Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы по технологиям производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов 9
Выводы по главе 1 37
2. Материалы и методы 38
2.2. Идентификация штаммов микроорганизмов 40
2.3 Определение концентрации редуцирующих сахаров 41
2.4. Определение концентрации глюкозы 41
2.5. Исследование целлюлазной активности чашечным методом 42
2.6. Определение фенолоксидазной активности чашечным методом (метод Бавендамма) 43
2.7. Определение жизнеспособности штаммов базидиальных грибов в присутствии пероксида водорода 43
2.8. Определение концентрации этилового спирта 44
2.9. Оптимизация состава питательной среды для штаммов базидиальных грибов 44
2.10. Статистические методы 45
Выводы по главе 2 45
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Характеристика выделенных штаммов базидиальных грибов 46
3.2. Скрининг штаммов базидиальных грибов на способность продуцировать биоэтанол 47
3.3. Скрининг штаммов базидиальных грибов по критерию ферментативной активности 48
3.3.1. Исследование целлюлазной активности 49
3.3.2. Исследование фенолоксидазной активности 50
3.3.3. Температурная зависимость ферментативной активности штаммов базидиальных грибов 3.4. Исследование динамики накопления биомассы штаммов базидиальных грибов 53
3.5. Исследование динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата 55
3.6. Влияние концентрации исходного субстрата на жизнеспособность штаммов и на выход целевого продукта 59
3.7. Исследование жизнеспособности штамма T. versicolor It-1 в присутствии пероксида водорода 60
3.8. Исследование возможности многократного использования биомассы для продуцирования этанола 62
Выводы по главе 3 62
4. Исследование конверсии лигноцеллюлозных субтратов в биоэтанол 64
Выводы по главе 4 66
5. Оптимизация состава питательной среды для штамма T. versicolor It-1 67
5.1. Качественный подбор источников азота и углерода 67
5.2. Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методом математического планирования эксперимента 68
Выводы по главе 5 70
6. Разработка технологии получения биоэтанола с использованием базидиальных грибов 71
Выводы по главе 6 76
Заключение 77
Список использованной литературы 80
- Определение концентрации редуцирующих сахаров
- Определение жизнеспособности штаммов базидиальных грибов в присутствии пероксида водорода
- Исследование динамики накопления биомассы штаммов базидиальных грибов
- Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методом математического планирования эксперимента
Введение к работе
Актуальность работы. В последние десятилетия одним из приоритетных
направлений развития биоэнергетической отрасли является поиск новых
экологически безопасных способов конверсии лигноцеллюлозного сырья с
использованием биологических объектов, эффективно перерабатывающих
растительную биомассу в жидкие высокоэнергетические альтернативные топлива.
Лигноцеллюлоза является наиболее доступным и дешевым сырьем для получения
альтернативных топлив второго поколения. Использование непищевых продуктов в
процессах производства биоэтанола имеет ряд преимуществ, в том числе, не
оказывает влияние на продовольственный рынок. Кроме этого, использование
отходов деревообрабатывающей, сельскохозяйственной и других отраслей
промышленности способствует решению экологической проблемы, заключающейся в
эффективной утилизации отходов. Одной из задач развития биоэнергетической
отрасли является поиск новых производственных микроорганизмов,
перерабатывающих растительное сырье в целевые продукты. Главным недостатком всех существующих технологий получения биоэтанола с использованием живых организмов является необходимость обязательной предобработки лигноцеллюлозного сырья для удаления лигнина. Давно известно, что базидиальные грибы являются природными деструкторами целлюлозы, имеющими мощные ферментные системы (комплексы целлюлаз и лигниназ), однако исследования данных грибов в качестве продуцентов этанола активно проводятся только в последние несколько лет.
В связи с этим актуальным является поиск новых штаммов базидиальных грибов, способных утилизировать лигноцеллюлозное сырье и продуцировать биоэтанол.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации: соглашения № 14.577.21.0070 от 05.06.2014 г., а также в рамках проектной части Государственного задания в сфере научной деятельности по Заданию № 10.14.2014/K от 17.07.2014г.
