Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы .16
2.1. Общие сведения о реовирусном теносиновите кур 16
2.1.1. Эпизоотология 17
2.1.2. Клинические признаки и формы проявления 20
2.1.3. Патологоанатомические изменения .22
2.2. Биологические свойства вируса реовирусного теносиновита кур. 24
2.2.1. Таксономическое положение, антигенный и морфологический состав вируса 24
2.2.2. Устойчивость 26
2.2.3. Выделение изолятов РВТ и методы культивирования вируса 26
2.2.4. Лабораторная диагностика РВТ 32
2.2.5. Возрастная резистентность и иммунитет 34
2.3. Средства специфической профилактики реовирусного теносиновита кур 36
2.3.1. Общие принципы конструирования инактивированных вакцин 42
2.3.2. Очистка и концентрирование вирусного сырья при производстве инактивированных вакцин 43
2.3.3. Инактивация вирусного сырья 43
2.3.4. Адъюванты .44
2.3.5. Требования к качеству инактивированных вакцин 46
2.3.6. Оценка эффективности применения инактивированных вакцин 48
2.4. Заключение по обзору литературы 49
3. Собственные исследования 52
3.1. Материалы .52
3.1.1. Производственные изоляты и штаммы вируса РВТ 52
3.1.2. Вакцины .53
3.1.3. Диагностикумы 53
3.1.4. Лабораторные и естесственно восприимчивые животные 53
3.1.5. Куриные эмбрионы и инкубационные яйца 53
3.1.6. Культуры клеток 53
3.1.7. Питательные среды, реактивы, растворы и сыворотки 54
3.1.8. Оборудование .55
3.2. Методы 55
3.2.1. Приготовление культуры клеток ФЭК 55
3.2.2. Культивирование реовируса в культуре клеток ФЭК .57
3.2.3. Приготовление культуры клеток ФЭК для титрования реовируса .58
3.2.4. Определение инфекционной активности реовируса .58
3.2.5. Инактивация реовируса и определение остаточной инфекционности .59
3.2.6. Изготовление образцов экспериментальной вакцины .59
3.2.7. Определение антигенной активности экспериментальной инактивированной полиштаммной вакцины 60
3.2.8. Оценка реактогенности образцов вакцины 60
3.2.9. Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей 60
3.2.10. Обработка результатов экспериментов .61
4. Результаты собственных исследований и их обсуждение 62
4.1. Анализ эпизоотической ситуации по реовирусному теносиновиту в птицехозяйствах РФ в 2011-2018 гг .62
4.2. Подбор штаммов для экспериментальной инактивированной полиштаммной вакцины против реовирусного теносиновита птиц .69
4.3. Изучение биологических свойств штамма «ARV04/02» реовирусного теносиновита птиц 75
4.3.1. Определение патогенных свойств штамма «ARV04/02» реовируса птиц для SPF-эмбрионов кур 75
4.3.2. Определение патогенных свойств штамма «ARV04/02» реовируса птиц для цыплят разных возрастных групп 76
4.3.3. Адаптация штамма «ARV04/02» реовируса птиц к различным культурам клеток 79
4.3.4. Оптимизация условий культивирования штамма «ARV04/02» реовируса птиц на культуре клеток ФЭК 86
4.3.5. Инфекционная активность штамма «ARV04/02» реовируса птиц..88
4.3.6. Оценка инфекционной активности штаммов «ARV04/02», «1133» и «1733» реовируса птиц 89
4.3.7. Антигенные свойства штамма «ARV04/02» реовируса птиц 90
4.4. Изучение иммуногенных свойств экспериментальной полиштаммной инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц на основе штаммов «1133», «1733» и «ARV04/02» 91
4.4.1. Инактивация реовируса птиц 91
4.4.2. Антигенные свойства образцов инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц на основе штаммов «1133» и «ARV04/02» .95
4.4.3. Антигенная активность инактивированных моноштаммных вакцин на основе штаммов «1133», «1733», «ARV04/02» и полиштаммной инактитвированной вакцины на основе указанных штаммов 97
4.4.4. Сравнительная оценка масляных адъювантов в составе полиштаммной инактивированной вакцины против РВТ 99
4.4.5. Оценка реактогенных свойств экспериментальной полиштаммной инактивированной вакцины против РВТ .101
4.4.6. Определение безвредности полиштаммной вакцины против РВТ .102
4.4.7. Определение оптимального прививного объема для полиштаммной вакцины против РВТ 103
5. Заключение 105
5.1. Выводы .114
6. Практические предложения .117
7. Список литературы 118
8. Приложения 141
- Выделение изолятов РВТ и методы культивирования вируса
