Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные подходы к коррекции нарушений функций центральной нервной системы при остром отравлении оксидом углерода (обзор литературы) 15
1.1 Токсикологическая характеристика оксида углерода 15
1.2 Нейротоксические механизмы действия оксида углерода
1.3 Патоморфологические и гистологические изменения структур головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 26
1.4 Обоснование применения нейропептидов в терапии отравлений оксидом углерода 27
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1 Дизайн и объём экспериментальных исследований 36
2.2 Выбор и содержание лабораторных животных 36
2.3 Моделирование тяжелого отравления оксидом углерода 37
2.4 Характеристика используемых фармакологических средств 39
2.5 Методы исследований
2.5.1 Оценка общего состояния 41
2.5.2 Оценка двигательной активности 42
2.5.3 Оценка неврологического статуса 42
2.5.4 Методы оценки когнитивных функций 43
2.5.5 Определение концентрации карбоксигемоглобина в крови лабораторных животных 44
2.5.6 Определение концентрации восстановленного глутатиона в гомогенатах головного мозга 45 2.5.7 Определение концентрации малонового диальдегида в гомогенатах головного мозга 46
2.5.8 Определение активности глутатионпероксидазы в гомогенатах головного мозга 47
2.5.9 Определение содержания маркеров апоптоза в гомогенатах головного мозга 48
2.5.10 Методы морфологических исследований поля СА3 гиппокампа 49
2.6 Методы статистической обработки результатов исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований 51
3.1 Экспериментальная модель оценки нарушений функций центральной нервной системы при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 51
3.2 Оценка эффективности применения кислорода и ацизола на течение и исход острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 56
3.2.1 Влияние кислорода и ацизола на клинические проявления острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 56
3.2.2 Влияние кислорода и ацизола на сохранность пространственной памяти и обучаемость при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 59
3.3 Влияние нейропептидов на коррекцию нарушений функций центральной нервной системы при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 62
3.3.1 Влияние нейропептидов на клинические проявления острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 62
3.3.2 Влияние нейропептидов на сохранность пространственной памяти при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 65
3.3.3 Влияние нейропептидов на обучаемость в отдалённом периоде острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 71
3.4 Влияние пептида КК1 на биохимические показатели при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 74
3.4.1 Влияние пептида КК1 на процессы перекисного окисления липидов в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 74
3.4.2 Влияние пептида КК1 на концентрацию восстановленного глутатиона в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 75
3.4.3 Влияние пептида КК1 на активность глутатионпероксидазы в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 3.5 Влияние пептида КК1 на процессы апоптоза в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 78
3.6 Влияние пептида КК1 на изменения морфологической структуры поля СА3 гиппокампа при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода 80
Глава 4. Нейропептиды в коррекции нарушений функций центральной нервной системы при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода (обсуждение полученных результатов) 84
Выводы 101
Практические рекомендации 103
Список сокращений 104
Список литературы
- Патоморфологические и гистологические изменения структур головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
- Определение концентрации карбоксигемоглобина в крови лабораторных животных
- Влияние нейропептидов на клинические проявления острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
- Влияние пептида КК1 на процессы перекисного окисления липидов в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
Введение к работе
Актуальность исследования. В современном мире летальность от отравления оксидом углерода (СО, угарный газ, монооксид углерода) среди ингаляционных интоксикаций занимает ведущее место [Зобнин Ю.В. и др., 2011; Braubach M. et al., 2013]. В Российской Федерации смертность от воздействия СО в структуре острых отравлений находится на втором месте после интоксикации этанолом. Так, в 2006 г. в РФ летальные исходы при отравлении СО составили 21% от общего количества отравлений, а в 2014 г. – 22,5% [Остапенко Ю.Н. и др., 2015]. Данные цифры свидетельствуют об отсутствии динамики к снижению смертности отравленных СО.
По данным МЧС России в 2015 г. в РФ произошло около 146 тыс. пожаров, на
которых погибло около 10 тыс. человек, травмировано более 11,2 тыс. человек. Не
только гражданское население может пострадать на пожарах. Существует реальная
угроза поражения военнослужащих на пожарах как в военное, так и в мирное время.
Поражение людей на пожарах в первую очередь связано с воздействием химического
фактора [Blomqvist P. et al., 2001]. На каждого погибшего на пожаре приходится от 3 до
10 человек, пострадавших от действия токсичных компонентов продуктов
термодеструкции различных материалов [Pauluhn J.A., 1993]. Основным токсическим
соединением, образующимся в результате термодеструкции, является СО [Тиунов Л.А.
и др., 1980; Kao L.W. et al., 2005]. Помимо этого, острое отравление СО может
произойти в результате неправильной эксплуатации систем домашнего отопления,
воздействия вредных факторов производства, совершения суицидальных
попыток [Taki K., 2009] и др.
Ведущий механизм токсического действия оксида углерода связан с развитием гемической гипоксии [Prockop L.D. et al., 2007], которая приводит к повреждению органов и тканей с высоким потреблением кислорода, среди которых на первом месте находится центральная нервная система (ЦНС) [Зобнин Ю.В. и др., 2011]. Описаны и другие механизмы токсического действия оксида углерода, приводящие к поражению различных структур ЦНС [Маркизова Н.Ф. и др., 2008; Oh S. et al., 2015]. Особо следует подчеркнуть, что нейротоксическое действие оксида углерода может вызывать отдаленные повреждения нервной системы [Choi I.S. et al., 2014]. Показано, что у 13-50% пациентов с тяжёлым отравлением СО, сопровождающимся потерей сознания, увеличением концентрации карбоксигемоглобина в крови свыше 25%, после асимптоматического периода развиваются нарушения функций центральной нервной системы [Prockop L.D. et al., 2007]. Однако следует признать, что отдалённые эффекты, развивающиеся со стороны ЦНС вследствие отравления оксидом углерода, изучены недостаточно.