Цель и основные задачи работы. Цель работы – разработка основ одностадийной технологии производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья без стадии делигнификации с использованием базидиальных грибов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
поиск и выделение новых штаммов базидиальных грибов;
скрининг штаммов по способности к продуцированию биоэтанола и оценке степени ферментативной активности;
- выявление температурной зависимости ферментативной активности штаммов
базидиальных грибов;
исследование динамики накопления этанола штаммами базидиальных грибов на модельных субстратах;
исследование влияния концентрации исходного субстрата и целевого продукта на жизнеспособность штаммов базидиальных грибов;
- исследование возможности осахаривания лигноцеллюлозных субстратов при
твердофазном культивировании;
- исследование возможности прямой конверсии субстратов в биоэтанол;
- разработка технологической схемы получения биоэтанола из лигноцеллюлозного
сырья с использованием базидиальных грибов.
Научная новизна работы.
-
Выделены новые штаммы базидиальных грибов, являющиеся продуцентами биоэтанола (впервые получено значение выхода спирта 0,5 г этанола/1 г глюкозы по сравнению с описанными в литературе штаммами) и имеющие высокую степень ферментативной активности (полученные при оценке ферментативной активности чашечным методом данные превосходят описанные в литературе).
-
Предложен способ оценки количества продуцируемого этанола на единицу биомассы, позволяющий сравнивать штаммы с отличающимися выходом биомассы и количеством продуцируемого спирта.
-
Установлена температурная зависимость целлюлазной и фенолоксидазной активностей выделенных штаммов базидиальных грибов.
-
Показана возможность прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол с использованием базидиальных грибов, минуя стадии химической и биологической предобработки.
-
Предложена принципиальная схема безотходного производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья, предполагающая использование штамма базидиального гриба Trametes versicolor It-1.
Теоретическая ценность работы. Выявлена высокая целлюлазная активность для штаммов Trametes versicolor It-1, Trametes hirsuta MT-24.24 и Trametes hirsuta MT-17.24, являющихся грибами белой гнили. Разработан комплексный подход к изучению базидиальных грибов – перспективных продуцентов биоэтанола.
Практическая значимость работы. Разработана технологическая схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием штамма Trametes versicolor It-1, позволяющая получать биоэтанол из лигноцеллюлозного сырья напрямую без стадии предобработки исходного субстрата. Создана коллекция штаммов базидиальных грибов, являющихся продуцентами биоэтанола и имеющих высокую степень ферментативной активности. Показана возможность получения редуцирующих сахаров при использовании штаммов базидиальных грибов в процессе осахаривания лигноцеллюлозного сырья.
Апробация результатов исследований. Основные положения и результаты работы доложены на четырех конференциях: «Химические аспекты возобновляемой энергетики» (РФ, Москва, 22 октября 2014 г.), «III Международный микологический форум – 2015» (РФ, Москва, 14-15 апреля 2015 г.), Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2015» (РФ, Москва, 13-17 апреля 2015 г.), «Химические аспекты возобновляемой энергетики» (РФ, Москва, 21 сентября 2016 г.).
Личное участие автора в получении результатов. Все исследования, описанные в данной диссертации, были проведены при непосредственном участии автора, за исключением определения концентрации биоэтанола хроматографическим методом и секвенирования штаммов базидиальных грибов. Личный вклад автора состоит в постановке цели, задач, выделению штаммов базидиальных грибов и создании коллекции, проведении скрининга штаммов на способность продуцировать биоэтанол, целлюлазы и фенолоксидазы, проведении ряда экспериментов по исследованию динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата, изучению влияния концентрации исходного субстрата и целевого продукта на жизнеспособность штамма, исследованию возможности прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол и разработке технологической схемы производства биоэтанола с использованием базидиальных грибов.
Достоверность и обоснованность полученных результатов подтверждается учетом всех основных влияющих на результаты исследования факторов,
реальностью данных при расчетах, использованием традиционных современных методов измерения.
