Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Биопленки - одна из основных проблем при лечении животных с хроническими отитами 12
1.2. Биопленки - как эффективный способ выживания микроорганизмов в окружающей среде 1.2.1. Стадии формирования биопленок 15
1.2.2. Матрикс биопленки 16
1.2.3. Взаимодействие микроорганизмов в биопленке 17
1.3. Роль биопленок в инфекционной патологии животных 18
1.4. Методы лечения собак при хронических отитах 23
1.5. Стратегия борьбы с инфекциями, осложненными биопленками 29
1.5.1. Антимикробные препараты, препятствующие адгезии бактерий на эпителиальных покровах 29
1.5.2. Средства, обеспечивающие разрушение матрикса биопленки 29
1.5.3. Действие бактериофагов, антибиотиков и аналогов сигнальных молекул на биопленки 32
Глава 2. Собственные исследования 40
2. Материалы и методы исследований 40
2.1. Материалы исследований 40
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Микробиологические методы исследований 43
2.2.1.1. Выделение и идентификация микроорганизмов 43
2.2.1.2. Выращивание биопленок 44
2.2.1.3. Получение биопленок на предметных стеклах 46
2.2.1.4. Получение биопленок на покровных стеклах 47
2.2.1.5. Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов 47
2.2.1.6. Определение жизнеспособности биопленок 52
2.2.2. Клинические методы исследований 52
2.2.3. Гематологические методы исследований 53
2.2.4. Статистическая обработка результатов 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Состав микрофлоры, выделенной при отитах собак 54
3.2. Результаты изучения антибиотикочувствительности микроорганизмов, выделенных из слухового канала от больных отитом собак 68
3.3. Создание и испытание биологических моделей отита 77
3.4. Определение эффективности различных схем антибиотикотерапии на биологической модели отитов 90
3.5. Результаты изучения эффективности антибиотикотерапии при отитах собак с использованием ферментных препаратов 97
3.5.1. Оценка эффективности лечения собак с отитами по микробиологическим показателям 97
3.5.2. Динамика клинической картины у собак, больных отитами, в процессе лечения 100
3.5.3. Гематологические показатели крови у собак с отитами при лечении по различным схемам 103
4. Обсуждение полученных результатов 107
5. Заключение 114
5.1. Выводы 114
5.2. Практические рекомендации 115
6. Список использованной литературы 117
Приложения 136
- Методы лечения собак при хронических отитах
- Состав микрофлоры, выделенной при отитах собак
- Создание и испытание биологических моделей отита
- Определение эффективности различных схем антибиотикотерапии на биологической модели отитов
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности. Хронические отиты собак представляют существенную проблему для ветеринарной медицины в результате широкого распространения болезни и сложностей лечения животных (Усевич В.М., 2010; Плешакова В.И., 2014; Scott D.W., 2001; Zur G., 2013).
У собак при хронических отитах в 80% случаев выявляются биопленкообразующие бактерии, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (Грязнева Т.Н., 2018; Bjarnsholt T., 2013 и др.).
Биопленки – это сообщества микроорганизмов, которые окружены матриксом, состоящим из полимерных внеклеточных веществ, синтезируемых бактериями и прикрепленных к какой-либо биотической или абиотической поверхности. Важным свойством биопленок является высокая устойчивость находящихся в них микроорганизмов к различным факторам внешней среды, самым значимым из которых является антибиотикоустойчивость (Чеботарь И.В., 2012; Costerton J.W., 2015).
В последние два десятилетия в нарастающих масштабах в медицине проводятся исследования роли биопленочных инфекций при различных патологиях (Сидоренко С.В., 2003; Божкова С.А., 2013; Trautner W.B., 2004; Stoodley P., 2011).
В отечественной ветеринарии научные работы в данном направлении единичны. Недостаточно изучена этиология биопленочной инфекции, не разработаны методические подходы к разрушению биопленок и эффективные методы лечения собак с хроническими отитами, вызванными биопленкообразующими бактериями (Плешакова В.И., 2013; Уткина Т.М., 2014; Карабанов С.Ю., 2015).
Поэтому, актуальным в научном и практическом аспектах является изучение видового состава и биологических свойств биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак, разработка и усовершенствование методов лечения животных.
Степень разработанности проблемы. Теоретической базой для исследований послужили работы таких ученых, как Хмель И.А., 2011; Гостев В.В., Сидоренко С.В., Лямин А.В., Чеботарь И.В., Окулич В.К., Скородумов Д.И. 2012; Тец В.В., Чернявский В.И., 2013; Donlan R.M., 2002; Pace J.L., Finch R.G., 2006; Proal A., 2008; Percival S.L., Knottenbelt D.C., Cochrane C.A., Cruz H., Williams D.W. 2011 и др.
