали, что увеличение экспрессии PDGF после трансплантации сердца приводит к повреждению сосудов трансплантата, а иммуносупрессия циклоспорином А ингибирует выработку тромбоцитарного фактора роста и подавляет развитие васкулопатии трансплантата [132].
При хроническом отторжении трансплантированного сердца PDGF активирует макрофаги и стимулирует продукцию моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 на фибробластах сердечного трансплантата [115]. В исследовании Koch A. и соавт. было показано, что экспрессия PDGF-A и -В, а также их рецепторов в эндомиокардиальных биоптатах в первую неделю после операции резко возрастает по сравнению с уровнем до операции, и остается повышенной в течение двух недель, а затем постепенно снижается [72]. Результаты исследований Tuuminen R. и соавт. на мышах показали, что передача сигналов PDGF-B может играть роль в восстановлении эндотелия и кардиомиоцитов от ишемически-реперфузионных повреждений после трансплантации сердца [122]. Фактор роста эндотелия сосудов А (VEGF-A) Белки, относящиеся к семейству факторов роста эндотелия сосудов (VEGF), представляют собой гликопротеины, играющие важную роль в неоангиогенезе и увеличивающие проницаемость сосудов. Роль VEGF в организме человека двойственна: с одной стороны, он необходим для физиологического процесса неоангиогенеза, а с другой, участвует в патологическом ангиогенезе при опухолевых заболеваниях и индуцирует активность макрофагов и эндотелия сосудов, способствуя развитию воспалительного процесса [47]. Данное семейство включает 6 факторов роста: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (PlGF).
VEGF представляет собой гомодимерный гликопротеин с молекулярной массой 46–48 кДа, содержащий 26 аминокислот. VEGF обнаружен во многих органах и биологических средах человеческого организма: в яичниках, плаценте, почках, печени и мозге эмбриона, в сыворотке и плазме крови и в синовиальной жидкости. Этот цитокин продуцируется различными типами клеток – макрофагами, фибробластами, лимфоцитами, тромбоцитами, полиморфноядерными лейкоцитами и другими клетками. Экспрессия гена VEGF жестко регулируется, главным образом, на уровне транскрипции. Основным регулятором продукции цитокина является гипоксия, она индуцирует связывание факторов транскрипции с чувствительным к гипоксии участком промотора VEGF [45]. К другим регуляторам, влияющим на транскрипцию VEGF, относят эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), фактор некроза опухоли- (TNF-), трансформирующие факторы роста (TGF-, TGF-) и провоспалительные цитокины (например, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-10 и IL-13) [66].
Обнаружено, по крайней мере, 5 вариантов VEGF-А: VEGF121, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206. Их биологическая активность сходна, но имеется отличие в количестве аминокислотных остатков и биологической доступности изоформ. VEGF-A взаимодействует с клеткой через тирозинкиназные рецепторы VEGFR-1 и VEGFR-2. Рецептор VEGFR-1 экспрессируется гемопоэтическими стволовыми клетками, моноцитами, макрофагами и клетками кровеносных и лимфатических сосудов. Рецептор VEGFR-2 вырабатывается эндотелиальными клетками сосудов. Взаимодействие с рецепторами активизирует различные сигнальные пути в эндотелиальных клетках, приводящие к увеличению сосудистой проницаемости, миграции и пролиферации клеток. На основании анализа данных in vitro и генетических исследований было показано, что хотя VEGF имеет более высокое сродство к VEGFR-1, чем для VEGFR-2 (de Vries et al., 1992), рецептор 2-го типа обычно считается основным преобразователем зависимых от VEGF ангиогенных сигналов. Взаимодействие с рецептором оказывает митогенный и хемотаксический эффекты, а также способствует увеличению продолжительности жизни в культивируемых эндотелиальных клетках [34, 96, 112, 150].
Мультиплексный анализ концентрации sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A
В работах Шевченко О.П. и соавт., основанных на длительном наблюдении за реципиентами сердца, была показана роль sCD40L, PAPP-A и PlGF как предикторов посттрансплантационных осложнений. Обнаружение антител против HLA в сочетании с высокими уровнями sCD40L, PAPP-A до трансплантации является прогностическим критерием сердечно-сосудистых осложнений после трансплантации сердца [63, 124].
