Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эволюция заменителей клапанов сердца и предпосылки к созданию тканевой матрицы митрального клапана (обзор литературы) 11
1.1. Ксеногенные сердечные клапаны 11
1.1.1. Химическая фиксация 12
1.1.2. Каркасные и бескаркасные БИКС 14
1.2. Тканевая инженерия для создания клапанного протеза 18
1.2.1.Синтетические матрицы для сердечных клапанов 19
1.2.2. Децеллюляризированные матрицы для сердечных клапанов 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Материалы исследования 31
2.2. Методы
2.2.1. Заготовка клапанов 33
2.2.2. Децеллюляризация 33
2.2.3. Гистологический анализ 36
2.2.4. Цитотоксический тест 38
2.2.5. Определение количества ДНК 41
2.2.6. Механические испытания 41
2.2.7. Хирургическая имплантация 44
2.2.8. Статистический анализ 47
Глава 3. Результаты 48
3.1. Сравнительная оценка различных способов децеллюляризации митрального аллографта 48
3.2. Динамика репопуляции фрагмента митрального аллографта в ходе цитотоксического теста 56
3.3. Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта 58
[Введите текст]
3.4. Результаты оценки функциональных и морфологических характеристик децеллюляризированных митральных аллографтов в хроническом эксперименте in vivo 59
3.4.2. Макроскопическая оценка результатов имплантации ДМА in vivo 60
3.4.3. Характеристика внеклеточного матрикса и направленной регенерации ткани децеллюляризированных митральных аллографтов...63
Глава 4. Обсуждение 69
Заключение 77
Выводы 78
Практические рекомендации 79
Список сокращений 80
Список использованной литературы 81
- Тканевая инженерия для создания клапанного протеза
- Гистологический анализ
- Динамика репопуляции фрагмента митрального аллографта в ходе цитотоксического теста
- Макроскопическая оценка результатов имплантации ДМА in vivo
Тканевая инженерия для создания клапанного протеза
Биологические искусственные клапаны сердца (БИКС) ведут свою историю с 1960-х годов XX века, когда А. Carpentier в своих исследованиях анатомии клапанов различных видов животных, опубликованных в 1964 году, обнаружил, что свиные клапаны наиболее близки к человеческим [48]. Чуть позже в Англии С. Duran и А. Gunning выполнили протезирование аортального клапана пациенту свиным аортальным ксенографтом [49]. С этого момента свиные аортальные клапаны не просто считаются подходящими биологическими заменителями и в разных модификациях широко используются в кардиохирургии, но и, наряду с перикардиальными протезами, стали стандартом лечения пороков всех четырех клапанов сердца [50].
Перикардиальные клапаны были разработаны несколько позже. М. Ionescu [51]предложил клапан из бычьего перикарда, обработанного глутаральдегидом и размещенного на обшитом дакроном титановом каркасе. Этот оригинальный клапан показал отличные гидродинамические свойства и хорошую надежность in vitro. В марте 1971, М. Ionescu впервые использовал ксеногенные клапаны при операциях на людях, а спустя пять лет, в 1976, Shiley Laboratory в Калифорнии начала производство и распространение этого типа БИКС под названием «Перикардиальный ксенографт Ionescu-Shiley» [51].
И свиной аортальный, и бычий перикардиальный протезы показали схожие результаты и отсутствие необходимости антикоагулянтной терапии [50]. Однако основными недостатками, по-прежнему, были постепенная дегенерация, ограничивающая срок службы БИКС. Процессы, ответственные за структурные изменения биопротезов напрямую связаны с химическими и морфологическими изменениями, происходящими во время обработки ткани и создания клапана с последующим механическим повреждением из-за возросшего сдвигового напряжения после имплантации клапана. Долговечность клапана зависит от множества факторов, таких, как: происхождение ткани, возраст и состояние пациента, иммунологическое взаимоотношение тканей донора и реципиента, гемодинамическая нагрузка во время сердечного цикла и, конечно, способ химической фиксации и методика консервации [52,53].