- Анализ эпизоотической ситуации по реовирусному теносиновиту в птицехозяйствах РФ в 2011-2018 гг
- Адаптация штамма «ARV04/02» реовируса птиц к различным культурам клеток
- Сравнительная оценка масляных адъювантов в составе полиштаммной инактивированной вакцины против РВТ
Выделение изолятов РВТ и методы культивирования вируса
Во многих работах, посвященных изучению патогенеза реовирусной инфекции птиц, установлено, что кишечник является основной мишенью вируса независимо от способа его введения. После орального или аэрогенного заражения возбудитель попадает в кровоток и в результате виремии быстро разносится в различные органы и ткани. В частности, вирус удается выделить из кишечника, фабрициевой сумки, печени, поджелудочной железы, сердца, почек, суставов и сухожилий. Jones et al. показали, что реовирусы вначале реплицируются в эпителии ворсинок тонкого отдела кишечника и фабрициевой сумки, а затем распространяются в других органах. Синдром расстройства всасывания характеризуется увеличением железистого желудка, иногда с некрозом и признаками катарального геморрагического энтерита [57, 123, 126, 215]. Известно, что реовирусы часто выделяются при энтеритах, синдроме малабсорбции и синдроме повышенного отхода птиц, однако их этиологическая роль в патогенезе указанных болезней до конца не изучена. Установлено, что реовирусы оказывают иммуносупрессивное действие на организм больной птицы и это способствует усилению патогенности других инфекционных агентов, включая кокцидии, Cryptosporidium spp., Escherichia coli и возбудителя анемии птиц [43]. Возможно, иммуносупрессия является также причиной проявления таких заболеваний, как синдром малабсорбции и синдром повышенного отхода птиц [36,159].
Различают несколько серотипов реовирусов птиц (в США - 4, в Японии - 5 вариантов). В Японии известны 2 штамма реовируса птиц – «IR-R» и вирус нефрита птиц – «JR-R». Высказано предположение о существовании не менее 11 серотипов этого вируса. Установлена связь между патогенностью реовируса птиц и его серотипом. Реовирусы, выделенные от кур, имеют групповой антиген, выявляемый в ИФА, РСК и РДП. Реовирусы птиц не связаны с таковыми млекопитающих. Антисыворотки против реовируса 3-го типа нейтрализуют птичий реовирус «S1133». При наличии серологического родства между штаммами Кроули («CR») и «ИМ-1-203» первый оказался менее авидным к нейтрализующему действию сыворотки, чем второй. По некоторым данным реовирусы, выделенные от индеек и кур, не отличались в антигенном отношении [1]. Реовирус 3-го типа выделен от цыплят, больных теносиновитом кур (в США штамм «ИМ-1-203», в Италии штаммы «140» и «653») [94].
На сегодняшний день существует несколько методов выделения вируса РВТ. Одним из наиболее распространенных методов в РФ является метод выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью амплификации с использованием внутреннего контрольного образца и секвенирования участков генов S3 и S1, разработанный в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Установлено, что наибольшей аналитической и диагностической чувствительностью обладает метод ОТ-ПЦР. Данный метод предложен как основной для индикации генома реовируса кур, а методы PK-S3A и PK-S1 -как вспомогательные для генетического анализа выявленных изолятов. Благодаря этому методу выявлены факты одновременной циркуляции в птицеводческих хозяйствах вируса, близкого к вакцинному штамму «S1133» и полевого вируса, а также полевых вирусов, принадлежащих к одной или к разным генетическим группам [6].
Интересны особенности изолятов, выделенных в хозяйствах при одних клинических признаках, например, при диарее, которые не вызывали такие же патологические изменения в экспериментальных условиях. В работах Van der Heide et al. был использовал патматериал (пораженные участки кишечника) от птицы с клиническими признаками диареи. Заражение данным изолятом вызывало переломы бедренной головки и остеопороз, однако не приводило к соответствующему индуцированию диареи у цыплят, экспериментально зараженных реовирусом [223].
