Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Замещение костных дефектов 10
1.2 Классификация имплантируемых веществ и их основные характеристики 16
1.3. Средства для оптимизации репаратнвного остеогенеза и результаты их применения 19
1.4.Бнсфосфонаты: их строение: свойства и применение в травматологии 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1 Методы клинических исследовании 41
2.2 Методы гематологических исследований 41
2.3 Методы биохимических исследований 41
2.4Рентгенографические исследования 42
2.5 Рентгеновская компьютерная томография 42
2.6 Морфологические не следования 43
2.7 Статистический мет од 43
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 45
3.1 Результаты клинических не следовании 45
3.2 Результаты гематологических исследований 45
3.3 Результаты биохимических исследований 54
3.4 Результаты рентгенографических исследовании 72
3.5 Результаты компьютерной томографии с томоденент сотетрней 74
3.6 Результаты морфологических исследований 78
3.7 Результаты статистической обработки планиметрических показателей костной ткани 99
Заключение 108
Рекомендации по использованию научных выводов 110
Список литературы 111
Приложение 140
- Средства для оптимизации репаратнвного остеогенеза и результаты их применения
- Результаты биохимических исследований
- Результаты морфологических исследований
- Результаты статистической обработки планиметрических показателей костной ткани
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема замещения и восстановления поврежденной костной ткани остаётся одной из актуальных в области ветеринарной травматологии (Анников В.В., 2013, Ватников Ю.А.,2012) . Особую значимость для её решения приобретает поиск эффективных лекарственных средств для активации репаративных процессов. В хирургической практике, необходимость замещения костных дефектов и полостей возникает при лечении целого ряда заболеваний, связанных с патологией костной ткани. Сюда можно отнести механические травмы и переломы, замедленную консолидацию, опухоли, ложные суставы, инфекционные и постинфекционные изменения, дефекты после оперативных вмешательств. Травматическое повреждение кости приводит как к локальному, так и к системному снижению минеральной плотности костной ткани, поэтому зачастую существует необходимость дополнительной коррекции остеорегенерации (Корж Н.А., 2006). Среди заместительных материалов “золотым” стандартом остаются аутотрансплантаты (Дюльгер П.Г., Ягников С.А.,2013). Однако возможности получения их в достаточном количестве для замещения обширных костных дефектов весьма ограничены. В этой связи поиск заменителей, способных составить достойную альтернативу аутотрансплантатам, продолжается.
В настоящее время применение препаратов, стимулирующих регенерацию костной ткани, имеет важнейшее значение наряду с проведением хирургического вмешательства (Козлов Н.А.,2002, Самошкин И.Б.,2007). Номенклатура таких препаратов в настоящее время чрезвычайно мала, а эффективность многих из них еще требует дополнительных исследований. Одним из механизмов решения проблемы является применение для костной пластики, совместно с металлическими имплантатами или, независимо от них, комплексных соединений, содержащих ряд минеральных компонентов, стимуляторов функции остеобластов (Ахтямов И.Ф., 2017; Федоров А.И., 2014). Авторами патента RU 2248210 (Девятов Ф.В.,2003) разработано комплексное соединение на основе этидронатов ионов лантаноидов и кальция, для лечения животных с переломами костей разной степени сложности.
Цель настоящего исследования - оценить влияние и эффективность препарата, содержащего этидронаты ионов лантаноидов и кальция на репаративную регенерацию костной ткани при локальных дефектах кости в условиях индуцированной травмы.
Для реализации цели необходимо решение ряда конкретных задач:
1. Установить динамику клинических показателей, морфологических
и биохимических показателей крови экспериментальных животных при введении в зону
травмы препарата на основе лантанид ионов и ионов кальция;
-
Выявить рентгенографические особенности стадийности формирования костного регенерата в зоне круглого дефекта и представить его денситометрические показатели;
-
На основании результатов морфологических исследований представить этапную количественную оценку состояния тканей в зоне индуцированной травмы;
4. Установить структурное состояние регионарных лимфатических узлов
у экспериментальных животных при введении препарата на основе этидронатов ионов
лантаноидов и кальция.
Научная новизна
Установлены остеоиндукционные свойства препарата, содержащего этидронаты ионов лантаноидов и кальция при его локальном инъекционном введении экспериментальным животным.
Экспериментально подтверждено, что препарат не оказывает токсического влияния на организм, и при введении в зону травмы не вызывает острых воспалительных процессов в тканях. Локальная его инъекция сопровождается стабильностью уровня
ферментов в сыворотке крови, таких как щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза (АлАт), аспартатаминотрансфераза (АсАт), амилаза, гамма-глутаминтрансфераза, показателей нефротоксичности (креатинин, мочевина).