Клинически используемые ксенографты обычно консервируются с использованием химических сшивок (кросс-линкинг) с помощью альдегидов. Такой способ снижает антигенность ксенографта, ингибирует аутолиз, улучшает стабильность материала. Так же фиксация позволяет сохранить клапан стерильным и резистентным к образованию тромба [52]. В начале, при производстве ксенографтов для химической консервации использовался раствор формальдегида, однако быстрая дегенерация таких клапанов не позволила добиться удовлетворительных отдаленных результатах. Исследование, [Введите текст] проведенное А. Carpentier et al. [54] показало, что именно глутаральдегид способен наиболее эффективно бороться с воспалительным ответом организма реципиента. Позже, глутаральдегид был предложен для фиксации ткани ксеногенных клапанов и обеспечил улучшение результатов их клинического применения [55]. Было показано, что глутаральдегид эффективно сшивает коллаген, в отличие от формальдегида, что может объяснить преждевременное разрушение ксенографтов, фиксированных в формальдегиде [56].
Однако слабым местом химической фиксации является необратимое нарушение жизнеспособности фибробластов и интерстициальных клеток, делая, таким образом, невозможным с самого начала ремоделирование коллагена в ткани клапана in vivo, таким образом, механические свойства клапана зависят преимущественно от качества коллагена в ксенографте, и со временем могут только ухудшаться, по мере «износа» внеклеточного матрикса. Более того, фрагменты убитых клеток остаются в ткани и служат ядрами кальцификации [52]. G. Thiene et al. [57] описали каскад событий, следующих за фиксацией в глутаральдегиде и приводящий к минерализации графта и разрушению клапана. Глутаральдегид, убивая клетки ксенографта, вызывает увеличение притока кальция в цитоплазму. Затем, возросшее количество внутриклеточного кальция, вместе с фосфором из фрагментов фосфолипидной мембраны и клеточного детрита, запускает образование фосфата кальция. После этого происходит минерализация коллагена, ведущая к прогрессирующему разрушению ксенографта и нарушению функции клапана. Для уменьшения этого эффекта исследователи внедряют различные технологии, дополняющие химическую сшивку – консервация при очень низком или нулевом давлении, обработка сурфактантом или особый температурный режим, а также модификацию конструкции каркаса. Все эти улучшения направлены на дельнейшее снижение частоты структурных изменений [58]. Тем не менее, даже для современных клапанов скорость деградации напрямую зависит от возраста больного, как уже упоминалось выше [1,33]. [Введите текст] Но не только биологическая совместимость влияет на долговечность и гемодинамические особенности клапана. Отдельной проблемой биологических заменителей является сложность их хирургической имплантации. Ниже рассматриваются различные варианты биопротезов в зависимости от наличия или отсутствия каркаса и его влияние на функционирование БИКС.
Гистологический анализ
Для оценки механических свойств ДМА выполнялись испытания на одноосное растяжение, позволяющие оценить эластичность ткани, прочность на разрыв и некоторые другие параметры, описанные ниже.
Испытания проводились на аппарате Zwick/Roell Z 0.5 (Zwick/Roell, Германия, рисунок 3). Из передней створки каждого клапана иссекался фрагмент зоны А2 в радиальном направлении таким образом, что его размеры испытываемой части равнялись 5 мм длиной и 2,5 мм шириной (соотношение сторон 2:1).
Перед началом испытаний были проведены три предварительных теста с целью определения уровня деформации, соответствующего переходу эластиновой фазы в коллагеновую. Переходной (транзиторной) деформацией (єтр) являлась величина деформации, соответствующая точке пересечения с осью Х линии, являющейся продолжением второго прямого отрезка (коллагеновой фазы) кривой зависимости деформации от силы. Значение силы, соотвествующей этой величине деформации, является переходным (FTp). Прекондиционированием ткани являлось циклическое натяжение ткани до уровня, соответствующего величине переходной деформации (Рисунок 4) [188]. Количество циклов прекондициони-рования определялось исходя из кривой зависимости силы от времени, полученной в результате трех незачетных испытаний створок митрального клапана. Образцы подвергались циклическому растяжению и способом. Минимальным необходимым количеством циклов принималось количество циклов, после которого не наблюдалось дальнейшего снижения величины силы, необходимой для создания єтр - для изученного фрагмента митрального клапана эта величина составила 10 циклов прекондиционирования. Уровень преднагрузки был принят равным 0,005 Н, что соответствует порогу чувствительности прибора.