Сегодня среди методов лечения отравлений оксидом углерода ведущим
остается кислородотерапия. К сожалению, проведение кислородотерапии
не может в полной мере предотвратить все токсические эффекты, вызванные оксидом углерода [Oh S. et al., 2015].
В ряде научных работ в качестве средств, корректирующих нарушения функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации СО, использовались пептидные препараты, в том числе нейропептиды [Королёва В.И. и др., 1999; Ghobarni M. et al., 2013]. Интерес
фармакологов и токсикологов к нейропептидам объясняется как высокой активностью при использовании малых доз препаратов, отсутствием выраженных побочных эффектов при применении их в терапевтических дозах при относительно длительном курсе лечения, так и возможностью интраназального введения. Показана высокая эффективность применения нейропептидов для коррекции нарушений функций центральной нервной системы при различных патологических состояниях [Шабанов П.Д., 2008; Бондаренко Т.И. и др., 2011].
Очевидно, что необходимо продолжить скрининг новых лекарственных препаратов, способных предотвратить неблагоприятные нейротоксические эффекты, формирующиеся в отдаленном периоде интоксикации оксидом углерода. Актуальным представляется изучение нейропептидов в качестве средств нейропротекции при отравлениях оксидом углерода.
Степень разработанности темы диссертационного исследования. Проблеме острых отравлений оксидом углерода уделялось и уделяется большое значение в России и за рубежом. Основное внимание отечественные авторы в своих исследованиях, связанных с интоксикациями оксидом углерода, посвятили острому периоду интоксикации [Тиунов Л.А. и др., 1980] и отдалённым нарушениям, развивающимся со стороны дыхательной [Шилов В.В. и др., 2009] и сердечнососудистой систем [Бортулев С.А., 2013]. Однако в последние годы стали активно проводиться научные исследования по изучению нейротоксического действия СО и, прежде всего, в отдаленном периоде интоксикации [Lam S.P. et al., 2004; Thom S.R. et al., 2004], а также поиску эффективных средств терапии данных расстройств [Ghorbani M. et al., 2013].
Существующие исследования механизмов токсического действия СО
свидетельствуют о том, что повреждения нервной системы нельзя объяснить исключительно гемической гипоксией из-за образования карбоксигемоглобина [Prockop L.D. et al., 2007]. Опосредованные нейротоксические механизмы действия СО были обозначены ещё в работах отечественного токсиколога Л.А. Тиунова [Тиунов Л.А. и др., 1980]. Предполагается участие других механизмов действия СО в реализации его нейротоксических эффектов.
Необходимо создание новых средств предупреждения нарушений функций ЦНС, вызванных интоксикацией оксидом углерода, обладающих высокой эффективностью и безопасностью, удобством применения на этапах оказания медицинской помощи. Перспективной группой препаратов для этих целей могут стать нейропептиды. Исходя из механизмов фармакологического действия, обуславливающих нейропротективный эффект, их применение с целью предотвращения развития нарушения когнитивных функций при отравлении СО теоретически целесообразно [Бондоренко Т.И. и др., 2011; Цукурова Л.А. и др., 2013]. Однако в литературе имеется ограниченное количество прямых экспериментальных доказательств их эффективности для предотвращения нарушения функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода, что и послужило основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования: экспериментальное обоснование применения
нейропептидов в комплексной терапии острых отравлений оксидом углерода.
Задачи исследования:
1. Создать экспериментальную модель оценки нарушений функций центральной
нервной системы у лабораторных животных при острой тяжёлой интоксикации
оксидом углерода.
2. Провести скрининг нейропептидов (синтетический аналог тафцина, семакс,
тетрапептид КК1, дельтакон), эффективных для коррекции нарушений функций
центральной нервной системы у лабораторных животных при острой тяжёлой
интоксикации оксидом углерода.
3. Изучить влияние пептида КК1 на некоторые показатели системы глутатиона,
содержание маркеров апоптоза (протеинкиназа Akt1 и белок р53) в головном мозге
крыс, а также на патоморфологическую структуру поля СА3 гиппокампа крыс при
острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
Научная новизна исследования. Создана экспериментальная модель оценки нарушений функций центральной нервной системы, как в остром, так и в отдалённом периоде тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
Выполнена сравнительная оценка эффективности биологически активных фармакологических веществ среди пептидных соединений: синтетического аналога тафцина, дельтакона, семакса и пептида КК1 на фоне однократного проведения нормобарической оксигенации на разработанной экспериментальной модели нарушений функций центральной нервной системы при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода. Показано, что совместное применение кислорода и синтетического аналога тафцина, дельтакона, семакса малоэффективно для предотвращения нарушения функций ЦНС при данной патологии.
Впервые установлено, что лечебное применение синтетического тетрапептида КК1 на фоне однократного проведения кислородотерапии, приводит к восстановлению пространственной памяти и нормализации обучаемости у лабораторных животных при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода. При исследовании механизмов действия пептида КК1 выявлено, что его применение стимулирует систему антиоксидантной защиты (АОЗ) нейрональных клеток и способствует ограничению развития оксидативного повреждения головного мозга в отдалённом периоде острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода. Установлено, что применение тетрапептида КК1 способствует ограничению развития апоптотических процессов в головном мозге крыс в отдалённом периоде после воздействия СО. Показана эффективность применения пептида КК1 для восстановления гистоархитектоники поля СА3 гиппокампа у крыс в отдалённом периоде острой тяжёлой интоксикации СО.