В диссертационной работе Стахановой Е.А. было показано, что у реципиентов сердца с уровнями биомаркеров неоангиогенеза и воспаления (VEGF-A, PlGF-1 sCD40L), превышающими определенные пороговые значения повышен риск острого клеточного отторжения трансплантата. Наибольшей диагностической значимостью в отношении острого клеточного отторжения трансплантированного сердца обладала мультимаркерная панель, составленная из сочетаний указанных биомаркеров [21].
Среди осложнений, влияющих на выживаемость пациентов после трансплантации сердца, ведущую роль занимает отторжение трансплантата, риск развития которого наибольший в первый год после трансплантации, но также существует и в отдаленные сроки. На основании анализа опубликованных работ, посвященных патогенетическому и клиническому значению биомаркеров в развитии отторжения у реципиентов сердца, можно констатировать, что к настоящему времени обнаружен ряд цитокинов, потенциально связанных с развитием и тяжестью острого отторжения трансплантированного сердца. Характеристика таких биомаркеров и валидация диагностически значимого лабораторного теста (тестов) могут способствовать снижению частоты проводимых инвазивных манипуляций и минимизации риска их осложнений, а также формированию персонифицированного подхода к ведению пациентов. Опубликованные исследования показывают потенциальную возможность использования биомаркеров в диагностике отторжения, прогнозировании и стратификации риска осложнений у реципиентов сердца. До настоящего времени не обнаружено биомаркера, который был бы рекомендован для рутинного клинического применения у реципиентов сердца. В соответствии с многофакторностью патогенеза повреждения трансплантированного органа, в последние годы используется мультимаркерный подход, который потенциально позволяет повысить точность диагностики и определения риска развития посттрансплантационных осложнений.
В настоящее исследование включены следующие биомаркеры: sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2, предположительно участвующие в патогенезе отторжения трансплантированного сердца. В соответствии с биологическими процессами, в которых они участвуют, их можно отнести к: – биомаркерам костимуляции Т-клеток, имеющих отношение к аллоиммунной активации и воспалению (sCD40L); – факторам неоангиогенеза, производным компонентов крови и стенки сосудов (тромбоцитов, эндотелия и др.) (PDGF-BB, VEGF-A); – биомаркерам ремоделирования миокарда (ST2).
С учетом неспецифичности и многофакторности процессов, приводящих к повреждению трансплантата у реципиентов сердца, в настоящем исследовании предпринята попытка подбора комбинации (панели) биомаркеров, эффективной при диагностике и оценке риска острого отторжения трансплантата у пациентов после трансплантации сердца.
Настоящее исследование включало следующие основные этапы. Во-первых, охарактеризованы уровни биомаркеров в плазме крови пациентов с трансплантированным сердцем, их связь с демографическими, клиническими и лабораторными данными, в том числе с концентрацией такролимуса в крови; исследована связь концентраций биомаркеров, определяемых в день проведения ЭМБ, с наличием и выраженностью гистологических и иммуногистохимических признаков отторжения трансплантированного сердца. Во-вторых, проведен сравнительный анализ уровней биомаркеров в плазме крови в ранние (до 1 года) и отдаленные (более 1 года) сроки после трансплантации, оценена их связь с гистологическими и иммуногистохимическими признаками отторжения в зависимости от периода наблюдения. В-третьих, оценено диагностическое значение sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 в отношении острого (клеточного и/или антителоопосредованного) отторжения пересаженного сердца в отдаленные сроки после ТС на основании анализа ROC-кривых, расчета чувствительности и специфичности тестов, определения диагностически значимых пороговых значений концентраций; И наконец, проведен сравнительный анализ эффективности различных сочетаний тестов, включающих, помимо ST2, sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, у пациентов с острым (клеточным и/или антителоопосредованным) отторжением пересаженного сердца в отдаленные сроки после трансплантации.
Изучение связи уровня биомаркеров в плазме крови с лабораторными данными реципиентов сердца
Концентрация ST2 была достоверно выше у мужчин, страдавших ДКМП до ТС, чем у женщин со сходным диагнозом (48,9 нг/мл и 31,1 нг/мл, соответственно, р=0,01).