Количественная денситометрия позволила выявить, что введение этидронатов ионов кальция и лантаноидов в индуцированный асептический дефект кортикальной пластины обеспечивает на ранних(первые 7 суток) сроках формирование костного регенерата с большей, чем в группе сравнения, структурной плотностью.
Морфометрическими исследованиями доказано, что введение препарата позволяет снизить интенсивность воспалительной реакции в зоне травмы, что способствует более раннему формированию грануляционной ткани с последующим образованием ретикуло-фиброзной и пластинчатой кости, закрытию дефекта.
Теоретическая и практическая значимость работы
На основании комплексного методического подхода, включающего экспериментально-хирургические, клинико-морфологические, гематологические, биохимические исследования, научно обоснованы положения о возможности прогнозирования репара-тивной регенерации тканей в области локального дефекта большеберцовой кости при введении препарата, содержащего этидронаты лантанид-ионов и кальций.
Выявленное отсутствие токсического влияния исследуемого препарата на организм позволило разработать алгоритм оценки состояния кости и параоссальных тканей, базирующийся на результатах морфологических исследований и компьютерной денситометрии костного регенерата.
Экспериментально подтверждена эффективность использования препарата для индукции репаративного остеогенеза.
Полученные данные расширяют представление о клинико-морфологических изменениях в организме животных при костной травме и репаративном остеогенезе в условиях применения бисфосфонатов с лантанид-ионами, открывая новые возможности для научно обоснованного подхода к применению препарата, в качестве локального активатора остеорепарации.
Методология и методы исследования
Научное обоснование репаративного остеогенеза при введении препарата на основе ионов лантаноидов и кальция обусловило использование комплексного подхода к изучаемой проблеме, включающего использование классических и современных методов исследования: экспериментально-хирургический, клинический, гематологический, биохимический, классическая рентгенография, рентгеновская компьютерная томография и световая микроскопия гистологических срезов.
Положения, выносимые на защиту
1. Морфометрические, морфологические, рентгенографические характеристики
(показатели) костного регенерата – объективные критерии для научного подхода к оценке
его структурно-функционального состояния.
2. Этидронаты лантанид-ионов и кальций способствуют активной репаративной
перестройке зоны дефекта с преобладанием остеогенеза, протекающего по десмальному
типу.
3. Томоденситометрия в этапной оценке зрелости остеорегенерата как
прогностический критерий течения репаративного процесса.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
В основу работы положен анализ результатов комплексного исследования, выполненного на 36 кроликах. Использовали экспериментально-хирургический, гематологический, биохимический, рентгенографический и морфологический методы исследования. Полученные цифровые данные были подвергнуты статистической обработке.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
- II Международном Ветеринарном Конгрессе «VETIstanbulGroup-2015», г. Санкт-Петербург, 7-9 апреля 2015 года; Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Занятия молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны», г. Санкт-Петербург, 20-21 ноября 2015 года; VI Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии, г. Москва, 24-25 ноября 2016 года; XXII Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития науки и технологий», г. Белгород, 31 января 2017 года; Международной научно практической конференции «Современные направления инновационного развития ветеринарной медицины, зоотехнии и биологии в интересах развития агропромышленного комплекса», г. Казань, 25-26 мая 2017 года; Пироговском форуме с международным участием «Хирургия повреждений, критические состояния. Спаси и сохрани», г. Москва, 25-26 мая 2017 года; VI Евразийском конгрессе травматологов-ортопедов, г. Казань, 24-26 августа 2017 года.
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 8 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора и выполнение работы
Диссертантом самостоятельно проведен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме, выполнены морфологические, рентгенографические исследования. Проведены экспериментальные исследования, связанные с оперативными вмешательствами и послеоперационной реабилитацией животных. Обобщены, проанализированы и статистически обработаны полученные данные. При этом часть научных трудов опубликована в соавторстве с Ахтямовым И.Ф., Цыплаковым Д.Э., Бойчуком С.В. Справка, представленная в диссертационный совет, подтверждает, что их данные в диссертации не использованы.
Объем и структура работы
Средства для оптимизации репаратнвного остеогенеза и результаты их применения
Традиционным в биомедицинских исследованиях методом оценки влияния остеопластических материалов на заживление костных дефектов является создание искусственного костного дефекта с последующим изучением динамики его заживления [202, 237].