Собственно механические испытания заключались в выполнении прекондиционирования с последующим растяжением до разрушения ткани.
Оценивались следующие значения: переходная деформация (єтр, %) и соответствующее ей значение силы (отр, МПа), предельная деформация (sUTS, %), предельная значение силы (GUTS, МПа), модуль эластичности ткани в начальном (эластической) и конечном (коллагеновой) отрезках кривой зависимости деформации от нагрузки. Для нормализации значения силы относительно площади поперечного сечения испытываемого образца, вычислялась величина нагрузки (МПа) по формуле о = F/S, где - удельная нагрузка, F - сила, S - площадь поперечного сечения образца, рассчитанная, как произведение его ширины на толщину. Ширина всех образцов равнялась 2,4 мм и определялась шириной ножа (см. Рисунок 5), толщина рассчитывалась сенсором Sylvac S246 (Sylvac SA, Швейцария) с прилагающимся комплектом программного обеспечения.
Слева - нож для подготовки стандартизированного образца для механических испытаний. Справа – подготовленный для механических испытаний фрагмент зоны А2 децеллюляризированного митрального аллографта. [Введите текст] Переходная деформация єтр рассчитывалась следующим образом. На графике зависимости деформации от силы проводилась линия тренда для отрезка, иллюстрирующего коллагеновую фазу деформации (Рисунок 6). Точка пересечения этой линии с осью Х и является значением переходной деформации, выражена в процентах к исходной длине образца. Также учитывалось соответствующее ей значение силы (FTp), выраженной в мегапаскалях.
Значения предельной деформации и силы соответствовали высшей точке на графике зависимости деформации от силы воздействия.
График зависимости деформации от силы, воздействующей на образец. Красная линия – коллагеновая фаза кривой, к которой проведена линия тренда. Точка пересечения линии тренда с осью Х соответствует значению переходной деформации (%). Соответствующее ей значение силы – Fтр, МРа) Модулями эластичности эластиновой и коллагеновой фаз кривой зависимости деформации от нагрузки принимались тангенсы угла наклона линий тренда (R2 0,9), проведенных для соответствующих отрезков графика, относительно горизонтальной оси.
Имплантация децеллюляризированных митральных аллографтов производилась на овцах (n=4) с использованием комбинированного [Введите текст] эндотрахеального наркоза и искусственного кровообращения. Индукция в наркоз осуществлялась 1% раствором пропофола (BBraun, Германия), наркоз поддерживался ингаляцией изофлюрана (Abbott Laboratories, Великобритания) и внутривенным введением 0,005% раствором фентанила (BBraun, Германия). Во время операции осуществлялся инвазивный мониторинг артериального и центрального венозного давления через катетеры, установленные, соответственно, в сонную артерию и яремную вену (BBraun, Германия). В положении животного на правом боку выполнялась левосторонняя боковая торакотомия в 3-м межреберьи. Аппарат искусственного кровообращения подключался по схеме «дуга аорты – ушко правого предсердия». После пережатия аорты через комбинированную канюлю выполнялась холодовая кровяная кардиоплегия. Затем вскрывалось левое предсердие, через атриотомию устанавливался дренаж левого желудочка. Основной этап операции начинался с иссечения собственного митрального клапана, при этом для облегчения ориентации сохранялись фрагменты хорд на головках папиллярных мышц длиной 3-4 мм. Размер имплантируемого децеллюляризированного аллографта выбирался так, чтобы он был на 4 мм (два размера) больше диаметра фиброзного кольца реципиента. Затем головки папиллярные мышц реципиента и донора прошивались полипропиленовыми нитями 4-0 (Prolene, Ethicon Inc., США) с двумя прокладками из ПТФЭ, по два П-образных шва на каждую мышцу. После этого клапан опускался внутрь желудочка, швы завязывались. Далее, кольцо аллографта