Концентрация VEGF-A не отличалась у мужчин и женщин c ДКМП, и составила 177,0 пг/мл и 141,6 пг/мл, соответственно (p=0,09). Хотя разница и не была достоверной, но имелась тенденция к более высокому уровню VEGF-A у мужчин c ДКМП по сравнению с женщинами. Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием АГ до трансплантации проводили у 131 реципиента сердца. АГ до трансплантации была диагностирована у 32 (15,9%) пациентов (возраст 53±10 лет), из них мужчин было 29, женщин – 3 (9,4%), среди которых 11 страдали ДКМП, 21 – ИБС. Сравнительный анализ концентрации исследуемых биомаркеров у реципиентов сердца с артериальной гипертонией в анамнезе и без таковой представлен в таблице 6.
Сравнительный анализ концентраций биомаркеров у реципиентов сердца с АГ и без таковой Биомаркеры Концентрация медиана [Интерквартильный размах] АГ Без АГ Достоверность различий (p) sCD40L, пг/мл 3,7 [2,4;42,7] 3,7 [2,4;36,1] 0,9 PDGF-BB, пг/мл 2487,7 [1448,0;3786,8] 2388,7 [1440,9; 3386,1] 0,6 VEGF-A, пг/мл 172,4 [109,7;241,2] 137,9 [91,7; 253,4] 0,3 ST2, нг/мл 40,1 [27,5;48,5] 39,1 [25,3;74,0] 0,9 Не было выявлено достоверных различий концентраций биомаркеров у пациентов с АГ и без таковой. С учетом того, что среди пациентов с АГ преобладали мужчины, был проведен сравнительный анализ исследуемых биомаркеров среди мужчин в зависимости от наличия или отсутствия в анамнезе АГ, но он также не показал достоверных различий в концентрациях (p 0,05).
Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием сахарного диабета II типа (СД) в анамнезе проводили у 132 реципиентов сердца. СД до трансплантации был выявлен у 9 пациентов (4,5%), все мужчины, страдающие ИБС (возраст 47±12 лет). Следовательно, для получения более достоверной информации сравнительный анализ концентраций биомаркеров был проведен только среди мужчин с СД в анамнезе и у мужчин без данной патологии (таблица 7).
Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием острого нарушения мозгового кровообращения в анамнезе проводили у 127 реципиентов сердца. ОНМК перенесли 14 пациентов (6,9%), из них 12 мужчин и 2 женщины (14,3%), среди которых 8 страдали ДКМП, 6 – ИБС. Соотношение мужчин и женщин у пациентов с ОНМК (85,7% мужчин) соответствовало таковому у пациентов без данной патологии (81,8% мужчин), поэтому уровни биомаркеров сравнивались между пациентами, перенесшими данную патологию и всеми пациентами, не имевшими в анамнезе ОНМК. Сравнительный анализ концентрации исследуемых биомаркеров между реципиентами сердца с ОНМК в анамнезе и без данной патологии представлен в таблице
Сравнительный анализ концентраций биомаркеров у реципиентов, перенесших ОНМК и без развития данного нарушения Биомаркеры Концентрация медиана [Интерквартильный размах] ОНМК Без ОНМК Достоверность различий (p) sCD40L, пг/мл 3,7 [2,4;38,0;] 3,7 [2,4;40,1] 0,8 PDGF-BB, пг/мл 2465,1 [1445,2;2939,1] 2545,4 [1476,0;3690,2] 0,4 VEGF-A, пг/мл 138,5 [87,8;232,4] 151,7 [98,4;251,0] 0,8 ST2, нг/мл 38,1 [20,5;62,6] 40,0 [27,5;74,7] 0,6 Перенесенное ОНМК не влияло на концентрацию исследуемых аналитов (р 0,05).
Таким образом, содержание биомаркеров в плазме крови реципиентов сердца варьирует в широких пределах. Уровень исследуемых биомаркеров не зависит от возраста пациентов, наличия у пациентов до трансплантации СД II типа, АГ, перенесенного ОНМК. Уровни VEGF-A и ST2 выше у мужчин по сравнению с женщинами. Уровень ST2 зависит от этиологии сердечной недостаточности до ТС: концентрация ST2 у мужчин с ДКМП выше, чем у мужчин с ИБС.
Проведен анализ связи концентраций биомаркеров с результатами рутинных лабораторных исследований: общеклинического анализа крови (содержанием гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, относительным числом палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов); биохимическими показателями (концентрацией креатинина, мочевины, общего белка, общего билирубина, холестерина, триглицеридов, глюкозы)
Проведен анализ связи уровней биомаркеров с концентрацией такролимуса в крови, и корреляций уровней биомаркеров между собой.