В отечественной ветеринарии имеются отдельные работы по этиологии и специ-3
фике лечения животных с биопленочной инфекцией (Скородумов Д.И., 2012), которые не затрагивают проблему хронических отитов у собак.
Тема работы является составной частью научных исследований, проводимых кафедрой микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина».
Цель исследований – изучить видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий ушных каналов собак при хронических отитах и усовершенствовать методы лечения больных животных.
Для решения были поставлены следующие задачи:
-
Изучить видовой состав микрофлоры, а также различные ассоциации микроорганизмов в слуховом канале собак при хронических отитах.
-
Определить in vitro способность этиологически наиболее значимых и часто обнаруживаемых при отитах собак микроорганизмов к формированию биопленки.
-
Определить антибиотикочувствительность выделенных из слухового канала собак микроорганизмов, входящих в состав биопленки.
-
Создать биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определить на их основе эффективность различных схем антибиотикотерапии в сравнительном аспекте.
-
Разработать эффективный метод повышения антибиотикочувствительности бактерий в составе биопленки.
6. Определить бактерицидное действие антибиотиков и ферментного комплекса
«Вобэнзим» в отношении биопленкообразующих бактерий, выделенных при хрони
ческих отитах у собак.
7. Провести клинические испытания нового метода лечения собак при хронических
отитах с использованием антибиотиков и ферментного препарата «Вобэнзим» и вне
дрить его в ветеринарную практику.
Научная новизна. Впервые определены виды микроорганизмов, способных формировать биопленки при отитах собак, дана количественная оценка интенсивности образования ими биопленки в слуховом канале собак при воспалительных процессах.
Впервые проведено сравнительное изучение бактерицидного действия различных антимикробных препаратов на культуры S. aureus, S. intermedius и P. aeruginosa, находящиеся в «планктонном виде» и в составе биопленки.
Созданы биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определена
эффективность различных схем антибиотикотерапии.
Впервые визуализировано разрушение биопленки под действием антибиотиков и ферментов.
Установлено in vitro снижение резистентности бактерий в фенотипе биопленки к антибиотикам в присутствии ферментного препарата «Вобэнзим».
Предложен новый методический подход по повышению эффективности терапии собак при хронических отитах с использованием антибиотиков и ферментных препаратов.
Теоретическая и практическая значимость. На основе проведенных исследований определен состав микрофлоры, ассоциирующийся с хроническими отитами собак и способность отдельных ее представителей формировать биопленки, что послужило обоснованием для разработки нового метода лечения животных при данной патологии как биопленочной инфекции.
В опытах на созданных биологических моделях отитов изучен патогенез болезни, выявлена высокая антибиотикорезистентность бактерий, находящихся в составе биопленки, определена в сравнительном аспекте эффективность различных схем анти-биотикотерапии животных.
Получен комплект фотографий, на которых поэтапно зафиксирован процесс разрушения биопленки антибиотиками и ферментами.
Разработана схема лечения собак при отитах с использованием антибиотиков в сочетании с ферментным препаратом «Вобэнзим». Данная схема лечения животных прошла клинические испытания в ветеринарных клиниках Москвы, что подтверждено актами, утвержденными в установленном порядке, и внедрена в практику ветеринарии специалистами клиник «ВетТал» и «Крошка Ру» (г. Москва).
Установлена безвредность и эффективнось применения ферментного препарата «Вобэнзим» при хронических отитах собак с биопленочной инфекцией, что подтверждено результатами исследований клинических, микробиологических и гематологических показателей организма экспериментальных животных.
По результатам исследований составлен и утвержден отчет о научно-исследовательской работе «Изучение видового состава биопленкообразующих бактерий, выделенных от собак, больных хроническим отитом».
Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре микробио-5
логии ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина при преподавании студентам дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология» и аспирантам – дисциплины «Экология бактерий».
Методология и методы исследований. Объектами количественных и качественных клинических, гематологических, микробиологических исследований выступали собаки разных пород и возрастов с поражением слухового канала, обусловленного биопленкообразующими микроорганизмами, а также лабораторные животные – биологические модели отита и разные виды бактерий и грибов, выделенные от животных. В качестве лабораторно-клинических методов использовались бактериологический и микологический методы исследований микрофлоры слухового канала больных хроническим отитом собак и биологических моделей, биохимический и гематологический методы анализа крови животных, а также иммунобиологический метод при изучении свойств биопленкообразующих бактерий.