Одними из наиболее эффективных и широко применяющихся препаратов остеопластического действия являются аутотрансплантаты [134]. В лечении внутрикостных дефектов давно использовали трансплантаты из гребня подвздошной кости, свода черепа, головки большеберцовой кости. Существенным преимуществом этих средств является органотопичность, то есть полное анатомо-морфологическое сходство с восстанавливаемым тканям [7, 15, 248]. Недостатками использования этих материалов являются ограниченность объема необходимого пластического материала, трудоемкость оперативно-технических действий, необходимость нанесения дополнительной травмы пациенту с целью получения аутотрансплантата [215]. В эксперименте доказан положительный эффект от применения в сочетании с аутокостью искусственных биосовместимых материалов для замещения костных дефектов [83].
Аллогенные трансплантаты имеют высокий остеоиндуктивный потенциал сравнимый с таковым у аутотрансплантатов [64]. Однако, во многом он обусловлен особенностями технологического получения и консервирования материала. Наиболее значимым недостатком аллотрансплантатов является биологическая несовместимость тканей донора и реципиента. Другими ограничениями в использовании этих материалов являются длительность сроков заготовки, возможность инфицирования. Большинство исследователей, придерживаются мнения, что регенерация костной ткани и замещение имплантата осуществляются за счет костного ложа реципиента и метаплазии соединительной ткани, окружающей пересаженную аллогенную кость и плотно прилегающей к ней по ходу врастающих в ложе сосудов. Синхронная перестройка костных аллоимплантатов осуществляется при одинаковом участии, как костного ложа реципиента, так и окружающих тканей и врастающих сосудов [89].
Наиболее известные на рынке аллотрансплантаты – АДЛК, АЛК, АллоГро (компания AlloSource — самый крупный банк тканей США) проходят биологические пробы на остеоиндуктивность, так как доказано, что трансплантаты не от всех доноров обладают ожидаемым действием.
Подобные иммунологические проблемы возникают и при применении ксенотрансплантатов (как правило, коровьих) [38]. Поэтому производители остеопластических средств нашли выход в извлечении из ксенотрансплантатов всех белков, на которые, собственно, и развивается иммунологическая реакция реципиента, сопровождающаяся отторжением материала. Полученные таким образом препараты, представляют собой не что иное, как природный гидроксиапатит, сохранивший структуру, свойственную костной ткани. Существуют два способа получения подобных материалов. В первом случае белки из костей крупного рогатого скота удаляют при низких температурах и использованием специальных растворителей (например, Bio-Oss). Но наличие резидуальных (остаточных) белков может провоцировать иммунологические реакции и препятствует прикреплению остеогенных клеток к поверхности пористого гидроксиапатита. Во втором случае элиминация белков проводится при высокой температуре и использовании воды (Остеограф/N). Этот способ позволяет получить гидроксиапатит, соответствующий стандартам ASTM F1581-95 «Состав неорганических заменителей кости для использования в хирургии» [155]. В Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия им. Г.А. Илизарова» (Курган), проведены исследования и представлены результаты работы по изучению возможности применения ксеноматериалов для замещения дефектов костей у кроликов. В качестве ксеноматериалов использовали губчатую костную ткань быка и лошади. Несмотря на видовые отличия, и при этом имея различную динамику, установлено, что использование ксеноимплантатов приводит к замещению костного дефекта. Резорбция имплантационного материала, изготовленного из костной ткани быка, наступала быстрее, чем материала, изготовленного из кости лошади. Поэтому костный матрикс может быть рекомендован в современной ветеринарной хирургии для замещения костных дефектов других видов домашних животных [136].
Появление синтетических остеопластических материалов обязано биоматериаловедению. Синтетические препараты были представлены как экономичная замена естественному гидроксиапатиту [154, 208]. Установлено, что кристаллы синтетического гидроксиапатита и трикальцийфосфата в биологической системе поддаются влиянию метаболизма клеток организма и распадаются на ионы кальция и фосфата, которые в дальнейшем входят в структуру регенерирующей костной ткани [4, 137].
Шайхалиев А.И. с соавторами (2013) изучали влияние на процесс рано заживления костной ткани при введении в искусственно вызванный дефект бедренной кости у крыс композиции под названием «Матрибон», который представляет собой синтетический гидроксиапатит (10-30 масс. %), хитозановый гель (70-90 масс. %) [202]. При его применении отмечалась активная репарация кости, выражающаяся в восстановлении плотной костной ткани и остеонов на более ранних сроках. Исследование выявило значительную роль препарата в процессах остеоиндукции и остеокондукции с восстановлением морфологически нормального костного матрикса.