Публикации. Основное содержание работы изложено в 6 публикациях, из них 3 статьи (2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, в том числе 1 статья, индексируемая в базах данных Scopus и Web of Science), 2 тезисов докладов на конференциях, 1 заявка на патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах
машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, списка
использованной литературы. Библиографический список состоит из 135
наименований. Диссертация содержит 16 таблиц и 26 рисунков.
Определение концентрации редуцирующих сахаров
Базидиальные грибы, или Базидиомицеты (лат. Basidiomycota) – отдел царства грибов, насчитывающий порядка 30 000 видов, главным признаком видов которого служит образование спор в специализированных структурах – базидиях [17]. Второстепенным признаком, характерным для большинства базидиальных грибов, является наличие на гифах мицелия специализированных структур – пряжек [18].
Вегетативное тело базидиальных грибов представлено септированным мицелием, состоящим из нитевидных образований – гиф, для некоторых видов характерен дрожжеподобный рост. Клеточная стенка грибов многослойная и электронопронецаемая, состоит из хитина и глюканов, у некоторых видов, имеющих дрожжеподобную стадию, в структуре присутствуют маннаны. Септы (перегородки) в гифах – долипоровые [19, 20]. Вегетативное размножение происходит фрагментацией таллома, бесполое размножение (анаморфа) не выражено (за исключением ржавчинных грибов). Половое размножение (телеоморфа) осуществляется в две стадии: половой процесс (соматогамия) и образование плодового тела (базидиомы) с базидиями. Соматогамия осуществляется путем слияния двух вегетативных клеток гаплоидного мицелия, вырастающего из базидиоспор. При этом происходит слияние цитоплазмы, а ядра объединяются в пары – дикарионы, которые затем синхронно делятся. У большинства видов базидиальных грибов дикариотичный мицелий имеет пряжки – особые клетки, находящиеся у поперечных перегородок клеток мицелия. Пряжка восстанавливает двуядерность клетки, от которой отделилась материнская клетка базидии [17, 19, 21].
Базидиальные грибы, относятся к различным экологическим группам, но, в основном, это сапрофиты, ксилотрофы, то есть, они используют для роста и развития растительный материал: древесину и древесные остатки. Природная деструкция растительных остатков грибами осуществляется благодаря комплексу внеклеточных ферментов: лигниназ и целлюлаз. Особенности строения растительного субстрата определяют состав и свойства ферментного комплекса гриба-деструктора. В связи с этим базидиальные грибы делят на две условные группы: грибы бурой гнили и грибы белой гнили. К грибам бурой или деструктивной гнили относят грибы, утилизирующие, преимущественно, целлюлозу, деструкция осуществляется за счет выделения целлюлаз: эндоглюканаз, целлобиогидралаз и -глюкозидаз. Древесина теряет прочность и рассыпается на отдельные кубики. Примерами могут служить грибы Fomitopsis pinicola, Irpex lacteus, Sporotrichum pulverulentum, Stereum sanguinoleum и др. Среди грибов бурой гнили также хорошо изучены грибы родов Antrodia и Gloeophyllum. К грибам белой или коррозионной гнили относят организмы, деструктирующие субстраты с высоким содержанием фенилпропанового полимера – лигнина. Ферментный комплекс этих грибов включает лигнинпероксидазу, Mn-пероксидазу, лакказу и др. Древесина при этом расщепляется на отдельные волокна белого цвета. Представителями являются: Pleurotus ostreatus, Fomes fomentarius, Peniophora gigantea, виды рода Coriolus (Trametes) и др. [19, 22-25].