Исследователи Page et al. выделили реовирусы у поголовья с экспериментально вызванной хромотой, задержкой роста и неравномерным развитием оперения. Хотя пероральная инокуляция реовируса восприимчивым цыплятам-бройлерам обнаруживала явное влияние на прирост массы, развитие оперения и наличие поражений в ряде органов, о наличии диареи или жидкого помета не сообщалось [159, 182]. Rosenberger et al. также выделили несколько штаммов реовирусов из сухожилий и костного мозга цыплят-бройлеров, выращенных на птицефермах. Хотя цыплята, зараженные этими штаммами реовирусов, были обследованы на наличие клинических признаков заболевания, признаков диареи у птицы не выявлялось [199, 202].
Hieronymys et al. сообщали о выделении нескольких штаммов реовируса из кишечника цыплят с подозрением на МАС и установили антигенную взаимосвязь этих штаммов со штаммом реовируса «S1133», который обычно используется в качестве вакцинного штамма для борьбы с инфекционным теносиновитом. Эти авторы подтвердили, что несмотря на то, что реовирусы были выделены от цыплят с клиническим MAС, пока еще не доказано, что эти реовирусы являются этиологическим агентом MAС [117].
В РФ исследования по экспериментальному инфицированию РВТ восприимчивой птицы были проведены Трефиловым Б.Б. и др. На основе полученных данных штаммы реовирусов птиц были подразделены на низко-, средне- и высокопатогеннные. Штаммы и изоляты, классифицированные как патогенные, вызывали высокую смертность, задержку роста и развития, а также индуцировали выработку стойкого гуморального иммунитета. В исследованиях использовали вакцинный штамм «ВНИВИП-ДЕП», эпизоотический штамм «СП-73», вирусные изоляты «К» и «С-02». Были сделаны выводы, что репродукция реовируса птиц в развивающихся куриных эмбрионах сопровождается изменениями в ХАО и внутренних органах зародышей, нарушением гемодинамики эмбриона (увеличением порозности сосудов) и дегенеративно-некротическими процессами в органах. Характер поражений зависит от биологических характеристик реовируса, его активности и начальной дозы [8, 36, 43].
Большинство современных живых и инактивированных моно-и поливалентных вакцин изготавливаются на основе ранее полученных изолятов. К наиболее известным и широко применяемым относятся штаммы «1133», «1733», «2408» «ВНИВИП-ДЕП» и «АВИВАК-РЕО». Однако стоит отметить, что данные штаммы были получены из близкородственных изолятов и незначительно отличаются в антигенном отношении друг от друга. Большая часть вакцинных препаратов создается на основе уже известных штаммов, но под различными коммерческими названиями. Исследование новых изолятов сводится к изучению их биологических и антигенных свойств. Зачастую дальнейшая работа по внедрению штаммов в биологическую промышленность не проводится [145].
При систематизации существующих данных некоторые исследователи пришли к выводу, что выделение изолятов РВТ, их вирусологические и микробиологические исследования являются актуальной проблемой, требующей решения [145, 166, 223]. Поэтому в настоящее время необходимость в получении вакцин на основе новых штаммов, индуцирующих эффективную защиту против РВТ, является достаточно актуальной [181, 212, 213].
Для культивирования реовирусов используют различные первичные и перевиваемые клеточные культуры. Выявлено 18 первичных и 11 перевиваемых чувствительных линий клеточных культур (ВНК-21, Vero, Нер 2, BS-C-1 и др.). Цитопатологические изменения характеризуются разряжением монослоя, отделением клеток от стекла, вакуолизацией, появлением аморфных эозинофильных включений, синцитиальных образований и симпластных комплексов, содержащих два или несколько ядер [9, 39, 73, 190]. В культуре клеток ФЭК вирус вызывает ЦПД. На 4-5 сутки инкубации в зараженной культуре наблюдаются цитопатические изменения, выражающиеся в первичном округлении клеток и появлении зернистости в цитоплазме, а затем – в разрыве монослоя и образовании синцития.