Теоретическая и практическая значимость. В результате проведённого исследования создана экспериментальная модель оценки отдалённых нарушений функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода, которая может быть использована для скрининга препаратов, обладающих нейропротекторными свойствами.
Выявлено, что однократное лечебное применение нормобарической оксигенации и комбинации кислорода с ацизолом не приводят к полному восстановлению функций центральной нервной системы при тяжёлой интоксикации СО.
Практическая значимость работы заключается в экспериментальном обосновании применения пептида КК1 в качестве перспективного средства коррекции нарушений функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
Показано, что лечебное применение пептида КК1 (интраназально в дозе 40 мкг/кг/сут в течение 5 дней) на фоне однократного применения оксигенотерапии способствует восстановлению пространственной памяти и нормализации обучаемости лабораторных животных, восстановлению гистоархитектоники поля СА3 гиппокампа, стимуляции антиоксидантной защиты клетки и предотвращению развития апоптоза в головном мозге крыс при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
Полученные экспериментальные данные об эффективности применения пептидных препаратов при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода и возможных механизмах реализации нейропротективного эффекта пептида КК1 позволяют рекомендовать дальнейшее изучение этого препарата, в том числе и при различных угрожающих жизни состояниях, связанных с нарушением функций ЦНС.
Методология и методы исследования. Экспериментальное исследование проводилось на базе кафедры военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова.
Работа выполнена на 948 белых беспородных крысах массой тела 180-220 г питомника лабораторных животных «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). На проведение исследования получено разрешение локального независимого Этического комитета при Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова (протокол № 172 от 22.03.2016 г).
В исследовании применялись:
– оксид углерода: для моделирования острого тяжелого отравления (концентрация СО – 0,8 LC50, экспозиция 30 мин);
– фармакологические препараты: кислород, ацизол, синтетический аналог тафцина, дельтакон, пептид КК1, семакс;
– четыре схемы применения препаратов при отравлении СО: монотерапия кислородом, комбинированная терапия кислородом и ацизолом, монотерапия нейропептидом, терапия кислородом и нейропептидом.
Изучение эффективности препаратов, применяемых для профилактики нарушения функций ЦНС после тяжелой интоксикации СО, проходило в несколько этапов.
На первом этапе оценивали эффективность применения антидотов СО (кислород и ацизол) для предупреждения ранних и отдалённых нарушений функций ЦНС, вызванных интоксикацией СО.
На втором этапе исследования проводили сравнительную оценку эффективности применения нейропептидов (синтетический аналог тафцина, семакс, КК1 и дельтакон) после однократной оксигенотерапии для коррекции нарушений функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
Далее изучали возможные фармакологические механизмы действия пептида КК1 для предотвращения развития оксидативного стресса, активации апоптоза в головном мозге крыс в различные периоды после воздействия оксида углерода в дозе 0,8 LC50.
Впоследствии оценивали эффективность применения пептида КК1 по результатам морфологических исследований поля СА3 гиппокампа в отдалённом периоде острой тяжёлой интоксикации лабораторных животных оксидом углерода в дозе 0,8 LC50.
Моделирование острой тяжёлой интоксикации СО осуществлялось статическим методом в ингаляционной камере, концентрация СО составила 0,8 LC50 (4500±350 ppm), экспозиция 30 мин. Содержание СО и кислорода в камере контролировали при помощи газоанализатора ДАХ-М-03 («Аналит-Прибор», Россия).
Фармакологическая коррекция проводились с использованием препаратов: кислород (нормобарическую оксигенацию 30% кислородо-воздушной смесью осуществляли однократно в течение 30 мин непосредственно после интоксикации СО), ацизол (внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг, однократно), синтетический аналог тафцина (интраназально в дозе 0,5 мг/кг/сут, 5 дней), дельтакон (интраназально в дозе 50 мкг/кг/сут, 5 дней), тетрапептид КК1 (интраназально в дозе 40 мкг/кг/сут, 5 дней), семакс (интраназально в дозе 3 мг/кг/сут, 5 дней).
У животных во время и после окончания интоксикации оценивали выживаемость, общее состояние, двигательную активность, неврологический статус, состояние когнитивных функций. Выживаемость оценивали при 21-суточном наблюдении и выражали её в процентах по отношению к общему числу животных в группе. Двигательную активность оценивали при помощи тестирования животных на установке «Открытое поле» на 1 и 7 сут после интоксикации. Оценку неврологического статуса проводили посредством исследования тактильно-болевой чувствительности и положения тела животного в пространстве после интоксикации.
Для оценки пространственной памяти у предварительно обученных животных исследовали воспроизведение условного рефлекса поиска пищи (УРПП) на установке «Восьмилучевой радиальный лабиринт» на 1, 7, 14 и 21 сут после интоксикации СО в дозе 0,8 LC50. Для оценки обучаемости у предварительно необученных животных вырабатывали условный рефлекс активного избегания (УРАИ) плаванием начиная с 7 сут интоксикации в течение 5 дней [Буреш Я.И. и др., 1991].
Оценку содержания HbCO в крови лабораторных животных проводили спектрофотометрическим методом непосредственно после воздействия СО, а также через 30, 60 и 90 мин после окончания интоксикации [Крамаренко В.Ф. и др., 1974].
Концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ) определяли по методике G.L. Ellman (1959). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по методу М. Uchiyama (1978). Активность глутатионпероксидазы (ГП) определяли по методу А.Н. Гавриловой (1986). Содержание общего белка определяли биуретовым методом на биохимическом анализаторе BS 120 («Mindray», Китай). Исследуемые показатели определяли в гомогенатах головного мозга крыс на 1, 7 и 21 сут после тяжёлой интоксикации СО в дозе 0,8 LC50.
Содержание маркеров апоптоза (протеинкиназа Akt1 и белок р53) определяли в гомогенатах головного мозга крыc на 1, 7 и 14 сут после воздействия СО в дозе 0,8 LC50. Анализ образцов проводили на иммунофлуоресцентном анализаторе Bio-Plex 200 («Bio-Rad», США) в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России.
На 21 сут после интоксикации животные были подвергнуты эвтаназии и вскрытию черепной коробки. Полученный препарат, после дополнительного извлечения гиппокампа, проводили по стандартной методике, с помощью санного микротома изготавливали серийные гистологические срезы толщиной 3-5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и крезиловым фиолетовым по Нисслю. Исследование микропрепаратов проводили при помощи светооптического микроскопа МИКМЕД-6 («Аналит-Нева», Россия) при увеличении 200 и 400.
Данные, полученные в ходе экспериментальных исследований, были обработаны в программе «Statistica 6.0» с расчетом среднего значения и среднего квадратического отклонения. Оценку различий средних значений проводили с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Вероятность p0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. При остром тяжёлом отравлении крыс оксидом углерода нарушения
пространственной памяти развиваются как в раннем, так и в отдалённом периоде, а
нарушения обучаемости - только в отдалённом периоде интоксикации.
-
Совместное лечебное применение кислорода и синтетического тетрапептида КК1 приводит к восстановлению пространственной памяти и нормализации обучаемости лабораторных животных при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода.
-
Механизм нейропротекторного действия пептида КК1 связан со способностью препарата активировать систему антиоксидантной защиты клетки и препятствовать развитию апоптоза.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности
определяется адекватными токсикологическими, фармакологическими и
физиологическими методами исследования, рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.
Апробация результатов исследования проведена в ходе докладов на
Всероссийской конференции с международным участием «Инновации в
фармакологии: от теории к практике» (Санкт-Петербург, 2014); Российской научной
конференции с международным участием «Медико-биологические проблемы
токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2015); Российской
научной конференции «Фармакология экстремальных состояний», посвящённой
150-летию Н.П. Кравкова (Санкт-Петербург, 2015); II Всероссийской научной
конференции молодых учёных «Медико-биологические аспекты химической
безопасности» (Санкт-Петербург, 2015); VII Всероссийской научно-практической
конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора «Современные
проблемы эпидемиологии и гигиены» (Санкт-Петербург, 2015); Учредительном
съезде регионального Северо-Западного отделения федерации анестезиологов и
реаниматологов «Сообщество анестезиологов-реаниматологов Северо-Запада РФ»
(Санкт-Петербург, 2015); Всероссийской научно-практической
конференции, посвящённой 125-летию кафедры клинической биохимии и
лабораторной диагностики и 95-летию академика А.Н. Климова «Лабораторная диагностика в решении проблем современной клинической медицины» (СПб, 2015).
Реализация результатов исследования. Полученные теоретические и
практические результаты реализованы в учебном процессе кафедры военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова. В процессе выполнения работы оформлено и принято к использованию 6 рационализаторских предложений.
Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова: тема НИР № VMA.02.02.06.1618/0067, шифр «Пептид».
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 16 научных работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.
Личный вклад автора. Автором проведён сбор и анализ литературы по теме диссертационного исследования, сформулированы цель и задачи исследования, определены объекты и объём работы, проведён поиск методов и их обоснование для решения поставленных задач. Выполнены эксперименты по моделированию острой интоксикации СО, а также фармакологической коррекции этого состояния у лабораторных животных. Сформирована база данных и осуществлена статистическая обработка полученных результатов, проведено их обобщение и обсуждение, выполнено оформление диссертации, подготовлены публикации по теме диссертации. Доля участия автора в получении и накоплении результатов – 100%, в статистической обработке – 100%, в проведении гистологических исследований – 60%, биохимических исследований – 100%, исследовании содержания маркеров апоптоза – 50%.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 7 рисунков. Состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций и библиографического списка литературы, включающего 198 источников (67 – на русском языке и 131 – на иностранных языках).
Патоморфологические и гистологические изменения структур головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
Оксид углерода был впервые получен французским химиком Жаком де Лассоном в 1776 г. при нагревании оксида цинка с углём, но первоначально его ошибочно приняли за водород, так как он сгорал синим пламенем.
Оксид углерода – газ, который не имеет ни вкуса, ни цвета, ни запаха, с чем связана трудность его обнаружения органами чувств. Он образуется при неполном сгорании углеродсодержащих соединений [41, 159].
Интоксикация СО наиболее часто развивается на пожаре [49, 73]. Интоксикация СО актуальна не только для гражданского населения, но и для военнослужащих [22]. В ходе боевых действий личный состав Вооруженных Сил может попадать в зоны пожаров, сформировавшихся после применения, как обычных видов оружия, так и оружия массового поражения [22]. Военнослужащие могут выполнять свой профессиональный долг в сложных ситуациях, вызванных применением боевых дымов и маскирующих аэрозолей, а также подвергаться воздействию огнесмесей [10].