Степень достоверности. Результаты работы были получены при использовании сертифицированного оборудования и приборов, прошедших поверку средств измерений, согласно ГОСТ 8.513-84, и определяются достаточным количеством проведенных исследований. Микробиологические исследования биоматериала проводились на базе лицензированной и аккредитованной лаборатории отдела санитарной и клинической микробиологии ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Полученные экспериментальные данные определяются достаточным количеством проведенных микробиологических и клинических исследований, на большой выборке животных. Результаты исследований обработаны методом статистического анализа.
Соответствие паспорту специальности. Диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: природа и происхождение, структура, химический состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий и грибов; теоретические и прикладные проблемы экологии микроорганизмов; культивирование бактерий и грибов; природа патогенности, явления, процессы и механизмы взаимодействия микро- и макроорганизмов на клеточном, тканевом, организменном, популяционном уровнях в условиях воздействия экзогенных факторов; методы выделения микроорганизмов из патологического материала, индикация патогенных микроорганизмов; средства и методы лечения и лекарственной профилактики инфекционных болезней животных.
Работа соответствует паспорту специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.
Апробация работы. Основные результаты работы изложены в отчетах НИР и доложены на XIII Междунар. научно-практич. конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014); на международной конференции «Современные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (Москва, 2016) и на заседаниях ученых советов ветеринарно-санитарного факультета ФГБОУ ВО МГУПП (Москва, 2014, 2015) и факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина (Москва, 2018), где получили положительную оценку.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Ветеринария; Российский ветеринарный журнал; Ветеринария Кубани; Ветеринария, зоотехния и биотехнология), 1 статья опубликована в материалах международной научно-практической конференции.
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление микробиологических, гематологических и клинических исследований; создание биологических моделей отита с биопленочной инфекцией; разработка нового метода лечения собак с использованием антибиотиков и комплекса ферментов; проведение клинических испытаний препаратов в условиях ветеринарных клиник; анализ результатов исследований и обработка полученных данных. При выполнении работы консультативную помощь оказывали доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы и биологической безопасности ФГБОУ ВО МГУПП Скородумов Д.И. и заведующий лабораторией ветеринарной клиники «ВетТал» Тютюнни-ков А.В., которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, список использованной литературы (206 источников, из них 70 отечественных и 136 иностранных авторов) и 10 стр. приложений. Работа содержит 29 таблиц и 30 рисунков.
Методы лечения собак при хронических отитах
Отоларингологические заболевания в большинстве случаев представлены затяжными и вялотекущими отитами. Учитывая этот факт для врача клинициста актуален вопрос об эффективной терапии данного заболевания.
В настоящее время предложены разные способы лечения данной патологии. По мнению Коновалова С.А. [70], в развитии всех случаев хронических отитов на первый план выходит патогенная и условно патогенная микрофлора, а также грибковая флора. Препаратами выбора в данном случае служат противомикробные и противогрибковые средства [30, 70, 184].
К сожалению антибиотикотерапия не всегда бывает обоснованной -бесконтрольное использование антибиотиков, назначение неадекватных доз, нетипично длинные или наоборот слишком короткие курсы - все это ведет к повышению антибиотикоустойчивости локальной микрофлоры. Для рациональной терапии рекомендуется проводить диагностические соскобы и мазки из ушных каналов с целью выделения возбудителя с последующим определением чувствительности к антибактериальным препаратам и антимикоти-кам.
По данным авторов Cole L.K. et al [160], Oliveira L.C. et al [124], Petrov V. et al [167] в этиологии хронических отитов ведущую роль играют дрожже-подобные грибы Malassezia pachydermatis, бактерии семейства Staphylococcus (преимущественно вид Staphylococcus aureus), Pseudomonadacae, Enterobaceriaceae.
Так, например, авторы Cafarchia С. et al [162] выделяли грибы рода Malassezia в 57,3% случаев от собак с отитами (в 97,6% являлись М. pachy-dermatis), при этом в 28% случаев от здоровых собак. Последний факт подтверждает принадлежность грибов рода Malassezia к нормальным сожителям кожи и слизистых оболочек животных [75, 85, 156].
Akerstedt J., Vollset I. [75] выделяли M. pachydermatis от собак с хроническим отитом в 80% случаев, а от здоровых в 22%. Кроме грибов рода Malassezia, выделял грибы рода Candida.