Анализ эпизоотической ситуации по реовирусному теносиновиту в птицехозяйствах РФ в 2011-2018 гг
Серологические и вирусологические исследования, проведенные в РФ в течение 2000-2005 гг., свидетельствуют о широком распространении реовирусной инфекции и ассоциированных форм ее течения у птиц разного возраста в хозяйствах РФ. Отмечается ежегодное возрастание средних значений титров антител к реовирусной инфекции и иммунологическая обусловленность существования восприимчивых к заражению возрастных групп птицы [36]. По результатам серологического мониторинга, проведенного в 2000-2002 гг. в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир) Куприяновым А.И. и Шкирей В.И., установлено, что реовирус широко распространен в птицеводческих хозяйствах на территории РФ. У невакцинированных кур-несушек и бройлеров повсеместно регистрировали специфические антитела к реовирусу [6]. В период 2007-2011 гг. Зиняковым Н.Г. с применением метода ОТ-ПЦР и выбранной системы праймеров на ген S3 с целью выявления генома реовируса кур было происследовано более 350 проб патологического материала, который поступил из 62 птицефабрик России, Украины и Республики Беларусь. В 117 пробах были выявлены фрагменты вирусного генома (33% от общего количества исследованных проб). Таким образом, данные указанных проведенных исследований демонстрируют сохранение проблемы реовирусного теносиновита кур на птицеводческих предприятиях РФ [25]. По последним зарубежным данным, в США, начиная с конца 2011 года, у коммерческих бройлеров, полученных от вакцинированных против реовирусного теносиновита кур, наблюдалось значительное увеличение количества клинических случаев теносиновита. В период с 2011 по 2013 гг. были выявлены вариантные подгруппы, принадлежащие к 1 и 5 генотипам. Было установлено, что варианты, принадлежащие к 1 генотипу, были на 80% схожи со штаммами, входящими в составе коммерческих вакцин, тогда как варианты, принадлежащие к 5 генотипу, были менее чем на 50% схожи с вакцинными штаммами. Экспериментальные исследования с использованием репрезентативных полевых изолятов, принадлежащих к обоим генотипам, показали, что выделенные изоляты явились патогенными для бройлеров, у которых титры материнских антител после иммунизации живыми аттенуированными и инактивированными вакцинами оказались на высоком уровне [134].
В ФГБУ «ВНИИЗЖ» на протяжении многих лет проводится серологический мониторинг инфекционных болезней птиц, в том числе и РВТ. Цель данного этапа работы заключалась в анализе и систематизации данных, полученных при исследовании сывороток крови кур разных возрастных групп, поступивших из птицеводческих хозяйств РФ.
В период 2011-2018 гг. в лаборатории эпизоотологии и мониторинга ФГБУ «ВНИИЗЖ» было исследовано более 62 тыс. сывороток крови кур на выявление антител к РВТ с применением метода ИФА. Объем проведенных серологических исследований и результаты по выявлению положительно реагирующих сывороток крови кур в ИФА представлены в таблице 1.
Необходимо отметить, что несмотря на уменьшение почти в 7 раз общего числа исследуемых проб, процент выявленных положительных проб в 2011 году оказался равен 82%, а в 2018 году - 78%. В среднем, процент выявления серопозитивных проб составил 70%. Таким образом, тенденция к выявлению антител к реовирусной инфекции продолжает сохраняться.
Осуществлен анализ распространения по регионам РФ положительных результатов среди отобранных проб. Сыворотки крови кур различных возрастных групп поступали из 86 птицефабрик яичного и мясного направления, расположенных в более чем 60 субъектах РФ. Наибольшее количество проб поступило и было исследовано из птицефабрик Центрального, Приволжского, Северо-Западного и Дальневосточного федеральных округов. Серопозитивные пробы были выявлены в птицехозяйствах 41 субъекта РФ, при этом положительные пробы выявлены в 8 из 9 федеральных округов, за исключением Крымского федерального округа. Наибольшее количество положительных проб было выявлено в Центральном (32%), Приволжском (27%) и Северо-Западном (21%) федеральных округах. На риунке 1 показаны федеральные округа, в которых выявлены антитела к РВТ.
