Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Исторический аспект в развитии методов аутогемотерапии 13
1.2. Применение тромбоцитарной аутоплазмы с лечебной целью. Различные методы 17
1.3. Свойства и функции тромбоцито в
1.3.1. Созревание тромбоцитов 21
1.3.2. Морфология тромбоцитов 22
1.3.3. Функции тромбоцитов 25
1.4. Общее понятие о факторах роста 31
1.4.1. Факторы роста тромбоцитов 32
1.5. Видовые особенности анатомии кожи у животных 35
1.5.1. Анатомия кожи кроликов 35
1.5.2. Анатомия кожи лошади .36
1.5.3. Анатомия кожи коровы 37
1.6. Биология раневого процесса у животных 38
1.6.1. Видовые особенности раневого процесса у животных .45
ГЛАВА 2. Организация, материалы и методы исследований ...52
2.1. Организация исследований 52
2.2. Приготовление тромбоцитарной аутоплазмы методом «Плазмолифтинг-Анимал» .53
2.3. Протоколы применения тромбоцитарной аутоплазмы, приготовленной методом «Плазмолифтинг – Анимал», с лечебной целью у кроликов, лошадей и коров .54
ГЛАВА 3. Результаты исследований .58
3.1. Влияние тромбоцитарной аутоплазмы, полученной методом «Плазмолифтинг – Анимал», на изменение площади экспериментальных ран у животных 59
3.1.1. Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на изменение площади экспериментальных ран у кроликов в процессе заживления 59
3.1.2. Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на изменение площади экспериментальных ран у лошадей в процессе заживления 62
3.2. Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на течение раневого процесса у разных видов животных 63
3.2.1. Описание раневого процесса у кроликов при использовании монотерапии ТАП .63
3.2.2. Описание раневого процесса при моно- и комплексной терапии ран у кроликов 71
3.2.3.Описание раневого процесса у лошадей после применения тромбоцитарной аутоплазмы 75
3.2.4. Описание раневого процесса у крупного рогатого скота на этапах лечения 82
3.3.Термографическое исследование раневой поверхности у животных на этапах лечения с использованием тромбоцитарной аутоплазмы 86
3.3.1.Термографическое исследование раневой поверхности у кроликов при монотерапии тромбоцитарной аутоплазмой 86
3.3.2.Термографическое исследование раневой поверхности у кроликов при моно- и комплексной терапии ТАП .87
3.3.3.Термографическое исследование раневой поверхности у лошадей при комплексной терапии с использованием ТАП 89
3.3.4. Термография поверхности язв в области тарсального сустава у коров при применении ТАП 91
3.4. Биохимические исследования некоторых показателей крови разных видов животных при применении ТАП
3.4.1.Результаты биохимических исследований крови кроликов при введении ТАП .92
3.4.2.Результаты биохимических исследований крови лошадей при введении ТАП .94 3.4.3.Результаты биохимических исследований крови крупного рогатого скота
при введении ТАП 95
3.5. Результаты морфологического исследования тканей раны у животных при
воздействии тромбоцитарной аутоплазмы .97
3.5.1.Морфологические исследования ран у кроликов при лечении их ТАП 97
3.5.2. Морфологическое исследование тканей раны у лошадей в процессе лечения с применением тромбоцитарной аутоплазмы 101
3.6. Иммуногистохимическое исследование биоптатов раневой поверхности у лошадей при использовании ТАП .111
3.7. Цитологическое исследование раневой поверхности у лошадей при использовании ТАП 117
4. Обсуждение полученных результатов 121
Выводы .130
Практические рекомендации .133 перечень сокращений 134
Список литературы
- Свойства и функции тромбоцито
- Протоколы применения тромбоцитарной аутоплазмы, приготовленной методом
- Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на течение раневого процесса у разных видов животных
- Иммуногистохимическое исследование биоптатов раневой поверхности у лошадей при использовании ТАП
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Изучение процессов заживления язв и ран у животных различной этиологии, а также разработка эффективных средств лечения, ускоряющих регенерацию тканей, являются актуальной проблемой ветеринарной медицины (Шакалов К.И.,1972,1987, Тимофеев С.В., Гимранов В.В., 2005, Семенов Б.С., Суховольский О.К., Рыбин Е.В., 2006, Семенов Б.С., Стекольников А.А., Веремей Э.И., 2013, Haskell M.J., Rennie L.J., Bowell V.A., Bell M.J., Lawrence A.B., 2006, Cook N.B., Nordlund K.V., 2009,Chapinal N., von Keyserlingk M.A., Cerri R.L., Ito K., Leblanc S.J., Weary D.M.,2013).
Болезни конечностей крупного рогатого скота составляют от 10 до 60 % от общего поголовья при различных условиях содержания. Технологический травматизм конечностей у коров, как правило, отмечается в хозяйствах с промышленным типом содержания. Хромота, наличие воспаления, язвы, раны конечностей приводят к уменьшению продуктивности и плодовитости молочных коров, выбраковке животных, увеличению расходов на лечение, что в результате ведет к экономическому ущербу, снижению рентабельности производства (Мищенко В.А., 2007, Рыжаков А.В., 2008, Тимофеев С.В. с соавт., 2009, Гимранов В.В. с соавт., 2010, Руколь В.М., 2011, Марьин Е.М. с соавт., 2012, Самоловов А.А., 2013, Семенов Б.С. с соавт, 2013, Барашкин М.И. с соавт., 2014, Елисеев А.Н. с соавт., 2015, Стекольников А.А. с соавт., 2015).