Талашовой И.А. проведено большое исследование по изучению композитного имплантационного материала, имеющего в своём составе кальцийфосфатное соединение на основе гидроксиапатита и трикальцийфосфата, выделенных из диафизов трубчатых костей половозрелых особей крупного рогатого скота, а также сывороточные белки, полученные из крови животных с активным остеогенезом для повышения остеоиндуктивности и скорости биодеградации композитов. Имплантаты из кальцийфосфатного материала имеют прекрасные биосовместимые свойства и образуют прочную связь с живой костной тканью. Возмещение дефектов происходило на основе прямого остеогенеза. Заполнение костного дефекта новообразованной тканью начиналось от края к его середине, это свидетельствует о том, что данный композитное соединение проявляет остеоиндуктивные свойства, стимулирует костеобразование, а не является центром остеогенеза [120, 176-184].
Наибольший интерес среди материалов, стимуляторов остеогенеза, вызывает деминерализованный костный матрикс (ДКМ), в состав которого входят протеины. Костный матрикс получают путем деминерализации костной ткани разными кислотами (соляная, ортофосфорная, азотная и др.) в различных концентрациях, при различных соотношениях объема обрабатываемой массы и кислоты [35, 139]. Преимуществом матрикса перед эндогенной или консервированной аллогенной костью, является стерильность, снижение антигенности, не вызывает реакции иммунологического отторжения. ДКМ сочетает в себе остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства. Его волокнистая основа, являясь естественным для организма субстратом имеет пористость и хорошо резорбируется при помещении в костный дефект. Степенью деминерализации исходной нативной кости можно регулировать длительность резорбции имплантируемого ДКМ [2]. За счет коллагеновых волокон в процессе резорбции ДКМ служит строительным материалом для образующейся новой кости. Деминерализованный трансплантат является основой для прорастания первичных сосудов, способен абсорбировать и в течение определенного времени выделять лекарственные средства, стимулирующие остеогенез (например, гормоны). Обладает способностью к биодеградации с постепенным замещением костью [86, 88]. Самошкин И.И., Слесаренко Н.А. (2007) использовали деминерализованный костный трансплантат при попытке сохранить морфологические показатели кости, как органа в разработанной методике остеопластики диафизарного дефекта на модели большеберцовой кости у собак. Являясь остеоиндуктивным пластическим материалом для биосинтеза нового межклеточного вещества, он подвергся полной биодеструкции через 45-60 суток после имплантации [163].
Дедух Н.В., Чжоу Лу, Малышкина С.В. (2014) в своих исследованиях, имплантировали в костный дефект дистального отдела бедренной кости крыс синтетический углеродный биоматериал «войлокоподобной» структуры, «критического» размера. Результаты показали, что при использовании биоматериала остеорепаративный процесс характеризовался активным формированием новообразованной костной ткани, площадь которой увеличивается со сроком наблюдения. На ранних сроках в области дефекта зафиксировано формирование костной ткани, что может быть связано с особенностью углерода, заполнившего дефект. На стадии воспаления углеродный материал выступает своеобразной матрицей, фиксирующей клетки, которые принимают участие в регенерации и очищении костной раны. Повышение пула клеток приводит к раннему переходу от стадии воспаления к стадии пролиферации, дифференцировки клеток и формирования тканеспецифических структур. Особенностью «войлокоподобного» углеродного биоматериала является также и то, что на поздние сроки репаративного остеогенеза его фрагменты замурованы в новообразованной костной ткани без признаков деструкции окружающей кости и воспалительных проявлений. Использование углеродного синтетического биоматериала способствовало протеканию полноценного процесса регенерации при воспроизведении костных дефектов [51].
Результаты биохимических исследований
Следствием усиления обменных процессов при костной травме выступают изменение скелетного гомеостаза. Поэтому сдвиги в значениях биохимических показателей является неотъемлемой частью остеогенеза [106].
С целью определения реакции организма экспериментальных животных на введение препарата из группы бисфосфонатов необходимо проведение биохимических исследований показателей сыворотки крови в динамике на протяжении всего периода наблюдений.
С-реактивный белок считается одним из наиболее чувствительных клинико-лабораторных индикаторов воспаления и некроза, изменение концентрации которого широко применяется в качестве мониторинга и контроля эффективности терапии хронических воспалительных процессов и осложнений в хирургии [32, 195]. В норме С-реактивный белок в сыворотке крови не обнаруживается или обнаруживается в небольшом количестве. Достоверное снижение концентрации С-реактивного белка (СРБ) наблюдали в опытной группе на 3-е сутки после оперативного вмешательства. Далее динамика концентрации данного показателя была в обеих группах идентична (таб. 11, рис. 12).