Авторами Craigen В. et al [113] были изолированы идентифицированы стафилококки, выделенные при отитах собак. Основные виды были представлены S. pseudointermedius в 38,4 %, S. schleiferi schleiferi - в 15,4 %, S. aureus - в 14,3 % соответственно.
Согласно авторам Fernandez L. et al [106], наиболее значимыми возбудителями отита у собак являются P. aeruginosa (в 22,2%), P. mirabilis (в 13,9%), S. aureus (в 12,5%), S. epidermidis (в 8,3%), E. coli (в 5,6 %).
Другие авторы, среди которых Cole L.K. et al [160], Scott D.W. [184], Graham-Mize C.A., Rosser E.J. [132] выделяют возбудителей в следующем порядке: Staphylococcus intermedius (pseudintermedius), Pseudomonas aeruginosa и Proteus species, а также дрожжеподобные грибы Malassezia pachydermatis.
Исходя из представленных выше данных авторов, этиология заболевания полимикробна, при этом антимикробную терапию назначают, руководствуясь данными о чувствительности микрофлоры к антибактериальным препаратам.
При хронических отитах, вызванных грибами рода Malassezia - эффективны следующие антимикотики: кетоконазол, флуконазол, итраконазол, тербинафин [11].
Также эффективны обработки фунгицидными средствами, например, низоралом.
Имеются данные об эффективности обработок зоомиколем через день, в сочетании с яблочным уксусом (1:3 - 1:2) 1-2 раза в неделю [26].
При отитах микробной этиологии ряд авторов считает эффективным применение следующих препаратов: неомицин, полимиксин В, гентамицин [184].
Некоторые авторы заявленную ототоксичность гентамицина считают преувеличенной. Так, в одном исследовании не было обнаружено никаких ототоксических эффектов, а также расстройств вестибулярного аппарата от применения гентамицина в течение 21 дня при разрыве барабанной перепонки [147, 170].
В случае наличия в очаге поражения бактерий рода Pseudomonas применяют энрофлоксацин, ципрофлоксацин, цефтиофур, полимиксин В [13].
Стоит иметь в виду, что эффективность последнего препарата может быть снижена при наличии большого количества гнойного экссудата [148].
Некоторые протоколы лечения хронических отитов включают тобрами-цин, инъекционный амикацин, тикарциллин с клавулановой кислотой, мупироцин, энрофлоксацин [148].
Авторы Harvey R.G. et al, Patterson S. et al [136], Koch S.N. et al [147, 148] считает эффективным применение при хронических отитах системно следующих препаратов: энрофлоксацин в дозе 10-20 мг/кг, марбофлоксацин 5-10 мг/кг, орбифоксацин 10 мг/кг.
Хронические отиты зачастую бывают осложнены грибковой микрофлорой. В таких случаях целесообразно одновременное применение противо-микробных и противогрибковых препаратов, таких как например нистатин, миконазол, кетоконазол [11].
Вне зависимости от наличия любого возбудителя, важным моментом в терапии отитов является санация ушных раковин растворами антисептиков. Применяют 1%-ный раствор хлоргексидина или 3%-ный раствор перекиси водорода. Возможно использование готовых коммерческих очищающих лосьонов (Otifree) или 0,9%-ного физиологического раствора. Многие зарубежные авторы, такие как Bouassiba С. et al [102], Buckley L.M. et al [100], Nuttall T. [164] отдают предпочтение растворам, содержащим в своем составе трис-ЭДТА (Tris-EDTA).
Показано, что трис-ЭДТА уменьшает минимальную ингибирующую концентрацию энрофлоксацина на культуры Pseudomonas, устойчивые к ци-профлоксацину, а также способствует выздоровлению в случаях устойчивости к цефалоспоринам или энрофлоксацину. Препарат также эффективен in vivo в сочетании с низкой концентрацией хлоргексидина диглюконата (0,15 %) [13].
При наличии в анамнезе аллергических реакций, усугубляющих течение отита - необходимо выяснить тип аллергена и исключить его из рациона. Рекомендовано применение системно антигистаминных препаратов, глюкокор-тикоидов. Желаемый эффект по контролю за аллергическими реакциями достигается за счет диеты [32].