Травматизм лошадей в условиях конюшен связан с их форсированным тренингом, неправильным подбором амуниции или с травмами гериатрических лошадей, полученными в результате неадекватного тренинга или по случайности (Гуревич Д.Я. с соавт., 1991, Красников А.С., Хотов В.Х., 1995, Свечин К.Б. с соавт., 1992, Семенов Б.С. с соавт., 2007, Роб ван Нассау, 2009, Сапожков Е.В., 2010).
Мелкие домашние животные (кошки и собаки) нередко подвержены ранениям, которые могут представлять опасность для их здоровья и жизни. Повреждения кожных покровов могут быть следствием болезней кожи: экземы, дерматиты, микозы, бактериальные инфекции, аллергии и т.д. (Герке А.Н., 2013, 2015, Патерсон С., 2014, 2016) и воздействием кожных паразитов - блох, вшей, клещей, власоедов (Мюллер Георг, 1992, Петраков К.А., Саленко П.Т., Панинский С.М., 2001, Руппель В.В., 2013, 2015), а также кровепаразитов (Вольберг А.С. с соавт., 2008, Rossi M.A. et al.,2015).
Повреждения кожи характеризуются нарушением ее анатомической целостности, возможностью проникновения патогенных агентов, наличием дискомфорта у животного. Следовательно, разработка новых эффективных средств и методов лечения, позволяющих максимально снизить сроки заживления поврежденных тканей у животных, при этом обладающих минимальным числом побочных эффектов, является актуальной проблемой ветеринарной медицины. При решении этого вопроса не последнюю роль играет экономическая эффективность и затраты труда на лечение животных.
Аутогемотерапия – введение пациенту собственной крови подкожно или внутримышечно. Применение собственной крови с лечебной целью было положено хирургом А. Биром в 1905 г. В дальнейшем использование крови нашло отражение в работах многих выдающихся ученых, таких как А. Лэвен (1923), В.Ф. Войно-Ясенецкий (2000) и другие. В современной гуманной и ветеринарной медицине применение аутогемотерапии при различных патологиях обусловлено положительными эффектами, которые выражаются в активации защитных сил организма, ускорении регенерации поврежденных тканей, повышении работоспособности (Заяц Л.Ф., 1953, Милаев В.Б., 2000, Копенкин Е.П., 2000, Шагаев Д.В., 2007, Кребс Х., 2010, Щербаков Г.Г., 2012).
Степень разработанности темы исследования. Как один из многих вариантов аутогемотерапии медицина сегодняшних дней предлагает использование тромбоцитарной аутоплазмы (Ахмеров Р.Р. с соавт., 2013, Li X. et. all., 2014, Ramos-Torrecillas J. et. all., 2015). Положительное влияние применения тромбоцитарной аутоплазмы при разнообразных патологиях связано с высвобождением из тромбоцитов биологически активных соединений, таких как факторы роста, медиаторы, лизоцим и другие (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008, Kon E., 2010, Lee K.S. et. all., 2011).
В большинстве случаев в практике используют плазму крови,
обогащенную тромбоцитами - platelet rich plasma или PRP-технологии (Everts
Peter A.M., 2006, Foster T.E. et. all., 2009, Мастыко А.Н. с соавт., 2012, Ачкасов
Е.Е. с соавт., 2013, Schneppendah J. et. all., 2015, Ho L.K. et. all., 2015). PRP
(platelet rich plasma) терапия применяется и в ветеринарной медицине (Ковач
М., 2013, Moraes A.P. et. all., 2015). Данный метод подразумевает введение
плазмы, которая содержит тромбоциты в количестве значительно
превышающем физиологические нормы.
Наряду с использованием для лечебных целей плазмы крови, обогащенной тромбоцитами, также используют аутоплазму с содержанием тромбоцитов в пределах физиологической нормы (Ахмеров Р.Р. с соавт. 2011, 2013).
Разработка эффективных доступных методов лечения для разных видов животных с применением тромбоцитарной аутоплазмы является актуальной задачей ветеринарной медицины. С учетом изложенного были сформулированы цели и задачи исследования.
Цели и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение
влияния тромбоцитарной аутоплазмы, полученной методом «Плазмолифтинг-
Анимал», на процессы заживления ран и язв у животных и разработка методов
применения тромбоцитарной аутоплазмы при лечении некоторых
хирургических болезней у животных.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) оценить воздействие тромбоцитарной аутоплазмы, полученной
методом «Плазмолифтинг - Анимал», на заживление экспериментальных ран у кроликов, ран у лошадей и язв тарсального сустава у коров;
-
провести термографическое исследование кожи и кожного дефекта (раны) при применении тромбоцитарной аутоплазмы у животных;
-
провести гистологическое, цитологическое и гистохимическое исследования биоптатов кожи и раневой поверхности при лечении ран тромбоцитарной аутоплазмой;
-
изучить влияние тромбоцитарной аутоплазмы на некоторые клинические и биохимические показатели крови у животных;
-
определить клиническую эффективность применения тромбоцитарной аутоплазмы, полученной методом «Плазмолифтинг-Анимал», при лечении ран и язв у животных.
Научная новизна. Изучено воздействие тромбоцитарной аутоплазмы,
приготовленной методом «Плазмолифтинг-Анимал», на заживление ран у
кроликов, лошадей и язв области тарсального сустава у крупного рогатого
скота, а также при некоторых патологиях кожи у мелких домашних животных.