Ферментативная деструкция целлюлозы происходит под действием комплекса целлюлаз, собранных в полиферментные системы, состоящие из экзо-и эндоферментов. Их совместное функционирование позволяет с максимальной эффективностью превращать целлюлозу в мономерные единицы, которые затем служат основой для синтеза новых химических веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов [16, 26-28]. Целлюлазы относятся к классу карбогидролаз (О-гликозид-гидролаз, КФ 3.2.1) и включают комплекс ферментов, к которым в соответствии с номенклатурой и классификацией ферментов следует отнести следующие: 1) 1,4--D-глюкан-глюканогидролаза (КФ 3.2.1.4) – эндоглюканаза, способная неупорядоченно гидролизовать в целлюлозе и других -глюканах -1-4-связи; помимо целлоолигосахаридов могут образовываться глюкоза и целлотриозы; 2)1,4--D-глюкан-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.74) – экзо-1,4--глюкозидаза, гидролизующая 1,4-связи в 1,4--D-глюканах с последовательным отщеплением глюкозных остатков; 3)1,4--D-глюкан-целлобиогидролаза (КФ 3.2.1.91) – целлобиогидролаза, отщепляющая целлобиозу с нередуцирующих концов целлоолигосахаридов; 4) -D-глюкозид-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.21) – -глюкозидаза, или целлобиаза, отщепляющая гидролитически концевые нередуцирующие остатки -D-глюкозы; может гидролизовать -D-глюкозиды и целлобиозу [9].
Определение жизнеспособности штаммов базидиальных грибов в присутствии пероксида водорода
Определение концентрации редуцирующих сахаров осуществляли согласно методике с использованием DNS-метода, адаптированного с целью уменьшения расхода рабочего реагента до 1 мл [124, 125]. Состав реактива DNS: дистиллированная вода - 1416 мл, 3,5-динитросалициловая кислота – 10,6 г («Acros», Бельгия), NaOH – 19,8 г («Химмед», Россия), Na-К тартарат – 306 г («Biochem», Франция), фенол (нагретый до 50 С) – 7,6 мл («Вектон», Россия), метабисульфит Na («Реахим», Россия) – 8,3 г. Пробы культуральной жидкости в объеме 1 мл отбирали с соблюдением правил асептики и переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Биомассу мицелия отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 5103 g. В пробирки Видаля (10х80), содержащие по 1 мл рабочего реагента, вносили 1 мл исследуемой жидкости и 2 мл дистиллированной воды. В качестве контроля вместо исследуемых проб использовали дистиллированную воду, а в качестве калибратора – растворы глюкозы с концентрацией от 0,15 до 1,5 г/л. Пробы тщательно перемешивали и помещали в кипящую водяную баню на 5 мин, затем охлаждали. Измеряли величину оптической плотности опытных и калибровочных проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм [126]. В случае если концентрация редуцирующих сахаров в исследуемой пробе превышала 1,5 г/л, исследуемую жидкость разводили дистиллированной водой.
Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом, используя коммерческую тест-систему «Фотоглюкоза», (Импакт, РФ). Пробы культуральной жидкости в объеме 1 мл отбирали с соблюдением правил асептики и переносили в микроцентрифужные пробирки, объемом 1,5 мл. Биомассу мицелия отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 5103 g. Пробы растворов сахаров из опытов по оценке ферментативной активности также отбирали в объеме 1 мл, но использовали без предварительной обработки. Для приготовления рабочего реагента 1 таблетку ферментного препарата растворяли в 40 мл дистиллированной воды и доводили объем до 50 мл. В пробирки Видаля (10х80), содержащие 2 мл рабочего реагента вносили 0,025 мл исследуемой жидкости (опытная проба), дистиллированной воды (контрольная проба) или 10 мМ раствора глюкозы (калибратор). Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре 37 С. Измеряли величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 нм. В случае, если концентрация глюкозы в исследуемой пробе превышала 25 ммоль/л, исследуемую жидкость разводили дистиллированной водой.
Фрагменты агаризованной среды с мицелием размером 3 3 мм переносили с соблюдением правил асептики из рабочей культуры в центр чашки Петри с CMC-агаром следующего состава: NaNCb - 2,0 г/л («Химмед», Россия), К2НРО4 - 1,0 г/л («CarlRoth», Германия), MgS04 - 0,5 г/л («Химмед», Россия), КС1 - 0,5, («Химмед», Россия), пептон - 0,2 г/л («CarlRoth», Германия), Na-карбоксиметилцеллюлоза - 2,0 г/л («Карбокам», Россия), агар - 17,0 г/л («Рапгеас», США), где Na-карбоксиметилцеллюлоза выступала с качестве единственного источника углерода [127].