Антитела к РВТ были выявлены в 83 из 86 исследуемых птицехозяйств. Большинство птицефабрик тестировалось неоднократно. Несмотря на то, что по многочисленным литературным данным (36, 70, 137) заболеванию РВТ больше подвержены куры мясных пород, пробы сывороток крови кур поступали в значительно большем количестве из птицеводческих хозяйств яичного направления, процент выявления положительных проб в данной категории птицефабрик был соответственно выше. По данным серологических исследований ИФА доля птицехозяйств с серопозитивными пробами составила 74% - по яичному и 26 % - по бройлерному направлению. На протяжении восьми лет сохраняется стабильная ситуация по выявлению серопозитивных проб среди птицефабрик яичного направления. Был проведен анализ количества сывороток крови кур, полученных из птицефабрик, с применением вакцинации против РВТ и без иммунизации птиц. Оказалось, что 67 % положительных сывороток крови кур поступили из птицехозяйств, не применяющих вакцинацию против РВТ птиц.
Осуществлена оценка распределения серопозитивных вакцинированных кур в зависимости от возраста. Положительные пробы были разделены по следующим возрастным группам: 1) 1-14 суток; 2) 15-45 суток; 3) 46-100 суток; 4) 101-200 суток; 5) 201-300 суток; 6) 301-400 суток; 7) 401-500 суток. Полученные результаты представлены на рисунке 2.
Из рисунка 2 видно, что в возрастной группе 1-14 суток наблюдается высокий уровень выявления положительных проб – 63,6 %, что связано с наличием материнского иммунитета. В возрастной группе 15-45 количество положительных сывороток составляет 27,8 %, что является существенным и может свидетельствовать об инфицированности поголовья птиц, так как под данную группу попадают бройлеры, которых не вакцинируют на птицефабриках и у которых действие материнского иммунитета закончилось.
В последующем с 46 по 100 день наблюдается наименьший процент положительных проб, который составляет 18,4 %. Постепенное увеличение наблюдается в возрастной группе 101-200 дней, вероятно, это связано с проведением вакцинации родительского стада, которая как правило начинается за месяц до начала яйцекладки. В возрасте 201-300 дней фиксируется увеличение количества положительных сывороток. Наибольший процент положительных проб выявляли в возрастной группе от 301 до 400 суток (78,9 %). После 401-суточного возраста наблюдается уменьшение положительных сывороток. Очевидно, что увеличение количества положительных проб в возрастной группе до 401 дня связано с проведением вакцинации родительского стада против РВТ, процент положительных проб в данной возрастной группе возможно свидетельствует о формировании стойкого напряженного иммунитета к вирусу РВТ.
Проведен анализ распределения положительных сывороток в зависимости от возраста птицы из птицехозяйств, в которых не применяется вакцинация поголовья против РВТ. Положительные сыворотки, поступившие с различных птицефабрик, были распределены по группам в зависимости от возраста: 1) 1-14 суток; 2) 15-100 суток; 3) 101-200 суток; 4) 201-300 суток; 5) 301-400 суток; 6) 401-500 суток. Результаты исследований представлены на рисунке 3.
Из данных, представленных на рисунке 3, видно, что у птиц в возрасте 1 14 дней фиксируется значительный процент положительных проб, находящийся на уровне 75,8%. Начиная с 15 дня число положительных сывороток снижается в полтора раза и сохраняется приблизительно на одинаковом уровне до 300-дневного возраста и составляет в возрастной группе 15-100 дней – 50,1%, в возрастной группе 101-200 дней – 45,7% и возрастной группе 201-300 дней – 54,2%. С 301 дня наблюдается резкое снижение количества положительных проб до 28,3%. Процент выявления положительных сывороток у птиц старше 401-дневного возраста оказался невысоким и составил 8,2%.
Адаптация штамма «ARV04/02» реовируса птиц к различным культурам клеток
В мировой практике для культивирования реовируса используется первично-трипсинизированная культура клеток ФЭК. Как правило, реовирус размножается в культуре ФЭК с наличием четко выраженного ЦПД уже на третьи сутки. Данная культура считается наиболее оптимальной для репродукции реовируса. Первичная клеточная культура, полученная от цыплят, инфицированных реовирусом, характеризуется образованием синцития, что происходит через 24 – 48 часов, с последующей дегенерацией и отслоением клеток, в результате которой остаются полости в монослое. В инфицированных клетках отмечаются цитоплазматические включения, которые могут быть или эозинофильными или базофильными. Изменения морфологии клеток и монослоя являются главным критерием для оценки цитопатического действия реовируса птиц и определения его инфекционной активности.