Вместе с тем, тенденцию к повышению (на 4-5% выше физиологической нормы) отмечали на 56-е сутки в обеих группах (таб.12, рис.13). Известно, что белки играют решающую роль в цитоархитектонике, катализе, в регуляции метаболизма и в сократительных процессах. Белки имеют непосредственное отношение к подавляющему большинству событий на физиологическом уровне [176]. При изучении динамики концентрации общего белка как показателя течения адаптационных процессов при введении различных комплексных соединений, содержащих ряд минеральных компонентов (лантанид ионы и ионы кальция), установлено, что его значение в сыворотке крови экспериментальных животных статистически значимо не отличалось от нормы.
Это позволяет утверждать, что введение разработанного препарата, инициирует системную воспалительную реакцию в острой фазе, выражающуюся в повышенном содержании в сыворотки крови общего белка. Отмеченная положительная динамика общего белка у животных обеих групп к окончанию эксперимента свидетельствует об активации насыщения эритроцитов кислородом, так как гипоксия тканей является неизбежной в результате костной травмы [106].
Достоверного отличия данного показателя между группами не было выявлено.
На 3-е сутки отмечалось повышение концентрации кальция в группе сравнения, а на 7-е сутки только в опытной группе. Восстановление концентрации произошло только в конце эксперимента на 56-е сутки (таб.13, рис.14). Достоверного отличия этого показателя между группами не было обнаружено.
Нами не выявлено значительных колебаний в содержании фосфора в сыворотке крови кроликов обеих групп. На 3-е сутки после оперативного вмешательства обнаружено незначительное снижение его концентрации в обеих группах, с последующим повышением до исходного уровня к концу эксперимента (таб.14, рис.15). Значимые проявления динамики кальция и фосфора зарегистрированы при более обширных оперативных вмешательствах (политравмах), либо в условиях дистракционного остеосинтеза [115, 173].
Показатель щелочной фосфатазы в обеих исследуемых группах снижался на 3-е сутки и 21-е сутки наблюдения, а к концу эксперимента животные опытной группы опережали представителей группы сравнения. Однако, на протяжении всего эксперимента достоверных отличий между сравнимыми группами не наблюдали (таб.15, рис.16). Известно, что наибольшая активность щелочной фосфатазы отмечается при активации процессов коллагеногенеза и увеличении числа активных остеобластов, что используют при диагностике репаративных процессов в костной ткани [186]. Заметный спад её активности нами отмечен с 28 суток наблюдения, что, может быть связано с завершением периода компенсаторных процессов в организме после травмы и оперативного вмешательства и переходом в стадию интенсивной остеорегенерации [65].
В опытной группе наблюдалось стремительное повышение концентрации мочевой кислоты, а ее пик, выше физиологических значений, был зарегистрирован на 14-е сутки эксперимента. В последующие сроки происходил ее спад до референсных значений (таб.18, рис.19). В группе сравнения значимых колебаний в этом показателе не отмечалось. Следует отметить также, что достоверного отличия между группами по этому показателю выявлено не было.
Результаты морфологических исследований
Площадь незаращенного перфоративного отверстия большеберцовой кости у животных группы сравнения на 7 сутки составляла 27,6±2,1% (таб.32). Сохранялись остаточные явления реактивных процессов (прежде всего экссудативного воспаления), вызванных повреждением. Травматический отек на данном этапе либо отсутствовал, либо был выражен незначительно. Сосуды были расширены, полнокровны. Находящиеся в зоне дефекта сгустки крови подвергались организации. В той или иной степени присутствовала инфильтрация полиморфно-ядерными лейкоцитами, которая сменялась макрофагальной.
Иногда по краю дефекта кости имели место некротические изменения с наличием запустевших полостей остеоцитов и очагов кальцификации (рис. 42). В целом лейкоцитарно-некротические массы занимали 14,6±1,4% от площади среза. В большинстве наблюдений начинался процесс регенерации с пролиферацией кровеносных сосудов и миграцией фибробластов. Мезенхимальные элементы при этом располагались между сосудистыми петлями, что может свидетельствовать о формировании грануляционной ткани, площадь которой составляла 53,6±3,1% (рис. 43). В единичных случаях воспалительный процесс сохранялся в полном объеме с наличием обширных лейкоцитарно-некротических масс. Признаки репарации при этом отсутствовали.