Анализ связи уровня биомаркеров в плазме крови с общеклиническими лабораторными данными реципиентов сердца
Средние значения, величины стандартного отклонения и референсных значений общеклинических лабораторных параметров приведены в таблице 9.
У большинства из включенных в исследование реципиентов средние величины общеклинических показателей находились в пределах референсных границ. Результаты анализа корреляционной связи общеклинических показателей с уровнями sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 показали следующие закономерности. Были выявлены корреляционные связи между концентрацией sCD40L и содержанием гемоглобина, количеством эритроцитов, относительным числом моноцитов; ST2 и количеством лейкоцитов, однако, их взаимосвязь была слабой (rs 0,3). Установлена умеренная (0,3 rs 0,7) прямая корреляционная связь между содержанием PDGF-BB, sCD40L, VEGF-A и количеством тромбоцитов (r=0,40, r = 0,45, r=0,37, соответственно, p=0,0). Данная зависимость может быть следствием того, что тромбоциты являются продуцентами исследуемых биомаркеров.
Анализ связи концентраций биомаркеров с наличием гистологических и иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантированного сердца в ранние и отдаленные сроки после трансплантации
Выявленные различия в концентрации биомаркеров у пациентов с наличием или отсутствием гистологических и/или иммуногистохимических признаков острого отторжения трансплантата имели место в отдаленном, но не в раннем, периоде после трансплантации сердца. В связи с этим, следующим этапом исследования была оценка диагностического значения биомаркеров в отношении острого (клеточного и антителоопосредованного) отторжения пересаженного сердца именно в отдаленные сроки, то есть спустя год и более после ТС.
Во-первых, был проведена оценка диагностической значимости sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 на основании анализа ROC-кривых, расчета чувствительности и специфичности теста, определения диагностически значимых пороговых значений для каждого из биомаркеров.
Во-вторых, на основании полученных данных был проведен сравнительный анализ эффективности различных сочетаний тестов (панелей), включающих sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 у пациентов с острым (клеточным и антителоопосредованным) отторжением пересаженного сердца.
В-третьих, была оценена диагностическая значимость ST2 и панелей, включающих данный биомаркер, в отношении острого клеточного отторжения трансплантированного сердца. 5.1. Анализ диагностической значимости sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A, ST2 при остром отторжении Сравнение диагностической значимости исследуемых аналитов в качестве маркеров острого отторжения трансплантированного сердца в отдаленные сроки после ТС определяли с помощью анализа площади под характеристической кривой ROC для каждого биомаркера по отдельности. В начале были построены матрицы сопряженности с вычисленными значениями чувствительности и специфичности в точках отсечения, взятых через интервал в один десятичный логарифм. По данным этих матриц были построены ROC-кривые для каждого из биомаркеров при выявлении острого отторжения трансплантированного сердца. Далее был применен количественный метод сравнения ROC-кривых – вычисление и оценка площади под кривой (AUC). Результаты анализа характеристических кривых ROC для каждого из исследуемых биомаркеров представлены в таблице 21.
Площадь под кривой может изменяться от 0 до 1, где 1 – это идеальная тест-система, то есть чем ближе AUC приближается к 1, тем эффективнее тест. В нашем исследовании, значения площади под кривой у sCD40L и VEGF-A были меньше 0,5, т.е. эти биомаркеры не имели самостоятельного диагностического значения при остром (клеточном и гуморальном) отторжении трансплантированного сердца в отдаленные сроки после ТС. Значение площади под кривой PDGF-BB было больше 0,5, но не достигало статистической значимости. Исходя из данных ROC-анализа, которые показали, что величина значения площади под кривой ROC достоверно превышала 0,5 только у ST2, можно рассматривать последний в качестве потенциального биомаркера острого отторжения трансплантированного сердца. На рисунке 19 представлена ROC-кривая ST2.
Расчеты показали, что площадь под ROC-кривой ST2 составила 0,740±0,061 [0,620-0,861] и достоверно отличалась от 0,5 (р=0,001).
Диагностически значимый пороговый уровень ST2 для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца в отдаленные сроки определяли в точке по оптимальному сочетанию значений чувствительности и специфичности. Пороговый уровень находили в точке пересечения кривых чувствительности и специфичности на графике зависимостей этих статистических показателей от концентрации биомаркера в крови.
На рисунке 20 представлено определение диагностически значимого порогового значения ST2 при отторжении трансплантированного сердца.