При проведении испытаний первичную культуру клеток ФЭК готовили из 10-12-дневных SPF-эмбрионов кур фирмы «Valo BioMedia» (Германия). Трипсинизацию эмбрионов проводили по общепринятой методике 0,25% раствором трипсина рН 7,5. Посевная концентрация клеток ФЭК составляла: для пенициллиновых флаконов – 400-500 тыс/ см3, для клинских матрасов – 200-300 тыс/ см3, для роллерных сосудов –1,2-1,5 млн. кл/см.
Так же в работе использовали перевиваемые культуры клеток: Vero (почка африканской зелёной мартышки), ПСГК-30 (почка сибирского горного козерога), Taurus-4 (почка телёнка), Marc-145 (почка макаки–резус).
После инокуляции культуры клеток выращивали до стадии хорошо сформированного монослоя без признаков дегенерации. Перевиваемые культуры высевали во все перечисленные сосуды в концентрации 50-100 тыс. кл./см. Вирус вносили после формирования конфлюэнтного монослоя. В качестве ростовой питательной среды использовали синтетическую питательную среду ПСП с 10 % сывороткой крови КРС, рН 7,0-7,1. В качестве поддерживающей среды использовали так же питательную среду ПСП с 2 % инактивированной сывороткой крови КРС, рН 7,3-7,5. Монослой культуры клеток отмывали солевым раствором Хенкса, рН 7,1-7,2.
Полученный реовирус птиц титровали в пенициллиновых флаконах на гомологичных культурах клеток методом последовательных 10-кратных разведений. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3.
На первом этапе работы производили адаптацию штамма «ARV04/02» реовируса птиц к различным культурам клеток и определяли наиболее чувствительную и эффективную клеточную систему для его репродукции. В процессе скрининга были использованы следующие клеточные линии: ФЭК, Vero, ПСГК-30, Taurus-4, Marc-145. Культуры клеток выращивали в 50-граммовых пластиковых матрасах в течение 2 суток. Множественность заражения составила 0,1 ТЦД50/кл. На каждой клеточной культуре было проведено пять пассажей. На всех пассажных уровнях каждые 24 часа наблюдали проявление ЦПД в клеточном монослое. Съём вируса производили при 80-90% поражении монослоя клеток. Вируссодержащий материал каждого пассажа титровали на культуре клеток ФЭК. Результаты представлены в таблице 4.
Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что динамика и уровень накопления вируса в клеточных культурах были неодинаковы. Так, в клеточных культурах ФЭК и Vero к 5 пассажу титр был значительно выше, чем в клетках ПСГК, Marc-145 и Taurus-4 и составил 6,75±0,14 и 6,53±0,15, соответственно. Однако в культуре клеток ФЭК инфекционный титр был несколько выше, чем в других клеточных линиях.
Уже на первом пассаже во всех культурах клеток наблюдалось ЦПД вируса, наиболее четко выраженное в клеточных линиях ФЭК и Vero. Картина ЦПД была различной. В культуре клеток ФЭК, монослой которой представлен в основном веретенообразными клетками, наблюдалось округление клеток и отслоение их от стекла. При первичном заражении стандартно выращенной клеточной культуры ФЭК реовирусом птиц уже на первые сутки отмечали первые признаки ЦПД, которое проявлялось в уплотнении монослоя гетерогенной популяции клеток ФЭК, увеличении зернистости и частичном отслоении некоторых клеток.
В культуре клеток Vero изменения наблюдались как в клетках, так и на уровне всего монослоя: по всей площади исследуемого монослоя присутствовали симпласты разного размера, которые включали в себя до 30 40 клеток. Ядра в гигантских симпластах прилегали плотно друг к другу, имели полиморфную структуры и по 1-2 ядрышка, как у нативного препарата. На первые сутки встречались также делящиеся клетки. На вторые сутки чрез 48 часов культивирования наблюдалась картина тотального ЦПД, на третьи сутки происходило тотальное поражение клеток и монослоя. Клетки, трансформированные в симпласты, отслаивались от субстрата и подвергались дальнейшим изменениям или разрушались до детрита. В симпластах образовалось множество вакуолей разного размера. Ядра также подвергались трансформации, приобретая чёткую сферическую форму, и уменьшаясь в размере. Трасформированные ядра клеток Vero соответствовали эозинофильным включениям при рутинной окраске препаратов.