На 7 сутки эксперимента на фоне снижения интенсивности воспалительной реакции у животных опытной группы, по сравнению с группой сравнения, достоверно (р 0,05), уменьшалась площадь незаращенного перфоративного отверстия до 15,6±1,9% (р=0,003). В отдельных наблюдениях сохранялась незначительная макрофагальная инфильтрация. Во всех случаях на фоне организации гематомы имелась сформированная грануляционная ткань, площадь которой по сравнению с группой сравнения увеличивалась до 70,6±1,1% (р=0,002) (рис. 44). Причем, наряду со вновь образованными сосудами и мезенхимальными клеточными элементами, здесь обнаруживались остеобласты. Очень редко в наблюдениях данной группы встречались незначительные лейкоцитарно-некротические массы (площадь которых в целом составляла 5,5±0,8% (р=0,001)) и отсутствие признаков репаративной регенерации (рис.45).
На 14 сутки эксперимента у животных группы сравнения уменьшилась площадь перфоративного отверстия до 10,4±0,7%. Во всех наблюдениях, где на предыдущем этапе сформировалась грануляционная ткань, происходило развитие соединительнотканных структур с разрастанием коллагеновых волокон и началом остеогенеза (рис. 46). Соединительная ткань занимала площадь 48,2±0,6%.
Во многих случаях на фоне гомогенизации коллагена образовывались костные балки, пространство между которыми заполняла рыхлая волокнистая соединительная ткань (рис. 47). Между отдельными костными балками появлялись поперечные перемычки. Обнаруживались пролиферирующие остеобласты. Некротические массы, в том числе и в костной ткани, практически полностью рассасывались с накоплением в данных участках остеокластов. В сосудистые каналы по краям дефекта проникали мезенхимальные клеточные элементы и врастали кровеносные сосуды. На месте костного мозга обнаруживалась жировая ткань с отдельными гемопоэтическими клетками (рис. 48). В единичных случаях наблюдали перихондральный остеогенез в виде островков среди соединительнотканных структур, либо - обширных участков (рис. 49). Общая площадь хряща на данном сроке составила 16,1±1,5%. Редко, но все же имело место, сохранение воспалительных процессов с клеточной инфильтрацией и очаговыми некрозами ткани, но площадь, которых была весьма незначительной (2,2±0,6%) (рис. 50). В отдельных случаях некротические изменения наблюдались в прилежащих к дефекту мягких тканях (рис. 51).
В опытной группе на 14 сутки эксперимента происходило уменьшение объема грануляционной ткани и увеличения соединительной до 6,7±1,1% (р=0,004) и 68,0±2,5% (р 0,001) соответственно. Часто наблюдали случаи со сформированной ретикуло фиброзной тканью, балки которой были связаны с краями перфоративного отверстия. Площадь этой костной ткани составила 18,2±0,6% (р 0,001). Дефект при этом был частично, иногда полностью, закрыт (рис. 52) и имел площадь всего 1,5±0,7% (р 0,001). Образование хряща наблюдалось значительно реже или в небольшом объеме - 5,1±1,3% (р=0,001). Проявления воспалительной реакции на фоне репаративных процессов, были незначительными или отсутствовали (рис. 53).
На 28 сутки наблюдений в группе сравнения костный дефект был полностью закрыт. Имелась сформированная ретикулофиброзная костная ткань, площадь которой составляла 86,0±1,9%. По краям бывшего перфоративного отверстия, костные трабекулы частично резорбировались и, наблюдалось начало перестройки данной ткани в пластинчатую (рис. 54), объем которой был еще весьма незначителен (1,2±0,3%). В случаях, когда в процессе заживления перелома образовывалась хрящевая ткань, на данном этапе происходило рассасывание хряща, кальцификация и замещение его костной тканью (рис.55, 56). В костном мозге развивались новые трабекулы параллельно с заполнением жировой ткани клетками гематогенного происхождения. Признаки воспалительной реакции при этом не наблюдались. При этом в костном мозге сохранялись участки жировой ткани не заполненные гемопоэтическими элементами (рис. 57). В отдельных случаях имело место закрытие дефекта хрящевой тканью при отсутствии ее оссификации, а в центре дефекта была выявлена незрелая ретикуло фиброзная костная ткань (рис. 58).