Сохраняется высокий риск поражений военнослужащих на пожарах и в мирное время из-за нарушения противопожарного режима и аварийных ситуаций, сопровождающихся возгоранием. Так, например, из опыта эксплуатации надводных кораблей и подводных лодок ведущих морских держав хорошо известно о крупных пожарах, сопровождавшихся массовым отравлением и гибелью членов экипажей [64].
Другими причинами острого отравления угарным газом могут быть: неправильная эксплуатация отопительных систем [61], воздействие вредных факторов производства [49], совершение суицидальных попыток [172] и др. Поступает оксид углерода в организм ингаляционным путём, легко преодолевая аэрогематический барьер. Токсический эффект для человека наблюдается при вдыхании воздуха с концентрацией СО, равной 0,1–0,12 об.% в течение одного часа. Скорость поступления оксида углерода в организм прямо пропорциональна парциальному давлению СО во вдыхаемом воздухе и экспозиции и обратно пропорциональна парциальному давлению кислорода во вдыхаемом воздухе [61]. По мере увеличения концентрации яда в крови скорость резорбции замедляется [41]. Исследования по токсикокинетике оксида углерода свидетельствуют, что после прекращения вдыхания СО 60–70% яда выделяется из организма в течение одного часа [49]. За 4 ч удаляется 96% адсорбированного организмом количества СО. В клинических условиях, независимо от тяжести отравления, находящийся в крови оксид углерода полностью выводится в течение 12 ч после прекращения контакта с ядом [49].
Важнейшими факторами, влияющими на процесс выведения СО из организма, являются парциальное давление оксида углерода и кислорода во вдыхаемом воздухе, величина вентиляции и состояние аэрогематического барьера, интенсивность кровообращения [41]. Увеличение парциального давления кислорода и повышение давления вдыхаемого воздуха приводит к ускорению диссоциации карбоксигемоглобина и скорейшей элиминации СО из организма [118]. Также скорость диссоциации HbCО увеличивается пропорционально увеличению содержания диоксида углерода во вдыхаемой газовой смеси (эффект Бора) [61]. Экскретируется оксид углерод в основном через дыхательные пути, в ничтожном количестве СО выделяется через кожу 0,007 мл/ч, несколько больше через желудочно-кишечный тракт и почки [49, 148].
Основными мишенями токсического действия СО в организме являются гемопротеины, содержащие двухвалентное железо (Fe2+) [106]. К ним относятся гемоглобин (Hb), миоглобин, нитрооксидсинтетаза, каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза (цит аа3), цитохром Р450, растворимая гуанилатциклаза (рГЦ), триптофан диоксигеназа и др. Взаимодействие оксида углерода происходит с Fe2+-сайтами этих белков [192]. Связывание оксида углерода с гемопротеинами приводит к ингибированию их функции [134]. Исключение составляет рГЦ, которая активируется при взаимодействии с оксидом углерода [134]. Также оксид углерода связывается с протеинами, содержащими другие металлы в активном центре, например медь, что также приводит к изменению их функциональной активности [192].
Основное действие СО на организм связано с его взаимодействием с гемоглобином и образованием карбоксигемоглобина, неспособного транспортировать кислород [49, 157]. Образование HbCО начинается уже в лёгочных капиллярах с периферии эритроцитов при минимальной концентрации СО в воздухе. По мере увеличения содержания оксида углерода во вдыхаемом воздухе, HbCО образуется не только в периферических, но и в центральных отделах эритроцита [49]. Гемоглобин способен связывать кислород и оксид углерода. При этом сродство гемоглобина к СО в 250-300 раз больше чем к кислороду. Однако связывание СО с гемоглобином происходит в 10 раз медленнее, чем с кислородом, а диссоциация карбоксигемоглобина протекает в 3600 раз медленнее, чем диссоциация оксигемоглобина. По этой причине HbСО очень быстро накапливается в крови, даже при сравнительно небольшом содержании СО во вдыхаемом воздухе [41, 61, 157]. Помимо этого, при взаимодействии СО и гемоглобина происходят конформационные изменения молекулы последнего, что приводит к затруднению диссоциации оксигемоглобина и уменьшению отдачи кислорода тканям (эффект Холдена) [41, 49, 61]. Вследствие структурного сродства с Hb, миоглобин реагирует с оксидом углерода подобным же образом [61]. Сродство миоглобина к СО в 50 раз больше, чем к кислороду. Соединяясь с миоглобином, оксид углерода образует карбоксимиоглобин, тем самым выключая миоглобин из постоянного ритмичного снабжения мышц кислородом. При достижении концентрации карбоксимиоглобина свыше 20-25% происходит значительное снижение интенсивности окислительного фосфорилирования в миоцитах, что приводит к развитию тканевой гипоксии в мышцах [41, 159].
Определение концентрации карбоксигемоглобина в крови лабораторных животных
Животных содержали в условиях вивария не более чем по 6 голов в клетке. Кормление животных осуществляли один раз в сутки в первой половине дня, доступ животных к стандартному гранулированному корму и воде не ограничивался (режим питания – ad libitum), за исключением создания частичной пищевой депривации во время выработки и воспроизведения условного рефлекса поиска пищи (УРПП). За одни сутки до начала ингаляции токсиканта животных не кормили. Перед проведением каждого эксперимента животные находились под наблюдением (в карантине) в течение не менее 14 сут. После окончания карантина крыс распределяли на группы методом рандомизации, больных и ослабленных животных в исследование не включали.