фиксировалось к фиброзному кольцу реципиента двумя швами Prolene 4-0 в области митрально-аортальных треугольников. После завязывания узлов, один из швов продолжался в непрерывный обвивной и связывался с другим по его достижении, затем второй шов также продолжался в непрерывный обвивной до завершения фиксации кольца аллографта к кольцу реципиента. Отсутствие опорного кольца было принципиальным, чтобы изучить возможность имплантации аллографта детям, у которых наличие жесткого элемента приведет к стенозированию. Перед закрытием левого предсердия выполнялась гидравлическая проба, при возникновении пролапса митрального клапана [Введите текст] вследствие избыточности створок (1 случай из 4) выполнялась пликация створок митрального клапана нитью пролен 5-0. Схема операции представлена на рисунке 7. После отпускания зажима на аорте ритм восстанавливался спонтанно или с помощью дефибрилляции (10-20 Дж). Затем следовала реперфузия в течение 20 минут, постепенное снижение минутной скорости искусственного кровообращения до полной его остановки, и деканюляция. В плевральную полость устанавливался дренаж в 7-ммежреберьи и пережимался, торакотомная рана укрывалась послойно, обычным способом.
Динамика репопуляции фрагмента митрального аллографта в ходе цитотоксического теста
Микрофотографии клеток, сделанные в 1-е сутки после посева клеток на поверхности створки клапана, показали, что клетки закрепились, распределившись по всей предоставленной площади, не образуя колоний.
Первые хаотично расположенные колонии клеток обнаруживались уже на 3-й день культивации, и к 7-му дню все засеянные фрагменты клапанов были покрыты однорядным слоем клеток, имеющим вид булыжной мостовой, типичный для эндотелиальных клеток. Различий в скорости роста клеток и формирования монослоя на клапанах, приготовленных с использованием -меркаптоэтанола и без него, выявлено не было (Рисунок 13). После окончания эксперимента, из засеянных фрагментов створок были приготовлены гистологические препараты для световой микроскопии и ИФА. Окраски по Мовату и гематоксилином и эозином показали, что клетки располагаются однорядным слоем по поверхности децелюлляризированной створки митрального клапана, не проникая в его толщу.
Эндотелиальная природа клеток на поверхности фрагментов клапанов была подтверждена при ИФА. Мембрана клеток фиксировала антитела, специфичные к антигену CD31, а в цитоплазме этих клеток обнаруживались
Результаты цитотоксического теста. гранулы, связывающие антитела к фактору фон Виллебрандта. Флюоресценция, отмечающая эндотелиальную NO-синтазу, обнаруживалась как на мембранах, так и во внутриклеточных гранулах (комплекс Гольджи). Таким образом, компоненты раствора 5-11, после промывания децеллюляризированных митральных аллографтов по описанной выше методике, не оказывают токсического влияния на эндотелиальные клетки и не препятствуют заселению поверхности створок.
[Введите текст] 3.3. Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта
Толщина створок митрального клапана в результате децеллюляризации уменьшилась и составила, 0,24 ± 0,11 мм против 0,35 ± 0,06 мм у свежего МА; р=0,074. Сравнительная характеристика механических свойств свежих и децеллюляризированных митральных аллографтов представлена на рисунке 14.
Сравнение механических свойств свежих и децеллюляризированных митральных аллографтов. МА – митральный аллографт. ДМА – децеллюляризированный МА. UTS – предельное значение силы, МРа, Tr– переходное значение силы, МР, UTS – деформация при предельном значении силы, %, Tr – переходная деформация, %. Объяснения в тексте. [Введите текст] Значения UTS для децеллюляризированных образцов оказались выше, чем для свежих - 1,23 ± 0,35 МРа против 2,16 ± 0,42 МРа (р 0,001), также, как и модуль эластичности ткани в коллагеновой фазе кривой - 5,5 ± 1,26 против 8,29 ± 2,86 (р=0,04).