При хронических отитах целесообразно применение глюкокортикоидов, отдавая предпочтение препаратам местного действия. Частота применения варьируется от одного до нескольких раз в день, в зависимости от препарата и тяжести случая. Глюкокортикоиды обладают противозудневым, противовоспалительным эффектом и уменьшают экссудацию и отечность, тем самым помогая уменьшить боль и дискомфорт. Кроме того, они вызывают атрофию сальных желез и уменьшают железистые выделения. Глюкокортикоиды могут уменьшить рубцовую ткань и пролиферативные изменения, что способствует повышению дренажа и вентиляции. Комбинированные препараты для лечения отитов практически всегда содержат в составе глюкокортикоиды.
Так, например, препараты Отомакс (Otomax, содержит бетаметазон), Трезадерм (Tresaderm, содержит дексаметазон) как правило эффективны, но в некоторых случаях могут быть абсорбированы системно и вызывать подавление коры надпочечников при длительном применении, поэтому их следует использовать с осторожностью. Некоторые авторы считают такой подход излишне осторожным [170].
Имеются данные о применении более мощного глюкокортикоида моме-тазона (в составе комплексного препарата Mometamax). Применение препарата более 1 недели не вызывало никаких изменений [171].
В случаях, когда требуется длительный прием глюкокортикоидов (аллергические отиты), требуется тщательный мониторинг подавления коры надпочечников. В таких случаях целесообразно использовать препараты с более слабыми глюкокортикоидами (Zymox НС, содержащий 1,0 или 0,5% гидрокортизона).
Некоторые авторы рекомендуют применять флуоцинолон и диметил-сульфоксид [148].
Многими авторы с целью повышения эффективности терапии хронических отитов, рекомендуют прием иммуномодулирующих средств [35, 57, 63].
Так, положительная динамика была отмечена при приеме препаратов иммунофан, риботан, полиоксидоний, гликопин - нормализующих фагоцитарную активность макрофагов, а также показатели Т- и В-звена иммунитета [36].
Состав микрофлоры, выделенной при отитах собак
Исследования проводили на базе ветеринарной клиники «ВетТал» в период 2013 - 2017 гг.
Объектом изучения служил биоматериал от 50 собак разных пород и возрастных групп. Каждое животное подвергали клиническому осмотру с последующим отбором материала для микробиологического исследования.
Соотношение пород, возрастов собак и частота обнаружения клинических симптомов отита представлены в таблицах № 1 -3.
Установлена породная предрасположенность собак к отитам, связанная, в первую очередь, со строением слухового канала.
Так, американские и русские спаниели (48%) имеют тяжелые ушные раковины, у шарпеев (16%) ушной канал часто с рождения подвергнут стенозу, у голден-ретриверов (12%) предрасполагающим фактором является наличие густой шерсти в слуховом канале.
Наиболее предрасположенными к хроническим отитам являлись собаки в возрасте 9 лет и старше. Причем у не менее 30% животных в течение жизни наблюдались рецидивы болезни.
Среди наиболее частых клинических симптомов отита мы наблюдали обильный ушной экссудат - 98% случаев, эритема - 92%, неприятный запах - 88%, а также зуд - 80%.
В совокупности было изолировано и идентифицировано на уровне рода или вида 188 культур микроорганизмов, в том числе 134 штамма бактерий (71,27%) и 54 культуры микроскопических грибов (28,73%).
Качественный состав выделенной микрофлоры представлен в таблице № 4.
У собак с явлениями отита микроорганизмы в виде монокультур изолировали в 20% случаев, в виде микробных ассоциаций - в 80%.
В таблице 5 представлены данные о микробных ассоциациях, обнаруженных при хронических отитах у собак.
Как следует из данных табл. 5, наиболее часто выявляли следующие ассоциации микроорганизмов:
- S. aureus + S. intermedius + Proteus mirabilis + Malassezia spp + Streptococcus pyogenes (12,5%);
- S. aureus + S. intermedius + Enterococcus faecalis + Candida spp + Malassezia spp (12,5%);
- S. aureus + S. intermedius + Malassezia spp + Streptococcus pyogenes + Proteus mirabilis (12,5%);
- S. aureus + S. intermedius + Malassezia spp (12,5%);
- P. aeruginosa + E. coli + S. aureus + S. pyogenes (10,0%).
В 91,7% микробных ассоциаций обнаруживали S. aureus, в 75,0% - S. intermedius, в 41,7% - S. pyogenes, в 25,0% - P. aeruginosa, в 83,3% - Malassezia spp. и в 33,3% - Candida spp.
Грибы рода Malassezia spp. в виде монокультур выделяли в 80% случаев, Candida spp. - в 20% случаев. Таким образом, наиболее часто обнаруживались и количественно преобладали в микробных ассоциациях стафилококки (S. aureus, S. intermedins), а также грибы рода Malassezia.