При проведении исследования выполняли требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному отношению к ним [21, 28].
На проведение экспериментального исследования получено разрешение локального независимого Этического комитета при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (протокол № 172 от 22.03.2016 г).
Моделирование острого тяжёлого отравления лабораторных животных оксидом углерода осуществляли статическим методом с использованием герметичной затравочной камеры объёмом 0,1 м3.
Оксид углерода получали химическим способом, путём разложения муравьиной кислоты в присутствии концентрированной серной кислоты при нагревании в аппарате Киппа [32]. В качестве токсикометрического параметра определяли среднесмертельную концентрацию оксида углерода, поскольку она представляет собой наиболее точную количественную характеристику токсичности вещества с минимальным значением 95% доверительного интервала и несомненным оцениваемым эффектом (гибель животного) [37]. Среднесмертельную концентрацию вычисляли с помощью табличного экспресс-метода В.Б. Прозоровского [53].
Для моделирования тяжёлой степени интоксикации была выбрана концентрация СО равная 0,8 LC50, экспозиция составила 30 мин. Концентрацию СО и кислорода в затравочной камере определяли с помощью газоанализатора ДАХ-М-03 («Аналит-Прибор», Россия) Для поглощения углекислого газа и воды, выделяемых животными при дыхании, в затравочную камеру помещалась кювета с гидроксидом калия.
Для верификации степени тяжести интоксикации спектрофотометрическим методом определяли содержание карбоксигемоглобина в крови лабораторных животных в различные сроки после интоксикации [42].
Наблюдение за животными проводили до воздействия СО и в течение 21 сут после интоксикации. Для оценки неврологического статуса у животных исследовали следующие показатели: общее состояние животных, тактильно-болевую чувствительность, двигательную активность и положение тела в пространстве, потребление пищи и воды. Состояние функций ЦНС у лабораторных животных оценивали путём выработки и воспроизведения условного рефлекса поиска пищи на установке «Восьмилучевой радиальный лабиринт» и выработки условного рефлекса активного избегания (УРАИ) плаванием [13].
Для оценки морфологических изменений структур ЦНС выполняли гистологическое исследование поля СА3 гиппокампа в отдалённом периоде острой тяжёлой интоксикации СО (на 21 сут).
Для оценки апоптотических процессов в ЦНС исследовали содержание маркеров апоптоза в гомогенатах головного мозга крыс на 1, 7 и 14 сут острой тяжёлой интоксикации СО. Для оценки состояния системы антиоксидантной защиты клетки (система глутатиона) и уровня перекисного окисления липидов производили биохимическое определение концентрации ВГ, активности глутатионпероксидазы, концентрации малонового диальдегида в гомогенатах головного мозга крыс на 1, 7 и 21 сут острой тяжёлой интоксикации СО.
Коррекция нарушений функций ЦНС при острой тяжёлой интоксикации СО проводилась с использованием следующих фармакологических средств: кислород, ацизол, синтетический аналог тафцина, синтетический аналог дельта-сон-индуцирующего пептида (дельтакон), синтетический тетрапептид КК1, семакс. Выбор доз и схем введения исследованных препаратов был осуществлён на основании анализа данных литературы.
Кислород – антидот оксида углерода. Механизм действия при интоксикации СО основан на более быстрой диссоциации HbCO и скорейшей элиминации оксида углерода из организма. Нормобарическую оксигенацию 30% кислородо-воздушной смесью осуществляли однократно в герметичной камере в течение 30 мин непосредственно после интоксикации СО.
Ацизол – комплексное цинкорганическое соединение (бис-(1-винилимидазол)цинкдиацетат). Препарат использовался в форме раствора для инъекций. Механизм действия основан на снижении сродства Hb к оксиду углерода, улучшении кислородосвязывающих и газотранспортных функций крови. Производитель – «Макизфарма» (Россия). Ацизол вводился однократно внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг непосредственно после окончания интоксикации СО.
Синтетический аналог тафцина – тетрапептид (Thr-Lys-Arg-Arg). Производитель – «НПЦ Дельта» России. Препарат использовался в форме 1% раствора. Синтетический аналог тафцина вводили интраназально в дозе 0,5 мг/кг/сут в течение 5 дней, первое введение осуществляли непосредственно после окончания кислородотерапии.
Дельтакон - препарат содержит дельта-сон индуцирующий пептид. Состав: 0,3 мг ДСИП, 10 мг глицин и 1 мг карнозин. Произведен научно исследовательским центром «Комкон» (Россия). Дельта-сон-индуцирующий пептид синтетический нонапептид (Trр-Аlа-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu), обладающий выраженным стресс-протективным, нейропротективным и адаптогенным действием. Препарат использовался в форме 1% раствора. Дельтакон вводили интраназально в дозе 50 мкг/кг/сут в течение 5 дней, первое введение осуществляли непосредственно после окончания кислородотерапии.
Синтетический тетрапептид КК1 - аналог последовательности фрагмента адренокортикотропного гормона (Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide), обладающий церебропротективными и антиамнестическими свойствами. Производитель – ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России. Препарат использовался в форме 1% раствора. Тетрапептид КК1 вводили интраназально в дозе 40 мкг/кг/сут в течение 5 дней, первое введение осуществляли непосредственно после окончания кислородотерапии. Семакс – оригинальный синтетический пептидный препарат, являющийся аналогом фрагмента АКТГ (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), обладающий ноотропным, психостимулирующим и нейропротекторным действием. В экспериментах использовали семакс в виде 1% раствора назальных капель производства закрытого акционерного общества «Инновационный научно-производственный центр «Пептоген» (Россия). Семакс вводили интраназально в дозе 3 мг/кг/сут течение 5 дней, первое введение осуществляли непосредственно после окончания кислородотерапии.