Определение диагностически значимого порогового значения ST2 при отторжении трансплантированного сердца в отдаленные сроки после ТС Пороговое значение ST2, значимое для диагностики острого отторжения в отдаленные сроки после ТС, составило 19,7 нг/мл.
Уровень ST2 выше порогового значения был у 30 пациентов через год после ТС, из них у 13 (43,3%) развилось отторжение. Уровень ST2 ниже порогового значения был у 46 пациентов в отдаленные сроки после ТС, из них у 8 (17,4%) развилось отторжение.
Так же были рассчитаны пороговые значения для sCD40L, VEGF-A и PDGF-BB (26,8 пг/мл, 155,2 пг/мл и 2915,4 пг/мл, соответственно). Определение пороговых значений данных биомаркеров хотя и не имело самостоятельной диагностической значимости в отношении острого отторжения трансплантированного сердца, однако в дальнейшем использовалось для сравнительного анализа диагностической эффективности комплексных тестов. Относительное количество реципиентов с гистологическими и иммуногистохимическими признаками отторжения трансплантированного сердца было одинаковым у пациентов с уровнем sCD40L выше и ниже определенного порогового значения (28,2% и 27,2%, соответственно).
У 11 пациентов (26,2%) с концентрацией VEGF-A выше порогового значения были выявлены признаки отторжения по результатам ЭМБ. У 9 пациентов (29,0%) с уровнем VEGF-A ниже порогового значения были выявлены признаки отторжения по результатам ЭМБ.
Уровень PDGF-BB выше порогового значения был у 33 реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации, из них у 11 (33,3%) развилось отторжение. Уровень PDGF-BB ниже порогового значения был у 42 пациентов в отдаленные сроки после ТС, из них у 10 (23,8%) развилось отторжение.
Данные расчета относительного риска наличия признаков острого отторжения при уровнях биомаркеров, превышающих их пороговые значения, 95% доверительного интервала (ДИ), а также значений чувствительности и специфичности sCD40L, VEGF-A, PDGF-BB и ST2 приведены в таблице 22. Таблица 22. Аналитические показатели биомаркеров для диагностики острого отторжения в отдаленные сроки после ТС
Относительный риск наличия признаков острого отторжения у пациентов с уровнем ST2 выше порогового значения оказался равен 2,6 ± 0,4 [95% ДИ 1,3 – 5,4], чувствительность и специфичность составили 67% и 66%, соответственно. Относительный риск наличия острого отторжения у пациентов с уровнем PDGF-BB выше порогового был равен 1,7±0,4 [95% ДИ 0,8– 3,3], чувствительность и специфичность составили 58% и 59%, соответственно. Границы доверительного интервала включали единицу, следовательно, влияние концентрации PDGF-BB на диагностику острого отторжения не было статистически значимым. Уровни sCD40L и VEGF-A не были связаны с наличием острого отторжения трансплантата сердца, так как относительный риск, рассчитанный для данных биомаркеров, был меньше, либо равен единице.
Таким образом, результаты проведенного анализа показали, что тест на ST2 у пациентов с трансплантированным сердцем в отдаленные сроки после ТС имеет значение для диагностики острого отторжения. Остальные биомаркеры не имеют самостоятельного диагностического значения при остром отторжении трансплантированного сердца. 5.2. Сравнительная оценка диагностической значимости комплексных тестов, включающих сочетания биомаркеров
Сложность применения отдельных биомаркеров для диагностики острого отторжения трансплантированного сердца на практике обуславливается неспецифичностью тестов и многофакторностью патогенетического процесса повреждения трансплантата, поэтому был проведен сравнительный анализ диагностической значимости различных сочетаний тестов, содержащих комбинации ST2 и/или sCD40L, VEGF-A, PDGF-BB.
Оценка диагностической значимости панелей, включающих различные комбинации исследуемых биомаркеров, приведена в таблице 23.
Сравнительный анализ статистических характеристик комбинаций биомаркеров показал различную диагностическую эффективность в отношении острого отторжения трансплантированного сердца. Следующие панели биомаркеров обладали низкой диагностической значимостью в отношении отторжения трансплантированного сердца: комбинация всех четырех биомаркеров (sCD40L, PDGF-BB, VEGF-A и ST2); сочетание sCD40L, PDGF-BB и VEGF-A; sCD40L и PDGF-BB; sCD40L и VEGF-A; PDGF-BB и VEGF-A.