С другой стороны, изменения в остальных показателях не были статистически достоверны. Так, отмечалось некоторое увеличение показателей тг (0,1 ± 0,05 против 0,18 ± 0,09; р=0,15) и Тг (0,12 ± 0,05 МРа против 0,24 ± 0,08 МРа; р=0,08), а также UTs (0,3 ± 0,09 против 0,44 ± 0,1, р=0,09) и модуля эластичности в начальной (эластиновой) части кривой (0,39 ± 0,28 против 0,67 ± 0,55, р=0,46).
Таким образом, из рисунка 14 и приведенных выше показателей видно, что механическая прочность митральных аллографтов после децеллюляризации несколько увеличилась, также, как и ее жесткость в коллагеновой фазе кривой. При этом необходимо отметить, что ни по одному показателю не наблюдалось ухудшения механических свойств створок ДМА по сравнению со свежим МА, что позволяет говорить о пригодности полученной матрицы к хирургической имплантации.
Первые сутки после операции все животные находились под наблюдением ветеринарного врача в одиночном стойле. Затем после контрольной аспирации отделяемого по дренажу последний удалялся, и животные переводились в общее стойло. За время наблюдения ни у одного животного не было зафиксировано подъема температуры, изменений поведения или нарушения аппетита. На момент выведения из эксперимента все они были признаны здоровыми ветеринарным врачом.
Из таблицы видно, что в периоперационном периоде гемодинамические результаты протезирования митрального клапана децеллюляризированным митральным аллографтом были удовлетворительными. Независимо от размеров фиброзного кольца подвижность и коаптация створок митрального клапана у всех животных была удовлетворительной, признаков стеноза клапана не наблюдалось. Только у одного животного была отмечена регургитация второй степени, которая клинически себя никак не проявляла.
Два ДМА были эксплантированы по истечении 2 месяцев (животные №№ 12, 102), еще два – через 4 месяца (№№ 91, 97) после операции, Животное с контрольным биологическим клапанным протезом (животное № 100) было также выведено из эксперимента через 4 месяца. [Введите текст] Рисунок 15. Вид ДМА через 2 месяца после имплантации. Зеленая стрелка – линия шва вдоль фиброзного кольца митрального клапана, синяя стрелка – прокладка из ПТФЭ, черная стрелка – рубец на месте донорской части папиллярной мышцы. Макроскопически при эксплантации створки и хорды всех образцов сохранили исходное анатомическое строение. При пальпации они были мягкими на всем протяжении, не имели признаков кальцификации или рубцевания. Папиллярные мышцы ДМА, напротив, с увеличением срока пребывания в организме реципиента замещались рубцом и срастались с головками папиллярных мышц реципиента. Зеленая стрелка – линия шва вдоль фиброзного кольца митрального клапана, синяя стрелка – прокладка из ПТФЭ, черная стрелка – рубец на месте донорской части папиллярной мышцы.
На предсердной и желудочковой поверхности створок ДМА №№12, 102, выведенных их эксперимента через 2 месяца после имплантации обнаруживались единичные участки микротромбозов размерами на более 2 мм в наибольшем измерении (Рисунок15). Нить была полностью скрыта в тканях как со стороны предсердия, так и со стороны желудочка на образцах №№ 91, 97 (выведены из эксперимента через 4 месяца), хотя и через два месяца после имплантации линия
Макроскопическая оценка результатов имплантации ДМА in vivo
Как известно, аллогенная трансплантация в настоящее время распространена для лечения терминальных стадий заболеваний сердца, легких, печени, почек, тонкой кишки, поджелудочной железы и т.д. [191–199]. Однако, во всех перечисленных случаях реципиент обязан получать пожизненную иммуносупрессивную терапию, чтобы избежать дисфункции и отторжения трансплантата[200,201]. В случае сердечных клапанов, этой проблемы можно избежать. На примере классических биологических протезов клапанов известно, что они способны функционировать длительное время, не имея жизнеспособных клеток. А поскольку именно клетки несут на себе антигены, ответственные за развитие иммунного ответа при аллогенной трансплантации, то их удаление позволит не просто избежать отторжения, но и сохранить функцию клапана. С момента описания метода децеллюляризации в 1995 г. Stephen F. Badylak [202], в эксперименте ей подвергали как отдельные ткани, так и целые органы [79,136,153,203,204], а децеллюляризированные аортальный и легочный клапаны, как говорилось выше, уже успешно применяются в клинической практике.