Влияние нейропептидов на клинические проявления острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
Для определения влияния исследуемых антидотов на содержание карбоксигемоглобина в крови лабораторных животных, исследовали его концентрацию через 30, 60 и 90 мин после интоксикации СО (табл. 4).
В опытной (СО) группе животных содержание HbCO непосредственно после окончания интоксикации составило 69,71±2,31%, через 60 мин снизилось почти в два раза (32,82±0,75%), через 90 мин более чем в два раза, что согласуется с данными литературы о токсикокинетике оксида углерода [41, 61].
В группе животных, получавших монотерапию кислородом, содержание карбоксигемоглобина в крови через 30, 60 и 90 мин после окончания интоксикации было значимо (p0,05) ниже, чем в опытной (СО) группе. Такая же динамика наблюдалась и при лечебном применении комбинации ацизола и кислорода. Таблица 4 – Содержание карбоксигемоглобина в крови крыс в различные сроки после тяжелого отравления СО (0,8 LC50, 30 мин), % (М±mх)
В результате проведенного исследования было показано, что однократное лечебное применение антидотов СО приводило к значимому (p0,05) снижению содержания HbCO уже через 30 мин после окончания интоксикации. Наблюдалось сокращение времени восстановления исследуемых неврологических показателей. Оценка общей двигательной активности у крыс на 1 и 7 сут после интоксикации не выявила значимых различий между животными опытной (СО) группой и группами животных, получавших антидоты.
Влияние кислорода и ацизола на сохранность пространственной памяти и обучаемость при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода Дополнительно проводили оценку возможности предотвращения когнитивных нарушений у животных при острой тяжёлой интоксикации СО применением средств антидотной терапии. Память у лабораторных животных оценивали на установке «Восьмилучевой радиальный лабиринт». До начала интоксикации животных предварительно обучали, а затем через 24 ч подвергали контрольному тестированию. В результате контрольного тестирования было продемонстрировано, что количество ошибок референтной и рабочей памяти у животных исследуемых групп значимо не различалось (табл. 5, 6).
Из таблицы 5 следует, что однократное лечебное применение кислорода и однократное применение комбинации ацизола (60 мг/кг) и кислорода при острой тяжёлой интоксикации СО не приводило к значимому снижению количества ошибок референтной памяти на 1, 7 и 14 сут после интоксикации по сравнению с опытной (СО) группой.
Таблица 5 – Число ошибок референтной памяти, оцененных на установке «Восьмилучевой радиальный лабиринт» у предварительно обученных крыс при тяжёлом отравлении СО (0,8 LC50, 30 мин), отн. ед. (М±mх)
При оценке количества ошибок рабочей памяти (табл. 6) видно, что однократное применение кислорода и его комбинации с ацизолом не снижало их количества по сравнению с опытной (СО) группой животных на 1, 7 и 14 сут после интоксикации. Таблица 6 – Число ошибок рабочей памяти, оцененных на установке «Восьмилучевой радиальный лабиринт» у предварительно обученных крыс при тяжёлом отравлении СО (0,8 LC50, 30 мин), отн. ед. (М±mх)
В результате проведённого исследования было установлено, что однократное лечебное применение антидотов (кислорода и его комбинации с ацизолом) способствует более быстрому регрессу клинической картины интоксикации, снижению содержания HbCO. Однако их использование было малоэффективно для предотвращения нарушения пространственной памяти, как в раннем, так и в отдалённом периоде после воздействия СО и не приводило к нормализации обучаемости лабораторных животных в отдалённом периоде интоксикации. Исходя из полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод, что при острых тяжелых интоксикациях СО на фоне однократного применения антидотов целесообразно проводить коррекцию когнитивных нарушений, которые могут развиваться как в раннем, так и в отдаленном периоде.
В предыдущих разделах работы показано, что однократное применение антидотов СО не приводит к полной нормализации когнитивных функций после тяжёлой интоксикации. Применение этих антидотов должно сочетаться с другими средствами терапии, обладающими нейропротективными механизмами действия. Было выдвинуто предположение, что в качестве таких средств могут быть использованы нейропептиды, обладающие высокой эффективностью и безопасностью, удобством применения на этапах оказания медицинской помощи. Среди нейропептидов были выбраны следующие препараты: синтетический аналог тафцина, семакс, дельтакон и пептид КК1. Для оценки эффективности этих препаратов в лечении острых тяжёлых отравлений СО изучали клиническую картину интоксикации, поведение животных, содержание карбоксигемоглобина в крови и их влияние на двигательную активность животных.
В течение всего периода наблюдения (21 сут) после интоксикации поведение животных (потребление воды и пищи, груминг, исследовательская активность), получавших исследуемые препараты, не отличалось от опытной (СО) группы животных. Более того, с конца первых суток после интоксикации оно не отличалось от животных контрольной группы.
Для оценки влияния изучаемых нейропептидов (применение в монотерапии, однократно интраназально непосредственно после окончания интоксикации) на скорость диссоциации карбоксигемоглобина, исследовали содержание деривата гемоглобина в крови лабораторных животных через 90 мин после окончания интоксикации СО. Показано, что концентрация HbCO не отличалась (p0,05) от его содержания у животных, опытной (СО) группы (рис. 3).