Культуры P. aeruginosa, Malassezia spp. и Candida spp. выделяли от животных, которых, по анамнестическим данным до исследования длительное время подвергали антибиотикотерапии.
Выделение грибов Malassezia spp и Candida spp в виде монокультур позволяет рассматривать этот факт как косвенный показатель их этиологической роли на данных стадиях развития отитов.
Грибы рода Candida присутствуют как в ассоциациях, взаимодействуя с другими патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, так и в виде монокультуры.
Данные микроскопические грибы являются обычными обитателями слизистой оболочки ротовой полости, пищеварительного, полового тракта, а также верхних дыхательных путей у собак.
Развитию заболевания слизистых оболочек и кожи (в том числе и отитов) способствуют дисбиоз, снижение иммунитета, а также длительная анти-биотикотерапия.
Известно, что способность к образованию биопленок является одним из факторов патогенности дрожжевых грибов рода Candida.
Доминирование микроскопических грибов Malassezia spp и Candida spp наблюдали у животных, подвергавшихся длительное время антибиотикотерапии, т.е. на фоне подавления бактерий и освобождения экологической ниши для грибов.
В дальнейшем, более подробному изучению были подвергнуты культуры S. aureus, S. intermedins и P. aeruginosa, как наиболее вероятные, по данным литературы, этиологические агенты отитов у собак, а также часто обнаруживаемые в исследуемом материале изоляты микроскопических грибов рода Malassezia и Candida.
По мнению исследователей Donlan R.M. et al [119, 120], одним из существенных факторов патогенности микроорганизмов является их способность формировать биопленку. Работы данных авторов побудили нас исследовать способность выделенных культур S. aureus, S. intermedius, P. aeruginosa, Malassezia spp и Candida spp к образованию биопленки in vitro.
Мы исследовали 37 штаммов S. aureus, 31 штамм S. intermedius и 10 штаммов P. aeruginosa на способность образовывать биопленку.
В качестве контроля мы выращивали биопленку, используя эталонные штаммы микроорганизмов, а именно S. aureus АТСС 25923, P. aeruginosa АТСС 27853.
Распределение штаммов по интенсивности образования биопленки проводили согласно измерениям показателей оптической плотности.
Полученные результаты представлены в таблице 6.
Создание и испытание биологических моделей отита
Изучение патогенеза и эффективности терапии инфекционных болезней не всегда возможны на естественно-восприимчивых животных. Поэтому подбор адекватной лабораторной биологической модели был и остается актуальной задачей микробиологов-инфекционистов.
Существуют различные модели воспроизведения экспериментального отита с использованием лабораторных животных: на морских свинках, крысах, мышах, шиншиллах, хомяках, кроликах, кошках, собаках.
Нами была предпринята попытка моделирования отита на гладкошерстных морских свинках живой массой 250 - 290 грамм и на белых мышах живой массой 14-16 грамм.
Животных приобретали в ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, филиал «Андреевка».
Поступивших животных карантинировали в течение 14 суток, кормление осуществляли в соответствии с «Руководством по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [21].
Морских свинок и белых мышей различных подопытных групп содержали в отдельных клетках, с обеспечением своим инвентарем. Контрольных животных размещали в изолированном помещении.
Индивидуальную маркировку морских свинок осуществляли на основании различий в окрасе, мышей метили красителем.
Всего в опыте использовали 18 морских свинок и 18 белых мышей. Животных каждого вида разбили на 3 группы (№ 1, 2, 3), по 8 голов в группах №1 и №2 и 2 животных в группе №3 (контроль). Морских свинок и белых мышей групп №1 заражали S. aureus, групп №2 -P. aeruginosa.
Для заражения животных применяли метод Donald N. et al [118].
В качестве заражающего агента использовали штаммы S. aureus и P. aeruginosa.
Данные бактериальные штаммы принадлежали к группе бактерий, обладающих выраженной способностью к образованию биопленок.
Культуры P. aeruginosa и S. aureus выращивали на питательном агаре в течение 24 часов при 37-38 С, бактериальную массу смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и устанавливали концентрацию микробных клеток на уровне 1,0 х 10 мл при помощи оптического стандарта мутности (0,5 McFarlamd).
Приготовленной бактериальной суспензией (0,5 мл для морских свинок, 0,1 мл для белых мышей) смачивали стерильные ватные тампоны, размером соответствующим ушной раковине животного, помещали в левое ухо и фиксировали при помощи пластыря.