Однако децеллюляризация митрального аллографта представляется более сложной по сравнению с легочным или аортальным аллографтами, используемых уже более десятилетия. Митральный клапан состоит из створок, хорд и папиллярных мышц – все эти элементы призваны противостоять очень высокому давлению – в отличие от аортального клапана, максимальный градиент давлений у здорового человека на котором приблизительно равен 70-80 мм рт. ст. и фиксируется в диастолу, митральному клапану необходимо выдерживать систолическое давление, не менее 120 мм рт. ст. Кроме того, вследствие таких различий условий функционирования, толщина створки митрального клапана составляет около 240 мкм, в 3 раза больше таковой у аортального, что, безусловно, усложняет децеллюляризацию.
Головки папиллярных мышц служат местом прикрепления хорд митрального клапана к миокарду. После иссечения их из миокарда они теряют кровоснабжение, и, с хирургической точки зрения, представляют собой только якорь для фиксации донорских хорд к папиллярным мышцам реципиента. При изучении гистологических препаратов свежих папиллярных мышц было установлено, что волокна, формирующие хорды, после вхождения в миокард распадаются на отдельные пучки и теряются в миокарде уже на глубине 1,5 – 2 мм от эндокарда. Такой небольшой объем ткани слишком мал для наложения хирургического шва, поэтому необходимо сохранить большее количество мышцы и, соответственно, увеличить массу и объем ткани, что является еще одной особенностью, влияющей на децеллюляризацию – для эффективного разрушения клеток в мышце и вымывания из нее антигенов было необходимо увеличить общее время экспозиции.
Детергенты как основной компонент раствора для децеллюляризации, были выбраны из-за их способности разрушать клетки и вымывать из ткани их компоненты, с одной стороны, и малого влияния на внеклеточный матрикс. В литературе описаны различные другие группы агентов, используемых с той же целью: ферменты, кислоты и основания, гипо- и гипертонические растворы, спирты, хелатирующие вещества, а также различные физические методы воздействия [13]. Все они действительно способны разрушить клетки, однако самой по себе гибели клеток недостаточно для адекватного снижения иммуногенности тканей, поскольку антигены могут оставаться в ячейках межклеточного вещества и вызывать реакцию иммунной системы реципиента так же, как когда они находились на поверхности клеток. Все это приводит к их ранней биодеградации – это известно, например, по результатам имплантации свиных аортальных кондуитов SynerGraft [14]. Они показали сравнительно хорошие результаты на овцах, однако необходимо отметить, что в описанном эксперименте была выбрана некорректная модель – невозможна экстраполяция скорости деградации и гемодинамического подведения клапанного заменителя в легочной позиции на его функционирование в аортальной, в частности, из-за различных величин сдвигового напряжения, воспринимаемых протезом. Известно, что биологические клапаны в легочной позиции служат дольше, чем в аортальной, а после выполнения операции Росса клапан легочной артерии в аортальной позиции деградирует существенно быстрее, чем нативный аортальный [18]. Кроме того, ксеногенную модель «от свиньи к овце» нельзя считать эквивалентной клинической ситуации «от свиньи к человеку», поскольку в последнем случае сверхострое отторжение вызывают общий для свиньи и овцы, но чужеродный для человека антиген - -GAL. Поэтому, к сожалению, недостаточность децеллюляризации (технология предполагала гипотонический лизис клеток и обработку ДНазой) проявилась только на клиническом этапе – больные погибали из-за быстрой дегенерации и разрыва донорской части стенки аорты[175,176]. В настоящий момент проблема ксенотрансплантации не решена[133,159], поэтому в настоящей работе изучалась возможность только аллотрансплантации МА.