Влияние пептида КК1 на процессы перекисного окисления липидов в тканях головного мозга при острой тяжёлой интоксикации оксидом углерода
Важно отметить, что применение монотерапии пептидом КК1 и его применение на фоне однократной нормобарической оксигенации приводило к однонаправленным изменениям содержания активной формы протеинкиназы Akt1 и белка р53, что подтверждает ведущую роль пептида КК1 в этих изменениях.
Полученные экспериментальные результаты об антиапоптотическом механизме действия пептида КК1 согласуются с данными литературы. Так, в экспериментальной модели реперфузионного повреждения головного мозга у крыс, было выявлено выраженное снижение уровня фрагментированной дезоксирибонуклеиновой кислоты при лечении пептидом КК1 [92]. Результаты проведённых экспериментов позволяют сделать предположение, что потенциальный механизм нейропротеткивного действия синтетического тетрапептида КК1 связан с активацией антирадикальной защиты клетки и ограничением развития апоптоза в головном мозге крыс, что подтверждается данными биохимических исследований.
Для оценки влияния пептида КК1 на патоморфологические изменения структур ЦНС проводили гистологическое исследование поля СА3 гиппокампа лабораторных животных на 21 сут после острой тяжёлой интоксикации СО. Выбор указанной зоны для исследования был обусловлен тем, что поле СА3 гиппокампа играет важную роль в реализации когнитивных функций [15] и наиболее подвержено повреждению при интоксикации СО [189].
Гиппокамп является структурным образованием лимбической системы, ответственным за процессы памяти и обучаемости [15, 110]. В нашем исследовании было выявлено, что интоксикация СО приводила к нарушению гистоархитектоники поля СА3 гиппокампа. Так, при микроскопическом исследовании срезов гиппокампа, полученных на 21 сут после интоксикации СО, отмечались, как качественные, так и количественные признаки повреждения. Качественные признаки повреждения были представлены грубыми необратимыми нарушениями групп нейронов в виде интенсивного гиперхроматоза, а также очагового хроматолиза. Отмечалась выраженная перифокальная реакция микроглии вокруг многочисленных клеток-теней (рис. 6). Удельное количество повреждённых нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы увеличивалось более чем в 4 раза в сравнении с контрольными животными. Полученные результаты соответствуют данным литературы о повреждающем действии СО на гиппокамп. Так, разными авторами установлено, что острое отравление СО приводит к интенсивной дегенерации пирамидных нейронов поля СА3 гиппокампа [187, 189]. Причём эти изменения наблюдаются в отдалённом периоде интоксикации [189]. Такие патологические изменения могут приводить к нарушению формирования долговременных изменений синаптической пластичности в клетках гиппокампа, которая лежит в основе обучения и памяти [110].
Лечебное применение тетрапептида КК1 было эффективно для предупреждения структурных изменений поля СА3 гиппокампа в отдалённом периоде интоксикации СО. Так было обнаружено, что удельное количество повреждённых нейроцитов с глыбчатым гиперхроматозом цитоплазмы уменьшалось более чем в два раза в сравнении с опытной (СО) группой. Качественные признаки повреждения характеризовались наличием единичных нейронов с глыбчатым гиперхроматозом цитоплазмы, единичных клеток-теней, умеренной реакцией микроглии (рис. 7). Таким образом, лечебное применение синтетического тетрапептида КК1 приводило к восстановлению гистоархитектоники поля СА3 гиппокампа в отдалённом периоде интоксикации. Сохранение исходной структуры гиппокампа способствует восстановлению процессов синаптической пластичности, которые играют важную роль в реализации когнитивных функций [110].
Протективное действие пептида КК1 на структуру гиппокампа при остром тяжёлом отравлении оксидом углерода может быть обусловлено наличием у него антиоксидантного и антиапоптотического механизмов действия. В результате проведённого исследования наиболее эффективным нейропротективным препаратом, среди изученных в данной работе, оказался синтетический тетрапептид КК1. Пептид КК1 является структурным аналогом последовательности фрагмента адренокортикотропного гормона (Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide), характеризующимся наличием четырёх положительных зарядов. Данный пептид обладает повышенной устойчивостью по отношению к протеазам сыворотки крови, что может обеспечивать его стабильную концентрацию в крови и головном мозге [60]. Помимо ограничения оксидативного повреждения [60] и инактивации запуска апоптотической гибели клетки [26, 92] в литературе описаны другие механизмы нейропротективного действия синтетического тетрапептида КК1.
Церебропротективное действие препарата может быть объяснено его антигипоксантными свойствами. Так, было установлено, что при интраназальном введении пептид КК1 увеличивает выживаемость животных в модели острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу (билатеральная каротидная окклюзия) [25, 26]. Также препарат снижает токсическое действие этанола, уменьшая время наркотического сна [23, 54]. Помимо этого пептид КК1 корригирует нарушения мозгового и системного кровотока, возникающие при ишемии головного мозга с последующей реперфузией [60]. Тетрапептид КК1 обладает стимулирующим влиянием на холинергические процессы в головном мозге [27, 60]. Пептид КК1 нормализует уровень провоспалительных цитокинов (IL-1 и TNF-), рилизинг которых, характеризуется оверэкспрессией при ишемии головного мозга и коррелирует с выраженностью воспалительной реакции, возникающей в очаге ишемического повреждения. При этом пептид КК1 повышает содержание противовоспалительного интерлейкина-4 в головном мозге, являющегося прогностическим фактором положительной динамики церебральной ишемии [60, 92].