Тампоны меняли через каждые 12 часов в течение 12 суток.
Ежедневно учитывали клиническое состояние ушной раковины зараженных и контрольных животных с использованием следующих критериев:
« - » - изменения отсутствуют (0 баллов);
«Г» - гиперемия (1 балл);
«3» -зуд (1 балл);
«В» - выделения (1 балл);
«ЗП» - запах (1 балл);
«О» - отечность (1 балл).
До заражения у 2 животных каждой группы увлажненным стерильным ватным тампоном были взяты материалы из ушных раковин и подвергнуты бактериологическому исследованию.
Подсчитывали количество колоний различных типов, выросших на кровяном агаре и после идентификации микроорганизмов результаты представляли в виде процента конкретного вида в составе микробиоценоза.
Полученные результаты бактериологического исследования представлены на рисунке 17.
Как следует из данных таблицы 15, у морских свинок, зараженных золотистым стафилококком, клинические симптомы отита развивались по нарастающей. У 87,5 % животных на второй день после заражения появился запах, у 25% - гиперемия, у 12,5% - отечность.
На 5 день после заражения у всех животных появились вышеперечисленные признаки отита, а у 25% наблюдался зуд.
На 8 день после заражения 5 основных клинических симптома отита наблюдалось у 100% животных и проявлялись весь период наблюдений (12 суток).
Аналогичную динамику появления клинических симптомов наблюдали и при заражении морских свинок синегнойной палочкой (табл. 16).
Данные о бактериологическом исследовании ушных раковин зараженных подопытных животных представлены на рисунках № 20-23.
Как следует из полученных результатов, у всех морских свинок полный симптомокомплекс отита сформировался на 8 - 9 сутки (у отдельных особей на 5 - 6 сутки), у белых мышей - через 11 суток (у отдельных особей на 5 - 6 сутки).
Через 12 суток контаминацию ушных раковин животных S. aureus и Р. aeruginosa прекратили, но наблюдение за клиническим состоянием морских свинок и мышей продолжали еще в течение 7 суток.
Динамика клинических симптомов в этот период представлена в таблицах 19 - 22 и рисунках 24 и 25.
Во время наблюдения группы белых мышей, мы наблюдали полное исчезновение симптомов отита на 4-ые сутки.
После завершения аппликации бактериальных суспензий, при отсутствии химиотерапии у морских свинок в течение 7 суток клинические симптомы отита сохранились, у 31% белых мышей - клинические симптомы исчезли через 3 суток, у 69% - на 4 сутки и позднее.
Как следует из полученных данных, доминирующими микроорганизмами у экспериментально зараженных животных с клиникой отита явились культуры заражающих штаммов. На долю других микроорганизмов (Bacillus spp., E. coli, Micrococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.) пришлось до 10 % на каждый вид.
Из двух испытанных видов лабораторных животных наиболее чувствительными к заражению, по нашим данным, оказались морские свинки, при этом у них выявлена наименьшая индивидуальная гетерогенность по степени чувствительности. Морские свинки легче поддавались заражению, у них быстрее развивались и длительнее сохранялись клинические симптомы отита.
Полученные результаты исследований позволяют считать, что морские свинки являются наиболее подходящей биологической моделью для воспроизведения отита бактериальной этиологии.
Определение эффективности различных схем антибиотикотерапии на биологической модели отитов
На основании ранее полученных данных по антибиотикочувствительно-сти изолированных от собак штаммов S. aureus и P. aeruginosa, для испытания был выбран антибиотик ципрофлоксацин.
Ципрофлоксацин - противомикробное средство широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Оказывает бактерицидное действие. Высокоактивен в отношении многих грамотрицательных микроорганизмов, включая P. aeruginosa, активен также в отношении Staphylococcus spp.
Испытывали эффективность ципрофлоксацина как такового и в сочетании с комплексным ферментным препаратом «Вобэнзим», исходя из установленной способности бактериальных культур формировать биопленку.
Заражение морских свинок массой 250 - 290 грамм проводили по методу Donald N. et al [118].
Для заражения использовали штаммы S. aureus и P. aeruginosa, выделенные от собак и обладающие способностью формировать биопленку in vitro.
Всего в опыте использовали 23 морских свинок, которых распределили в несколько групп.
Животных групп №№ 1,2,3 (по 3 морских свинки в каждой) заражали S. aureus, групп № 4, 5, 6 (по 3 морских свинки в каждой) — P. aeruginosa.