Выявлено влияние тромбоцитарной аутологичной плазмы на ход раневого
процесса у животных. Полученные данные подтверждены морфологическим
исследованием. Проведено сравнение разных способов лечения ран у
животных: по общепринятым методам, с применением тромбоцитарной
аутоплазмы и при комплексной терапии. Выяснено влияние тромбоцитарной
аутологичной плазмы при ее подкожном и внутримышечном введении на
количество тромбоцитов и эритроцитов, концентрацию общего белка,
аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ),
лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинфосфокиназы (КФК) в крови у
подопытных животных. Установлено, что применение тромбоцитарной
аутоплазмы, полученной методом «Плазмолифтинг-Анимал», является
высокоэффективным, безопасным средством стимуляции регенерации
поврежденных тканей у животных и может использоваться как лечебно-профилактическое средство при лечении ран.
Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментально
обоснован и предложен новый высокоэффективный, безопасный и удобный в
применении метод лечения животных с ранами и язвами, основанный на
применении тромбоцитарной аутологичной плазмы, приготовленной с
использованием технологии «Плазмолифтинг-Анимал». На основании
проведенных исследований даны практические рекомендации по применению тромбоцитарной аутологичной плазмы при лечении животных с ранами и язвами. Результаты, полученные в данной работе, расширяют теоретические представления о ходе регенеративных процессов при повреждениях кожных покровов у животных, что обосновывает применение их в практической ветеринарной медицине.
Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований заключалась в разработке и обосновании применения тромбоцитарной аутоплазмы, полученной методом «Плазмалифтинг-Анимал», для лечения ран и язв у животных.
Для решения поставленных задач применялись следующие методы
исследования: анализ и обобщение литературных данных, адаптирование
технологии «Плазмалифтинг-Анимал» для работы в ветеринарной медицине,
фотосъемка, термография, а также клинические, биохимические,
морфометрические, гистологические, гистохимические, цитологические
методы исследования, методы математической статистики.
Положения, выносимые на защиту.
1.Применение тромбоцитарной аутоплазмы с лечебной целью,
полученной методом «Плазмалифтинг-Анимал», сокращает сроки заживления ран и язв у животных, сопровождается преобладанием регенеративных процессов, которые проходят в более короткие сроки.
2.Тромбоцитарная аутоплазма, полученная методом «Плазмалифтинг-Анимал», используемая в комплексном лечении ран и язв у животных, клинически эффективна.
Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации
используются в учебном процессе на кафедре акушерства и оперативной
хирургии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной
медицины, на кафедре хирургии и анатомии Курской государственной
сельскохозяйственной академии им. И.И. Иванова, на кафедре хирургии,
акушерства, фармакологии и терапии Ульяновской государственной
сельскохозяйственной академии им. П.А. Столыпина, на кафедре диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства Омского аграрного государственного университета им. П.А. Столыпина, на кафедре акушерства, гинекологии и биотехнологии размножения животных им. Я.Г. Губаревича и на кафедре общей, частной и оперативной хирургии Витебской ордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины, на кафедре ветеринарной хирургии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.
Личный вклад соискателя. Участие диссертанта заключалось в выборе
и обосновании темы диссертации, формировании плана исследований. Автор
осуществлял нанесение экспериментальных ран животным, выполнял
приготовление тромбоцитарной аутоплазмы методом «Плазмолифтинг -
Анимал» и введение ее животным согласно протоколам исследований,
проводил клиническое исследование животных, осуществлял взятие биоптатов
кожи с целью проведения морфологических, гистологических,
гистохимических и цитологических исследований и взятие проб крови для клинических и биохимических исследований, применял метод термографии раневой поверхности, оценивал состояние животных подопытной и контрольной групп.
Диссертант проанализировал полученный цифровой материал с помощью методов статической обработки. Автором было опубликовано 12 статей, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ, а также получено уведомление о регистрации заявки на патент (№ 2014138864).
Степень достоверности результатов проведенных автором исследований
обеспечивается использованием сертифицированного оборудования,
корректностью статистической обработки, воспроизводимостью результатов исследования. Востребованность результатов исследования подтверждена в условиях реального учебного процесса и клинической практики.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены, обсуждены и получили положительную оценку на Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2012, 2013, 2016); Международной научной конференции по вопросам ветеринарной хирургии «Инновации, достижения в профилактике и лечении хирургических болезней у животных» (Санкт-Петербург, 2013); третьем Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященном 25-летию проведения регулярных, ежегодных научно-практических форумов по ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации (Санкт-Петербург, 2014), четвертой Всероссийской конференции по ветеринарной хирургии (Москва, 2014), 3-ем Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии» (Санкт – Петербург, 2014), II Международном Ветеринарном Конгрессе VETISTANBUL GROUP – 2015 (Санкт-Петербург, 2015), 4-й Международной научной интернет-конференции «Биотехнология – взгляд в будущее» (Казань, 2015), на международной научно – практической конференции «Инновационное развитие АПК: Проблемы и перспективы» (Смоленск, 2015), 1-м Всероссийском семинаре «Здоровье лошади», Иппосфера – 2015 (Санкт-Петербург, 2015).
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, перечня сокращений, списка литературы, 2-х приложений. Основное содержание работы изложено на 161 странице компьютерного текста, иллюстрировано 3 диаграммами, 10 таблицами и 60 рисунками. Библиографический список состоит из 253 наименований, в том числе 60 работ на иностранных языках.