У животных опытной группы на данном сроке наблюдений перфоративное отверстие было замещено ретикулофиброзной костной тканью (92,2±0,9%) с диффузной кальцификацией балок, которая в 2,66 раза чаще, чем в группе сравнения, трансформировалась в зрелую пластинчатую (3,2±0,4%) (рис.59, 60). Хрящевая ткань практически отсутствовала (0,6±0,1%), а костный мозг был насыщен гемопоэтическими клетками, располагавшимися среди сформированных костных трабекул (рис. 61, 62).
На 56 сутки эксперимента, в большинстве наблюдений, у животных группы сравнения, была сформирована пластинчатая кость, занимавшая 88,7±0,6% от площади среза. В то же время, следует отметить сохранение в отдельных случаях фрагментов ретикул офиброзной кости (7,1±0,4%), участков рассасывания хрящевой ткани с оссификацией (рис. 63), а также наличие очагов некроза и деструкции как хряща, так и кости (рис. 64, 65). В целом хрящевая ткань сохранялась на 4,2±0,2% площади препарата (рис. 66).
Результаты статистической обработки планиметрических показателей костной ткани
Для современной биологической науки характерно применение точных математических методов в самых различных областях [205].
При сравнительном анализе полученных данных выявлены морфометрические показатели, обеспечивающие процесс репаративной регенерации, протекающий в костной ткани после индуцированной костной травмы, а также его направление, базирующееся на оценке последовательности морфогенетических преобразований основных структурных составляющих. Для этого была определена корреляционная взаимосвязь между структурами вышеуказанной ткани на разных сроках исследования и выявлен их коэффициент вариации (Сv%) (табл.33).
Анализ полученных данных выявил, что в опытной группе в первые 7 суток, функциональным потенциалом обладают показатели лейкоцитарно-некро тических масс в области индуцированного повреждения. Они в большей степени подвержены изменениям, направленным на сохранение стабильности (сбалансированности) системы. У животных опытной группы на 7-е сутки наблюдали отрицательную корреляционную взаимосвязь между 100 планиметрическими показателями, характеризующими процесс репаративного остеогенеза. При этом приоритетное значение в этом процессе имела степень развития грануляционной ткани (Cv%=5,22),что подтверждается данными морфометрического анализа. Этот факт позволяет сделать вывод об активно протекающих репаративных процессах, идущих в направлении: незаполненное перфоративное отверстие фиброзная ткань лейкоцитарно-некротические массы, что также подтверждается и соответствующими коэффициентами вариации (Cv% = 20,3, 22,4, 28,05). В группе сравнения на этом сроке наблюдений показатели грануляционной ткани также оставались стабильными. При этом структурные перестройки в зоне повреждения, в первую очередь, поддерживались фиброзной тканью, которая продолжала сохранять потенциал для дальнейших структурных изменений, в то время как в опытной группе эту роль выполняли лейкоцитарно-некротические массы.
На второй неделе эксперимента структурную стабильность у животных опытной группы приобретала фиброзная ткань. Структурные изменения, связанные с процессами заживления были направлены на закрытие перфоративного дефекта, что объясняется уменьшением его размеров на 95,2% при повышении коэффициента вариабельности до 69,3% (или в 3,41 раза). На 14 сутки в группе сравнения структурную стабильность (практически без изменений) сохраняла фиброзная ткань, перестроечные изменения, в первую очередь, были связаны с лейкоцитарно-некротическими массами, сгустками крови, формированием хрящевой ткани. Система в целом на данном этапе была индифферентной к закрытию перфоративного отверстия.
К 28-м суткам эксперимента, совпадающим с формированием ретикулофиброзной кости балочного строения, структурные изменения в зоне повреждения у животных опытной группы определялись степенью развития грануляционной и фиброзной тканей. На этом же сроке все аналогичные показатели в группе сравнения обладали довольно высоким функциональным потенциалом. Вместе с тем, в опытной группе, коэффициент вариации развития ретикулофиброзной костной ткани снижался до 1,45%, т.е. 43,7 раз. В то время как в группе сравнения данный показатель оставался высоко лабильным (Cv%=62,89%), обеспечивая функциональные перестройки.
К 56-м суткам исследования в опытной группе пластинчатая кость была сформирована, но при этом дальнейшие ее структурные изменения обеспечивались за счет вклада ретикулофиброзной кости балочного строения и хрящевой ткани. На 56-е сутки в группе сравнения обнаружены сходные результаты. Структурно-стабильной оставалась пластинчатая кость, а функционально динамичной ретикулофиброзная кость балочного строения.
Проведенный анализ позволяет высказать положение о том, что в опытной группе в системе показателей была достигнута определенная структурная стабильность, в то время как в группе сравнения наблюдали тенденцию к продолжающимся структурным преобразованиям, что согласуется с результатами, полученными в настоящем исследовании.