Лечение животных групп №№ 1 и 4 проводили только антибиотиком, в группах №№ 2 и 5 - антибиотиком в сочетании с ферментным комплексом «Вобэнзим», животных групп №№ 3 и 6 заражали, но не лечили (контроль).
Чтобы проверить эффективность ферментного комплекса «Вобэнзим», как препарата, разрушающего биопленки, нами был проведен опыт по заражению морских свинок штаммом S. aureus, не образующим биопленку.
Данный микроорганизм был выделен от собаки с клиникой отита и не имел способности in vitro образовывать биопленку.
При этом была сформирована группа № 7 (5 морских свинок). При лечении данной группы животных использовали сочетание антибиотика ципро-флоксацина и ферментного комплекса «Вобэнзим».
Через 12 суток после заражения на фоне развития симптомокомплекса отита, прекращали аппликацию микробной взвеси и приступали к антибио-тикотерапии животных.
Изучали две схемы лечения:
Схема 1. На протяжении 5 дней ципрофлоксацин вводили 2 раза в сутки, внутримышечно, из расчета 4 мг на кг живой массы тела.
Схема 2. Для определения эффективности антибиотикотерапии по схеме «антибиотик + фермент» был использован ферментный комплекс «Вобэнзим» (Mucos Pharma, Германия).
Ципрофлоксацин вводили, как описано выше (схема 1). Вобэнзим вводили по 1/9 драже 3 раза в день (исходя из рекомендаций по применению с антибиотиками). Способ приема - per os.
Для удобства введения препарата, драже предварительно измельчали и суспензировали в небольшом количестве воды. Суспензию вводили морским свинкам через пищевой зонд. Препарат применяли на протяжении всего курса антибиотикотерапии. До антибиотикотерапии и после ее завершения у морских свинок брали из ушных раковин материал для бактериологического исследования.
От животных каждой группы материал объединяли в одну общую пробу, помещали в пробирку с 2 мл стерильного физиологического раствора и тщательно суспензировали. Затем 0,1 мл взвеси дробно рассеивали на 3 параллельные чашки Петри с кровяным агаром и инкубировали 24 часа при 37 С и подсчитывали среднее количество бактериальных колоний заражающего штамма, результаты выражали в процентах.
За 100% брали количество колоний заражающего штамма в группе животных, не подвергавшихся лечению.
Результаты антибиотикотерапии отражены на рисунках 26 и 27, данные о результатах бактериологического исследования представлены на рисунке 28.
Как видно из результатов, представленных на рисунках 26 и 27, полное выздоровление животных групп 1, 2, 4, 5, леченных по схеме «антибиотик + фермент», наблюдали через 2-ое и 3-ое суток, в отличие от группы, где применяли только антибиотик - выздоровление на 4-ые сутки.
У животных контрольной группы (лечение не проводили) клинические симптомы через 5 дней полностью не исчезли.
Динамика клинических симптомов у леченных и контрольных морских свинок подтверждается результатами бактериологического исследования. В частности при схеме лечения исключающей ферментный комплекс «Вобэн-зим» количество микрофлоры, которой заражали животных ниже, чем у контрольной группы морских свинок и составляет 25% для S. aureus и 38% для P. aeruginosa (рис. 28).
Анализируя данные симптомов отита у морских свинок при лечении, мы обратили внимание на схожесть течения симптомов отита в группе, которую лечили только антибиотиком и группу, которую лечили по схеме «антибиотик + фермент», при этом заражая штаммом, не образующим биопленку. По всей видимости, полное исчезновение симптомов отита на 3-ие сутки у морских свинок 1-ой группы (лечение только антибиотиком, заражение штаммом, образующим биопленку) связано со сложностью проникновения антибактериального препарата в биопленки, как следствие более длительное выздоровление.
Мы предположили, что микроорганизмы, не способные к образованию биопленки, также не смогут ее образовать в патологическом очаге. Отсюда отсутствие положительного эффекта при использовании ферментного комплекса у группы животных, которых заражали штаммом, не образующим биопленку, так как отсутствует мишень в виде бактериальной пленки.
Несмотря на отсутствие действия Вобэнзима на биопленки P. aeruginosa в опытах in vitro, мы наблюдали положительную динамику при лечении подопытных животных. Вероятно положительный эффект был достигнут не прямым воздействием на биопленки, а опосредованным, т.е. через усиление механизмов неспецифической защиты организма.
Таким образом, при терапии подопытных животных по схеме «антибиотик + фермент», положительная динамика клинической картины была более выраженной, при условии наличия в патологическом очаге микроорганизмов, способных образовывать биопленку.