Свойства и функции тромбоцито
Попытки лечения кровью осуществлялись человечеством с древних времен. Лекари Древнего Египта, Китая, Индии, Греции, Рима применяли кровь животных и людей с лечебной целью. В большом медицинском папирусе Эберса (XVI век до н.э.), который был найден в 1872 г. в Фивах и назывался «Книга приготовления лекарств для всех частей тела», наряду с многочисленными рецептами содержится информация о том, что египетские фараоны обмазывались кровью, чтобы избежать проказы. Другой древнеегипетский папирус Смита (1550 г. до н.э.) предписывает прикладывание свежего мяса к только что зашитой ране (Risse G.B., 1972, Corleto L.M., 1993, Saber A., 2010). В руководстве даосистских врачей «Ней Кинг» (200 г. до н.э.) указывается, что прием собственной крови является высокоэффективным методом терапии. Также считалось, что создание гематом посредством щипания или уколов иглами способствовало исцелению при инфекционных заболеваниях и хронических патологиях (Ланнингер-Боллинг Д., 2001)
Первая обработка раны цельной кровью была проведена в 1867 г немецким врачом Шеде (Ахмеров Р.Р. ,2014). В 1905 году известный хирург Август Бир использовал метод создания искусственных гематом для заживления переломов (Юдин С.С., 1960). Его идея основывалась на наблюдении, что при наличии внутренних кровотечений переломы заживают быстрее, и заключалась в том, что собственная кровь пациента, введенная в бедро, представляет собой раздражающий агент, ускоряющий процессы заживления. А. Бир вводил больному кровь подкожно, создавая гематомы, и считал, что такой метод лечения способствует заживлению переломов (Ланнингер-Боллинг Д., 2001, Теличкин И., 2011).
В 1922 году Нурнеем аутогемотерапия была использована для лечения гонореи (Nourney A., 1923). Он инъецировал собственную кровь пациента в подкожную клетчатку при остром гонорейном уретрите в объеме 3-5 см3. Повторные инъекции проводились через 2-4 дня с повышением дозировки в 1,5-2 раза в зависимости от состояния пациента. Наилучший терапевтический эффект был получен при осложненных формах гонореи (эпидидимитах, простатитах и везикулитах), когда улучшение наступало спустя несколько часов после инъекции. Было отмечено, что под влиянием аутогемотерапии происходят изменения в составе крови пациентов: в первые сутки после инъекции наблюдали лейкоцитоз до 85 %, с дальнейшим снижением количества лейкоцитов до нормы к 3-4 суткам. Наступающий лейкоцитоз объясняли раздражением воспалительного очага, аутоинокуляцией и последующей аутоиммунизацией организма.
Немецкий хирург Левен (Lwen, 1923 г.) применял аутогемотерапию в хирургии для лечения острых гнойных воспалительных процессов. Левеном было предложено, наряду с широким разрезом, лечить посредством аутогемотерапии карбункулы на лице (губы, крылья носа). Для этой цели кровь больного повторно вводится по периферии очага под кожу в количестве от 20 до 40 см3ежедневно. Левен и другие авторы приводят ряд случаев полного излечения этого тяжелого, нередко кончающегося смертью, заболевания в результате применения такого комбинированного метода (разрез и аутогемотерапия).
Фердинанд Хофф в книге «Неспецифическая терапия и естественные защитные процессы» ("Unspezifische Therapie und naturliche Abwehrvorgange") особое внимание уделял действию крови при лечении ЛОР-заболеваний, ран, туберкулеза, лихорадки, прогрессивного паралича и других болезней (Hoff F., 1930).
Выдающийся российский хирург В.Ф. Войно-Ясенецкий в фундаментальном труде «Очерки гнойной хирургии», впервые изданном в 1934 году, утверждает, что результаты, полученные Левеном и другими врачами, были благоприятными при лечении фурункулов собственной кровью больного, так как удавалось избегать хирургического лечения. Также В.Ф. Войно-Ясенецким описаны методы аутогемотерапии и аутосеротерапии как вспомогательные при вялотекущих, рецидивирующих гнойных процессах и при длительно незаживающих ранах (Войно-Ясенецкий В.Ф.,2000).
Метод ступенчатой аутогемотерапии был разработан Гансом Генрихом
Рекевегом (Hans-Heinrich Reckeweg) (ReckewegH.-H., 1984, Реквег Г.-Г., 2000). В своих работах о гомотоксинах Рекевег Г.-Г. постулирует, что любые процессы жизнедеятельности, протекающие в организме человека, связаны с метаболическими преобразованиями. Любое вещество, токсичное для организма, является гомотоксином и отвечает за развитие патологических процессов (заболевание). Эти процессы проходят динамично, при этом гомотоксины и иные субстанции могут меняться под воздействием различных структур или сами изменять данные структуры. Рекевег Г.-Г. выделил стадии преобразований гомотоксинов (выведения, накопления, перерождения), а также фазы или зоны действия любого гомотоксина. Конечная цель заключается в освобождении организма от гомотоксинов и излечение от болезни (Реккевег Х.-Х., 2012 по Reckeweg H.H., 1955).