После 5 суток культивирования при 28 С поверхность чашек заливали на 5 минут аптечным раствором Люголя («Московская фармфабрика», Россия) разведённым дистиллированной водой в соотношении 1:20. После этого раствор Люголя сливали. Если штамм обладал целлюлазной активностью, появлялась зона просветления вокруг колонии гриба. Индекс относительной ферментативной активности (RA) вычисляли по формуле [128]: S зоны просветления — S колонии RA = , где S колонии RA - относительная целлюлазная активность; S зоны просветления - площадь неокрашенного участка вокруг мицелия; S колонии - площадь, занимаемая мицелием гриба. 2.6. Определение фенолоксидазной активности чашечным методом (метод Бавендамма) Фрагменты агаризованной среды с мицелием размером 3 3 мм асептически переносили в чашки Петри со средой, содержащей: агар - 15 г/л («Рапгеас», США), жидкое сусло - 30 г/л («Тэдди Бир», Россия), галловая кислота - 3,5 г/л («Диаэм», Россия) [129, 130]. О выделении фенолоксидаз судили на основании появления коричневой окраски в субстрате вокруг растущего мицелия. Индекс оксидазной активности (ОА) вычисляли по формуле: S зоны окрашивания — S колонии RA = , где S колонии ОА - оксидазная активность; S зоны окрашивания - площадь окрашенного участка вокруг мицелия; S колонии - площадь, занимаемая мицелием гриба.
Для исследования жизнеспособности штаммов базидиальных грибов в присутствии пероксида водорода 10 мл жидкого посевного материала переносили в качалочные колбы на 750 мл со 100 мл стандартной питательной среды. Вносили в каждую из колб растворы пероксида водорода («Flagmа», Россия) с концентрациями от 0,5 до 4 % с шагом в 0,5 % и культивировали на качалке при 250 об./мин и температуре 28 С в течение 4-х суток. После этого оценивали количество накопленной биомассы. В качестве контроля использовали колбу с посевным материалом без внесения пероксида водорода. 2.8. Определение концентрации этилового спирта
Концентрацию образовавшегося этанола определяли методом газовой хроматографии на приборе Кристалл-5000.2 («Хроматэк», Россия) с ПИД-детектором на колонке Хромосорб 102 (3 м 3 мм) в изотермическом режиме при температуре колонки 200 С.
Исследование динамики накопления биомассы штаммов базидиальных грибов
Время, в течение которого накапливалось максимальное количество биомассы, было использовано в качестве стандартного времени культивирования штаммов, а биомасса, накопленная в течение этого времени, считалась исходной концентрацией биомассы для последующей работы с ней.
В результате изучения зависимости концентрации образуемого спирта от исходной концентрации биомассы установлено, что не наблюдалось прямой зависимости концентрации целевого продукта от выхода биомассы для разных штаммов. Для сравнения эффективности штаммов проводили оценку количества целевого продукта, образуемого единицей биомассы. Результаты представлены в таблице 7.
Установлено, что T. versicolor продуцирует наибольшее количество спирта на единицу биомассы (2,12 г/г), а T. hirsuta MT-24.24 – наименьшее (0,7 г/г) однако, учитывая неодинаковое время накопления биомассы для всех исследуемых штаммов, в дальнейших исследованиях по сбраживанию субстратов были отобраны два штамма: T. hirsuta MT-24.24 и T.versicolor IT-1, время культивирования которых составило четверо суток и позволило проводить последующие эксперименты с ними параллельно.
Выбор двух вышеуказанных штаммов обусловлен также температурным оптимумом целлюлазной активности (26 С), близким к температуре, при которой осуществляются процессы брожения (25 С) по сравнению с температурными оптимумами других исследуемых штаммов.