Возмещение дефектов костной ткани посредством имплантации в пострезекционный диафизарный дефект материала, стимулирующего остеогенез, пока не нашло широкого применения в ветеринарной практике, хотя данная методика известна давно [210]. Вероятно, что причиной этого является отсутствие теоретической и экспериментальной базы указанных хирургических технологий, а также сведений о материалах, предназначенных для этих целей.
Результаты настоящего исследования позволили представить научное обоснование возможности активации репаративного остеогенеза посредством использования препарата на основе этидроната ионов лантаноидов и кальция, который оказывает подавляющий эффект на фазу резорбции в ремоделировании микроархитектоники костной ткани в условиях индуцированной травмы. В ходе исследования была разработана экспериментальная модель локального дефекта костной ткани в области тазовой конечности у лабораторных животных.
Для выявления патологических процессов применялась комплексная оценка клинических, лабораторных, морфологических данных, что способствует верификации обнаруженных изменений [11].
Гематологические исследования сыворотки крови проводились с целью изучения функционального состояния организма животных в условиях введения разработанного препарата, содержащего этидронаты ионы лантаноидов и кальция, в дефект кортикальной пластины и, определения степени его биосовместимости. При исследовании процессов репаративного остеогенеза после инициации дырчатого дефекта большеберцовой кости у кроликов, было обнаружено, что применение препарата вызывает аналогичные изменения показателей крови в исследуемых группах. В группе животных с костным дефектом без применения препарата из группы бисфосфонатов, содержание гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов статистически значимо не отличались от нормальных значений. В группах с введением препарата, в ходе всего эксперимента значение этих показателей также оставались на уровне нормы. Следует отметить что, сочетанное воздействие экспериментальной травмы и препарата на локальное и общее состояние организма кроликов сопровождалось активизации местных (в зоне костного дефекта) маркеров воспалительного процесса и некоторых показателей системного ответа, которые нормализовались с угасанием острой фазы воспаления [203]. Принимая во внимание тот факт, что данные сдвиги не выходили за пределы физиологической нормы, можно предположить об отсутствии реакции основных показателей системы крови на введение препарата в смоделированный костный дефект. Иначе говоря, при локальном введении препарата на основе этидронатов ионов лантаноида и кальция не возникает системной отрицательной реакции организма экспериментальных животных.
На протяжении всего периода исследования содержание эозинофилов у кроликов не превышало пределов нормы. Известно, что повышение содержания эозинофилов может быть обусловлено аллергической реакцией замедленного типа из-за непереносимости применяемых лекарственных средств или их дозы.
Повреждение костной ткани и введение препарата содержащего ионы лантаноидов и кальция в указанной дозе вызывают идентичные изменения морфологического состава крови у животных обеих исследуемых групп. Следовательно, данный препарат имеет достаточно высокую степень биосовместимости.
При травматическом повреждении в организме происходит адаптационные перестройки обменных процессов, которые выражаются изменениями состава внутренних сред, позволяющих ему существовать в новых условиях, что сопровождается изменением концентрации белка, маркеров костного метаболизма [33, 85].
Из биохимических показателей отражающих процесс регенерации костной ткани наиболее известны следующие: определение активности щелочной фосфатазы, концентрации кальция, неорганического фосфора [149, 233]. Принято считать, что щелочная фосфатаза, хотя и в недостаточной мере, является специфическим маркером клеточных элементов костной ткани – остеобластов и остеокластов. По данным Луневой С.В., Ткачук Е.А. (2010) активность щелочной фосфатазы значительно повышается при множественных и открытых переломах, то есть при оценке тяжести скелетной травмы определение этого показателя имеет незначительное значение [115].
С увеличением площади повреждения костей увеличивалась активность щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза относится к группе белков-эктоферментов, которые зафиксированы на внешней поверхности клеточных мембран и катализируют отщепление неорганического фосфата из органических соединений фосфорной кислоты [44]. Щелочная фосфатаза - один из первых ферментов, обнаруженных в костной, печеночной и почечной ткани [167]. Она принимает участие в процессах минерализации, локализована преимущественно в остеобластах, являясь их маркером [129, 161]. В остеобластоподобных клетках её активность пропорциональна концентрации неорганического фосфата [217]. Наибольшая активность отмечается при максимальном образовании коллагена и увеличении числа активных остеобластов, что используют при диагностике репаративных процессов в костной ткани [186].