Г. Г. Рекевег разработал метод ступенчатой аутогемотерапии. Свое название метод получил из-за того, что кровь пациента в шприце смешивают с антигомотоксическим средством после чего вводят препарат в несколько этапов. Вследствие многоступенчатого разведения и смешивания с гомеопатическими препаратами токсины в крови пациента превращаются в эффективные гомеопатические средства – аутонозоды, которые усиливают дезинтоксикацию организма и способствуют излечению больного (феномен обратного действия малых концентраций, правило Арндта-Шульца). Приготовленные таким образом лекарственные формы вводят не только внутримышечно, но и в акупунктурные точки. Данный метод используется при лечении разного рода воспалительных процессов, для восстановления функций иммунной системы (Кремнёва Л.Ф., Козловская Г.В., Крылатова Т.А., 2014). Согласно Рекевегу кровь содержит многочисленные гемотоксины, при аутогемотерапии в результате разбавления они теряют свою токсичность и, выполняя функцию антидота, вызывают специфическую реакцию, содействующую саногенезу (Кребс Х., 2010). Существуют различные модификации ступенчатой аутогемотерапии по Рекевегу (Ланнингер-Боллинг Д., 2001). Данный метод применяют, как правило, в комплексной терапии для лечения многих патологий в гуманной медицине: при синдроме вегетативной дистонии с мигренозными пароксизмами (Волгина Л.Н., Бушуев Ю.В., 2002), при лечении больных бронхиальной астмой и предастмой (Цкаева А.Ю., 2002), при эндотоксикозах и острых экзогенных отравлениях (Марупов А.М., 2004), при пиодермиях (Земсков В.А., 2005). При наружном диффузном отите повышается эффективность лечения за счет быстрого устранения болевого синдрома, сокращения сроков лечения заболевания и числа рецидивов (Кустов М.О., 2012), а также при лечении больных с сахарным диабетом (Дробушевская А.И., 2013).
В многочисленных исследованиях с лечебной целью применяется озонированная кровь пациента (Драч Д.А., 2005, Шахов С.В., 2006, Винник Ю.С., Карапетян Г.Э., Якимов С.В., Сычев А.Г., 2006), облученная ультрафиолетом (Дронова Т.Г., 2003), а также имеют место лазерное облучение крови (Улащик В.С., Волотовская А.В., Филипович В.Н., 2003) и фотоаутогемотерапия (Дронова Т.Г., 2010).
Протоколы применения тромбоцитарной аутоплазмы, приготовленной методом
В первом эксперименте кроликам контрольной и подопытной групп раны наносили на дорсальной стороне туловища при помощи скальпеля, предварительно удалив шёрстный покров и обработав кожу 5% раствором йода. Обезболивание осуществляли инъецированием 0,5% раствора лидокаина подкожно в одну точку, в объёме 1 мл3. Удаляли кожу и подкожную клетчатку, используя трафарет. В подопытной группе кроликов под дно раны вводили тромбоцитарную аутоплазму 1 раз в 5суток в объеме 3 мл. Всего было сделано 4 инъекции. В контрольной группе кроликов раны обрабатывали только мазью «Левомеколь» и тромбоцитарную аутоплазму не вводили.
Площадь ран измеряли сразу после их нанесения и через сутки после каждого введения тромбоцитарной аутоплазмы.
Поверхностную температуру измеряли на здоровой коже, сразу после нанесения ран и через сутки после каждого введения тромбоцитарной аутоплазмы.
Пробы для бактериологического исследования брали сразу после нанесения ран и через сутки после второго введения тромбоцитарной аутоплазмы.
Кровь для клинического и биохимического исследования брали до лечения и через 24 часа после последнего введения тромбоцитарной аутоплазмы.
Во втором эксперименте с кроликами проводили исследование влияния тромбоцитарной аутоплазмы на заживление ран как в моно -, так и в комплексной терапии. Для этих целей были подобраны 3 группы животных. Кроликам в подопытной группе №1 раны обрабатывали мазью «Левомеколь» ежедневно и вводили ТАП под дно раны в одну точку один раз в 7 суток. Всего было сделано 3 инъекции. В подопытной группе № 2 вводили только ТАП 1 раз в 7 суток под дно раны в одну точку без каких-либо дополнительных обработок. Состояние раны и окружающих тканей оценивали через сутки после каждой инъекции. Контрольной группе кроликов раны обрабатывали мазью «Левомеколь» ежедневно. Измеряли площадь ран, проводили термографическое исследование. Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на заживление ран проверяли и на лошадях. Использовали лошадей, работающих в городском прокате, возраст животных 3-5 лет, беспородные. Пол - мерины и кобылы. Лошадей кормили кормом фирмы «Гран – При» и сеном, вода вволю. Раны наносили в средней трети шеи скальпелем, предварительно удалив шёрстный покров и обработав поле операции 5% раствором йода. Место ранения обезболивали 0,5% раствором лидокаина, в объёме 3 мл. Удаляли кожу и подкожную клетчатку. Подопытной группе лошадей под дно раны вводили тромбоцитарную аутоплазму 1 раз в 3 суток в объёме 3 мл, всего было сделано 4 инъекции. Тромбоцитарную аутоплазму вводили под дно раны в одну точку и дополнительно поверхность раны ежедневно обрабатывали мазью «Левомеколь». Контрольной группе лошадей раны обрабатывали только мазью «Левомеколь» ежедневно. Измеряли площадь ран до лечения и через 24 часа после каждого введения тромбоцитарной аутоплазмы. Измеряли поверхностную температуру на здоровой коже, а также на поверхности ран до лечения и через 24 часа после каждого введения тромбоцитарной аутоплазмы.
Для опытов на крупном рогатом скоте отбирали коров с язвами в области тарсального сустава, таким образом, чтобы язвы были приблизительно одинаковой площади и локализации. В опыте использовали коров чёрно –пёстрой породы, возраст до 5 лет, в период содержания на родильном отделении на привязи, с удоем около 7000 литров молока в год. Коров кормили сеном, комбикормом и свеклой, вода вволю. Для приготовления тромбоцитарной аутоплазмы кровь брали из хвостовой вены.