Исследование динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата Проведено исследование динамики накопления целевого продукта (этанола) и убыли исходного субстрата, в качестве которого были выбраны шестиатомные моносахариды глюкоза, фруктоза, галактоза, дисахарид целлобиоза и пятиатомные моносахариды арабиноза и ксилоза. Выбор пяти последних сахаров обусловлен их присутствием в гемицеллюлозах, входящих в состав лигноцеллюлозного сырья. Показано, что образование спирта из глюкозы штаммом T. versicolor IT-1 начиналось на первые сутки (5,1 г/л спирта при 44 % конверсии исходного субстрата) и концентрация достигала максимального значения на 9 сутки (11,3 г/л при 97,4 % конверсии исходного субстрата). Для штамма T. hirsuta MT-24.24 наблюдалось равномерное накопление спирта в течение всего времени эксперимента, максимальное значение достигалось на 10 сутки - 11,0 г/л при конверсии исходного субстрата 93,2%. Результаты исследований представлены на рисунке 15. Следует отметить, что в стационарных анаэробных условиях глюкоза потреблялась грибами незначительно и практически вся расходовалась на образование этанола.
При сравнении динамики накопления целевого продукта с использованием в качестве исходного субстрата фруктозы и галактозы отмечено 77 % и 80 % потребление фруктозы штаммом T. hirsuta MT-24.24 уже на первые сутки анаэробной стадии соответственно. Максимум концентрации спирта для данного штамма был достигнут на 8-е сутки и составил 3,4 г/л при культивировании на фруктозе и 0,5 г/л на 5-е сутки при использовании в качестве исходного субстрата галактозы. Для штамма It-1 п р и культивировании на фруктозе максимум биоэтанола составил 8,9 г/л к 10 суткам культивирования, на галактозе максимум был достигнут также на 10 сутки и составил 1,7 г/л (рисунки 16 и 17). 25 20 15 10
При использовании в качестве исходного субстрата целлобиозы установлено, что максимальный выход целевого продукта (8,3 г/л, что составляет 77,6 % от теоретически возможного) штаммом It-1 достигается на 7 сутки, штамм MT-24.24 имеет сходные показатели конверсии целлобиозы с большим периодом брожения: 8,2 г/л на 10-е сутки культивирования рисунок 18). При использовании в качестве исходных субстратов арабинозы и ксилозы, максимум концентрации этанола был достигнут к 7 и 10 суткам культивирования для ксилозы и арабинозы соответственно и составил по 1,2 г/л для обоих субстратов (рисунки 19 и 20) при сбраживании штаммом MT-24.24. 25 20 15 5 0 12 4567 Время, сутки 9 10 11 20 15 10
Динамика изменения концентрации биоэтанола, арабинозы и биомассы при культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа). Для штамма It-1 наблюдалась сходная картина. Максимум концентрации спирта был достигнут к 7 суткам культивирования и составил 1,5 г/л и 1,7 г/л для арабинозы и ксилозы соответственно (рисунки 19 и 20).
Таким образом, была показана эффективность использования штаммов It-1 и MT-24.24 для сбраживания не только гексоз, но и пентоз.
Влияние концентрации исходного субстрата на жизнеспособность штаммов и на выход целевого продукта Для штамма T. versicolor It-1 исследована зависимость выхода этанола от начального содержания глюкозы в среде. Результаты представлены на рисунке 21. Установлено, что при повышении начальной концентрации глюкозы до 200 г/л содержание спирта в среде при сбраживании возрастало до 33,4 г/л, однако при этом степень конверсии исходного исходного субстрата снижалась до 45 %. Биомасса, определенная после окончания сбраживания, изменялась в пределах от 3,5 до 3,9 г/л, независимо от исходной концентрации глюкозы. Отмечено повышенное содержание экзополисахаридов в колбах с концентрацией глюкозы более 100 г/л.
Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методом математического планирования эксперимента
Второй этап оптимизации (полный факторный эксперимент), проводимый для установления количественного соотношения компонентов питательной среды для штамма It-1 был проведен для двух факторов (соевая мука и соевое масло) на трех уровнях, число комбинаций варьируемых факторов составило 23. В таблицах 9 и 10 приведены значения факторов на каждом из уровней и варианты составов питательных сред. Выбранные при определении трофических потребностей концентрации соевой муки и соевого масла питательных сред были приняты за средний уровень в матрице планирования полного факторного эксперимента. Компоненты, входящие в состав минерального фона, не варьировались. Длительность процесса культивирования составляла 4 суток. Критерием оценки (Yu) служил выход воздушно-сухой биомассы.