Коровам подопытной группы тромбоцитарную аутоплазму вводили в одну точку под дно язвы тарсального сустава. Всего было сделано 5 инъекций, 1 раз в 7 суток. Дополнительно язвы ежедневно обрабатывали ихтиоловой мазью.
Коровам контрольной группы язвы обрабатывали ежедневно ихтиоловой мазью. Площадь язв измеряли через 24 часа после введения тромбоцитарной аутоплазмы. Проводили измерение поверхностной температуры язв до лечения и после введения тромбоцитарной аутоплазмы. Дополнительно проводили исследования некоторых показателей крови и сыворотки крови у кроликов, лошадей и крупного рогатого скота по следующей схеме: брали кровь до введения ТАП и после внутримышечного введения ее через 1, 6 и 24 часа.
Измерение площади раневой поверхности у животных осуществляли с помощью полиэтиленовой плёнки и миллиметровой бумаги. Полиэтиленовую плёнку прикладывали к раневой поверхности, обводили контур раны фломастером, переносили полученное изображение на миллиметровую бумагу и подсчитывали количество сантиметров квадратных.
Для гистологического исследования биоптаты брали из раневой поверхности и здоровых участков кожи, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 часов, после чего по общепринятой методике заливали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону.
Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss Axio Star при увеличении 100, 200 и 400. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры Pixera 560 и программного обеспечения VideoТест. Биохимические показатели крови определяли на биохимическом анализаторе RAL Clima MC-15 (Испания)
Термографию осуществляли прибором VOLTCRAFT IR 280 (Китай). Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel 2013 с применением параметрического двухвыборочного t-критерия Стьюдента для независимых выборок с учетом нормальности распределений. Также проводили интервальную оценку данных с применением доверительного интервала с доверительной вероятностью 0,95 (Ивантер Э.В. с соавт., 2005).
Влияние тромбоцитарной аутоплазмы на течение раневого процесса у разных видов животных
Струп тёмный, коричневого цвета, ломкий. Заметно появление краевой эпителизации. В подопытной группе кроликов заметно уменьшение раны по площади. Видно ороговевание раневой поверхности в центре.
На 20-е сутки лечения в контрольной группе кроликов струп по-прежнему плотно прилегает в центре и отслаивается по периферии. По периферии ломкий, коричневого цвета. На краях раневой поверхности - краевая эпителизация. В подопытной группе кроликов стадия эпителизации практически завершилась. У 2-х кроликов из 5 заметно небольшое язвенное поражение в центре (0,2 – 0,3см2).
На 24 сутки лечения (рисунок 11) в контрольной группе кроликов произошло отслоение струпа. Рисунок 11. Раны у кроликов 24-е сутки лечения. А – опыт, В – контроль.
Под струпом находилась грануляционная ткань и стадия краевой эпителизации. В подопытной группе кроликов стадия эпителизации полностью завершилась.
Полное заживление ран в подопытной группе кроликов произошло на 5 суток раньше по сравнению с контрольной группой кроликов (рисунки 3-11).
После повреждения кожного покрова раны у всех групп кроликов выглядели одинаково. Сразу после нанесения ран отмечали кровотечение, которое останавливали с помощью тампонирования. После остановки кровотечения в ране оставались кровяные сгустки, которые также удаляли с помощью тампона. Раневая поверхность была блестящая, влажная. Края раневой поверхности ровные с кровоподтёками. Болезненности не отмечалось ни при надавливании на раневую поверхность, ни при введении тромбоцитарной аутоплазмы (рисунок 12). А B C
. Раны кроликов сразу после остановки кровотечения (А – опыт №1; B – опыт №2; С – контроль) Через час после нанесения ран вводили тромбоцитарную аутоплазму. Общее состояние животных оставалось в целом удовлетворительным, но c небольшим угнетением. С целью предотвращения разлизывания кроликами ран в первые сутки были сделаны бинтовые повязки. Аппетит животных всех групп оставался в норме, без изменений, ректальная температура была также в пределах референтных значений.
Через сутки после введения тромбоцитарной аутоплазмы (2-е сутки лечения) отмечали подсушивание ран (рисунок 13).
Раны кроликов на 2-е сутки лечения через 24 часа после первого введения тромбоцитарной аутоплазмы (А – опыт №1, обработка тромбоцитарная аутоплазма + «Левомеколь»; B – опыт №2, обработка тромбоцитарной аутоплазмой; С – контроль, обработка мазью «Левомеколь»). Раневая поверхность была ровная блестящая, слегка увлажнённая. В подопытной группе № 1 (рисунок 13А) площадь раневой поверхности уменьшилась, но статистически не значимо.
Контур раневой поверхности изменился, раневая поверхность стала неправильной формы у 3 кроликов из 5. Цвет раневой поверхности равномерно светло-красный. Края раневой поверхности ровные без кровоподтёков. Болезненности при пальпации не отмечается. У кроликов подопытной группы № 2 (рисунок 13B) раневая поверхность, более увлажнённая по сравнению с ранами кроликов подопытной группы №1. Цвет распределён неравномерно от тёмнокрасного до чёрного к середине поверхности раны. Края раневой поверхности неровные, их цвет неравномерной интенсивности. У животных контрольной группы раневая поверхность слегка увлажнённая, цвет от бледно – розового до тёмно-красного. Края раневой поверхности неровные, неравномерно окрашены – от светло - розового до красного (рисунок 13С). Болезненность при пальпации отсутствует. Общее состояние кроликов удовлетворительное, аппетит, активность и общая температура в норме.
Через 24 часа после второй инъекции (9-е сутки лечения) у всех кроликов отмечалось появление шёрстного покрова (рисунок 14).