На основании составленной матрицы планирования был проведен полный факторный эксперимент для исследования влияния совокупности двух составляющих исходной среды на процесс накопления биомассы штамма It-1. Результаты эксперимента приведены в таблице.10. На данном этапе был выявлен вариант среды, позволящий увеличить выход биомассы с 20,2 г/л до 38,5 г/л.
Полученные в ПФЭ результаты позволили рассчитать коэффициенты регрессии. Было установлено, что на образование биомассы статистически значимое влияние оказывают как соевая мука, так и соевое масло.
Концентрация соевого масла находилась в лимитирующей области, коннцентрация соевой муки – в ингибирующей области. Следовательно, для достижения оптимальных соотношений источников питания в среде нужно было повышать концентрацию соевого масла и уменьшать концентрацию соевой муки.
На основании данных ПФЭ был поставлен эксперимент, основанный на методе крутого восхождения, в котором осуществляли увеличение концентрации соевого масла по алгоритму, рассчитанному в соответствии с величинами коэффициентов регрессии таблица 11
Результаты метода крутого восхождения позволили определить оптимальный состав питательной среды для культивирования штамма It-1, включающий 7,8 г/л соевой муки, 41,2 мл/л соевого масла, 0,25 г/л MgSO4 7Н2O, 2,5 г/л KH2PO4. Последующее ведение процессов погруженного культивирования на оптимизированной среде показало, что максимум содержания биомассы варьирует в пределах 38,5-39,7 г/л на 4-е сутки культивирования.
В главе описана оптимизация состава питательной среды для штамма It-1. Разработанная методом математического планирования среда имеет следующий состав: соевая мука - 7,8 г/л, соевое масло - 41,2 мл/л, MgSO4 7Н2O - 0,25 г/л, KH2PO4 - 2,5 г/л. Данная среда обеспечивает стабильность периодического процесса культивирования штамма It-1, что выражается в воспроизводимости высоких выходов биомассы, минимальной длительности процесса, а также в морфологической однородности погруженного мицелия, которая отсутствовала при использовании исходных сред. Концентрация биомассы при культивировании на оптимизированной среде варьируется в пределах 38,5-39,7 г/л на 4-е сутки культивирования. 6. Разработка технологии получения биоэтанола с использованием базидиальных грибов
На основании результатов, полученных при проведении исследований по выявлению штаммов, обладающих ферментативной (целлюлазной и лигниназной) активностью и способных к прямой конверсии лигноцеллюлозы в этанол, предложена принципиальная технологическая схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья (рисунок 26). Сырье, в качестве которого могут быть использованы солома, либо опилки, поступает в блок подготовки сырья. В блоке подготовки осуществляется измельчение сырья: для опилок рекомендуемый размер частиц составляет 1-2 мм, для соломы – 5-10 мм. Затем измельченное сырье поступает в блок стерилизации, где осуществляется обработка сырья 1 % раствором пероксида водорода в течение одного часа. Стерильный субстрат поступает в ферментеры блока сбраживания. Ферментеры представляют собой емкости, внутренний объем которых разделен на две камеры фильтрующей перегородкой. Одна камера предназначена для загрузки биомассой базидиальных грибов, другая для загрузки стерильных субстратов. Биомасса для процесса ферментации производится следующим образом. Питательная среда (процесс оптимизации состава которой описан в главе 4) подается в блок культивирования биомассы (ферментеры), в котором происходит ее стерилизация и осуществляется засев питательной среды жидкой культурой базидиального гриба. Культивирование биомассы осуществляется в течение 3-4 суток. Процесс ферметации сбраживания субстрата (соломы или опилок) протекает в течение 5-7 дней при температуре 25 0С. Биомасса используется в течение не менее трех циклов ферментации (с загрузкой свежего сырья для каждого цикла). Культуральная жидкость направляется в блок ректификации. Кубовый остаток процесса ректификации направляется в рецикл в блок культивирования биомассы. Отработанные субстрат и биомасса поступают на осушку и прессование с целью производства лигноцеллюлозных удобрений, либо кормов, обогащенных белком. Технологические показатели процесса приведены в таблице 12.