Однако у подопытных групп шёрстный покров был более обильный в окружности раны, по сравнению с контрольной группой. В подопытной группе № 1 (рисунок 14А) у 2 кроликов из 5 струп имел разрыв в середине, под ним находилась грануляционная ткань. Струп ломкий, отслаивается по периферии. В подопытной группе № 2 (рисунок 14В) струп плотный, сухой, равномерно прилегает по всей раневой поверхности, бордового цвета. Струп не возвышается над раневой поверхностью. Края струпа плотно прилегают к краям раневой поверхности. У кроликов контрольной группы (рисунок 14С) струп коричневого цвета, плотно прилегает в центре раневой поверхности и отслаивается по периферии. В центре струп плотный, по периферии более ломкий. Края струпа возвышаются над раневой поверхностью. Раневая поверхность безболезненна при надавливании у всех групп кроликов. Общее состояние животных оставалось удовлетворительным, температура тела в норме.
В подопытной группе № 1 (рисунок 15 А) наиболее отчётливо видно появление эпидермального валика. Струп плотно прилегает к раневой поверхности, местами к периферии отслаивается, красно – коричневого цвета. В подопытной группе № 2 (рисунок 15 В.) струп плотно прилегает по всей поверхности, не возвышается над раневой поверхностью, отмечено появление эпидермального валика. Струп бордового цвета. В контрольной группе (рисунок 15С) кроликов произошло незначительное уменьшение ран по площади, струп плотно прилегает в центре и отслаивается по периферии, возвышаясь над раневой поверхностью. В центре струп плотный, а к периферии ломкий. Шёрстный покров вокруг раневой поверхности скудный.
Шёрстный покров, удалённый при подготовке поля операции, у кроликов в подопытных группах восстанавливался быстрее и был обильнее по сравнению с контрольной группой.
При пальпации раневой поверхности ни в контрольной группе, ни у подопытных групп кроликов болезненности не было отмечено.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов раневой поверхности у лошадей при использовании ТАП
Проведенные исследования убеждают в том, что изучение процессов регенерации повреждённых тканей и поиск эффективных средств лечения остаётся актуальной проблемой при лечении крупного рогатого скота, где экономическая эффективность имеет большое значение. Ворона С.Ю. с соавторами (2011) считают, что тромбоциты участвуют в регенерации поврежденных тканей и являются наиболее удобным и экономичным источником биологически активных веществ - факторов роста.
Важным моментом в лечении продуктивных животных является использование препаратов с минимальным количеством побочных эффектов, так как полученные продукты от животных поступают в реализацию. Продолжительные курсы антибиотикотерапии и противовоспалительной терапии также негативно влияют на качество продукции. Следовательно, поиск средств, позволяющих снизить курсы антибиотикотерапии и противовоспалительной терапии, остаётся актуальным в продуктивном животноводстве.
Помимо этого, большое внимание должно уделяться профилактике травматизма у животных, однако это не всегда возможно в условиях хозяйства. Так как по литературным данным хирургические болезни у крупного рогатого скота в зависимости от способа содержания встречаются у 10,2 – 28,8 % поголовья. Увеличение числа животных с инфицированными и длительно незаживающими ранами на промышленных животноводческих комплексах требует внимания и расширения арсенала лечебных воздействий (Филлипова Н.Г., 2007).
Противовоспалительные препараты, широко применяемые у лошадей при лечении хирургических болезней, могут считаться допингом и служить поводом для дисквалификации на соревнованиях. Так же известно, что нестероидные противовоспалительные препараты могут оказывать негативное действие на работу желудочно-кишечного тракта у лошадей (Абдулганиева Д.И. с соавт, 2008). Применение данных препаратов наиболее опасно у этого вида животных, так как синдром колик у лошадей очень распространён. Использование стероидных гормонов также небезопасно у этих животных, потому что они могут приводить к ламиниту (Нассау Р.В., 2009). Предлагаемые альтернативные методы лечения у лошадей должны заслуживать пристального внимания.
У мелких домашних животных, а именно кошек и собак, поиск современных средств, ускоряющих регенерацию повреждённых тканей, остаётся также актуальной проблемой, так как у собак, находящихся в городских условиях, среди всех хирургических заболеваний чаще всего диагностируются случайные раны. Опыт лечения животных с хирургическими болезнями животных показал, что основная роль в этом процесс принадлежит лекарственной терапии. (Гадзаонов С.Г. с соавт.2008, 2009).
Помимо ран, полученных механическим путём, у собак и кошек часто наблюдаются дерматологические патологии, сопровождающиеся зудом, и как следствие это приводит к самотравмированию кожного покрова, формированию ран и язв, а также обсеменению вторичной микрофлорой. В рекомендациях такие болезни лечат гормональными препаратами и антибиотиками. Длительные курсы стероидной терапии у мелких домашних животных могут приводить к сахарному диабету, стероидному гепатиту и гиперадренокортицизму, шелушению, алопеции, пиодермии, кальцинозу кожи, а также угнетают деятельность фибробластов (Николаева Л.В., 2013). Также у этого вида животных часто встречаются невоспалительные алопеции, которые также требуют лечения (Игнатенко Н.А.,2014) Врачи – дерматологи считают, что снижение использования антибиотиков и глюкокортикостероидов важно при терапии мелких животных (Николаева Л.В., 2013), поскольку лишь редкое число дерматологических патологий подвергается спонтанному исчезновению, например, такие как плазмоцитарный пододерматит кошек (Белова С., 2013). Применение препарата для иммуносупрессии – цефалексина, может приводить к гиперплазии дёсен, что влияет на качество жизни животного. Следовательно, поиск альтернативных препаратов или препаратов, позволяющих снизить курсы стероидной терапии у мелких домашних животных, также является актуальной проблемой ветеринарной медицины. В ходе исследований было проведено несколько опытов и установлено визуальным наблюдением, гистологическими, цитологическими и иммуногистохимическими исследованиями, что тромбоцитарная аутоплазма позволяет ускорять регенерацию повреждённых тканей у всех видов обследуемых животных: кроликов, лошадей, крупного рогатого скота, собак и кошек, а также оказывает противовоспалительный эффект.
Обычно при лечении кожных ран у животных применяются различные мази с антибиотиками и стимулирующими регенерацию веществами, а также могут использоваться растительные экстракты и масла, которые способствуют клеточной подвижности и пролиферации фибробластов и кератоцитов. Эффективность данных препаратов показана на кроликах (Osama A. Abu-Zinadah, 2009). Есть данные об эффективности применения крема с пчелиным ядом при лечении ран у кроликов. Согласно данному исследованию местное применение меда в ране уменьшает воспаление и отек, снижается количество некротических тканей, и способствует ангиогенезу, грануляции и эпителизации. По данным авторов при лечении кожных ран мазью с пчелиным ядом было отмечено заживление на 28-е сутки с формированием эпителия (Tae Sung Han et all., 2012). В то время как при применении тромбоцитарной аутоплазмы мы увидели похожую картину при лечении кожных ран у кроликов на 17-е сутки лечения.
У кроликов подопытной группы, раневую поверхность которых обрабатывали тромбоцитарной аутоплазмой, заполнение ран грануляционной тканью и появление стадии эпителизации было достоверно раньше в сравнении с животными контрольной группы (p 0,05). Площадь раневой поверхности также была достоверно меньше в подопытной группе после завершения курса лечения по сравнению с контрольной. В среднем заживление раневой поверхности происходило раньше в подопытной группе на 4 суток. Воспалительных процессов визуально не отмечали на раневой поверхности ни у одной группы кроликов. При этом дополнительные методы исследования (цитология и термография) показали, что применение ТАП способствовало снижению воспалительного процесса на раневой поверхности у животных. В раневых отпечатках, которые были получены через сутки после последней инъекции ТАП, было видно, что в мазках – отпечатках кроликов подопытной группы преобладали эритроциты и встречались лишь единичные лейкоциты, в то время как в контрольные лейкоциты покрывали всё поле зрение. Также при термографическом исследовании мы заметили, что после второй инъекции ТАП поверхностная температура стала снижаться и после четвёртой была достоверно ниже на 20,9 % (p 0,05).
В другом эксперименте выясняли эффективность способа лечения ран с помощью ТАП в комплексной терапии и в монотерапии. При комплексной терапии кроме инъекций ТАП применяли дополнительно нанесение мази «Левомеколь», а при монотерапии применяли только инъекции ТАП. Заживление ран происходило под струпом. Площадь раневой поверхности после второй инъекции была достоверно меньше (p 0,05) у кроликов подопытной группе № 1 на 30% и у кроликов подопытной группы № 2 на 22,8% по сравнению с контрольной группой. Площадь раневой поверхности была достоверно меньше после третьей (последней) инъекции в подопытной группе № 1 на 76,77% и в подопытной группе № 2 на 59,86%. При термографическом обследовании было отмечено, что после второй инъекции поверхностная температура раневой поверхности у кроликов подопытной группы № 1начала снижаться и после третьей (последней) инъекции, которую лечили комплексно, и была достоверно меньше на 33,66% по сравнению с контрольной группой кроликов. В то время как в подопытной группе кроликов № 2 температура раневой поверхности была достоверно ниже на 17,2% по сравнению с контрольной группой животных. Применение тромбоцитарной аутоплазмы при лечении ран у кроликов не меняет морфологию раневого процесса, как это происходит у лошадей, при этом ускоряет регенерацию тканей как в моно - , так и в комплексной терапии. Применение тромбоцитарной аутоплазмы для лечения ран кроликов эффективно в монотерапии, однако лучшие результаты мы наблюдали в комплексной терапии. Данное исследование носит исключительно экспериментальный характер, так как в реальных клинических условиях мы не можем использовать ТАП в монотерапии, поскольку требуется ежедневная обработка ран с целью асептики и антисептики.
У лошадей раны, как правило, наносятся животному в процессе тренинга или выгула. До начала лечения требуется промыть рану и защитить ее от микробной контаминации, затем удалить волосы после стрижки шерсти вокруг раны. Для лошадей характерно формирование патологических грануляционных тканей, поэтому грамотное лечение особенно важно для данного вида животных. Успех окончательного лечения зависит от первичной хирургической обработки раны (Moustafa A., Marzok M., 2015).
Мазь «Левомеколь» широко применяется в лечении ран у лошадей и часто используется для лечения ран контрольной группы в эксперименте (Шинкаренко А.Н. с соавт, 2011). Мазь «Левомеколь» получила широкое распространение, так как она содержит в себе как антибиотик широкого спектра действия – левомицетин, так и метилурацил - производное пиримидина, ускоряющее регенерацию повреждённых тканей. Преимущество левомицетина в том, что антимикробная резистентность к нему формируется медленно, перекрестной устойчивости не возникает. Кроме того, метилурацил обладает ещё и противовоспалительным действием (Сапуев А.А.,2011, Тезина Е.Ю. с соавт, 2015).