Терминальная стадия ЦПД реовируса птиц на культуре клеток Vero характеризовалась формированием до 70% симпластов от всего монослоя клеток, их отслоением от субстрата и частичной агрегацией в суспензии (через 96 часов культивирования).
В культуре клеток Taurus-4 наблюдали появление «окон» в монослое и разрушение клеток, в культуре Marc-145 – образование округлых клеток и слияние их границ с образованием симпластов.
На представленных ниже рисунках отображена динамика цитопатических изменений в культуре клеток ФЭК, инфицированных реовирусом птиц штаммом «ARV04/02».
При дальнейшем культивировании вируса, через 48 часов происходит отслоение части клеток, образование объемных суспензионных агрегатов клеток и детрита (рис.11), а также закисление среды. В таком состоянии активность репродукции вируса снижается, поэтому для дальнейшего культивирования вируса необходимо скорректировать рН до 7,3-7,5 или произвести съем вируссодержащего материала (промораживание).
В результате проведенной экспериментальной работы и анализа полученных данных установлено, что штамм реовируса птиц «ARV04/02» способен к репродукции во всех исследуемых линиях клеток: ФЭК, Vero, ПСКГ-30, Taurus -4, Marc -145 уже на первом пассаже. Однако в клеточной культуре ФЭК уровень накопления вируса был выше, чем в остальных перевиваемых линиях и находился на уровне 6,75±0,14 lg ТЦД50/см3. Титр вируса в культуре клеток Vero также находился на достаточно высоком уровне и составил к пятому пассажу 6,53±0,15 lg ТЦД50/см3, в связи с этим данная перевиваемая культура клеток может быть рекомендована в качестве альтернативной системы для культивирования штамма «ARV04/02» реовируса птиц.
Сравнительная оценка масляных адъювантов в составе полиштаммной инактивированной вакцины против РВТ
В последнее время в практику вошел новый тип адъювантов, приготовленных на основе минеральных и неминеральных масел и их смесей. При применении в составе вакцины такого адъюванта, предварительно растворенный или суспендированный в воде антиген, очень тонко диспергирует в масле, в результате чего получают эмульсию типа «вода в масле». Впервые значительное увеличение синтеза антител при иммунизации эмульгированными антигенами отметил Фрейнд.
Для изготовления образцов эмульгированной вакцины использовали смесь суспензий антигенов вируса РВТ штаммов «1133», «1733» и «ARV04/02», взятых в процентном соотношении 25:25:50, соответственно, и масляные адъюванты Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 760 VG, Montanide ISA 763 А VG фирмы «SEPPIC» (Франция), а также Montanide ISA 70 VG с добавлением ФРБ-8 (фракция на основе культуральной среды гриба Fusarium Sambucinum) и Emulsigen D.
Адъюванты Montanide ISA 70 VG, ISA 70 VG + ФРБ-8, ISA 760 VG и ISA 763 А VG смешивали с суспензией антигена в соотношении 70:30. Смеси эмульгировали на лабораторном эмульсоре «Silverson Sealed Unit L4R» (Англия) при скорости ротора 6000 об/мин в течение 6 мин.
Адъювант Emusigen D смешивали с суспензией антигена в соотношении 20:80 и взбалтывали.
Приготовленными образцами вакцины иммунизировали цыплят 40-суточного возраста. До вакцинации и через 28 суток после иммунизации у цыплят отбирали пробы крови для получения сывороток крови, которые исследовали на наличие антител к вирусу РВТ методом ИФА с использованием коммерческого набора фирмы «Synbiotics» (США).
Образцы вакцины считали антигенноактивными, если титр антител в сыворотке крови не менее чем у 80% вакцинированных цыплят через 28 суток после иммунизации составлял не ниже 1700.
На 28 сутки после вакцинации хорошие результаты показали образцы, изготовленные на основе адъювантов: Montanide ISA 70 VG – 5280±126; Montanide ISA 763 A VG – 4384±136 и Montanide ISA 760 – 3789±118. Образцы вакцины на основе адъювантов Montanide ISA 70 VG + ФРБ-8 и Emulsigen D показали результаты хуже, титры антител у привитых цыплят составили 2875±141 и 1939±120, соответственно. Однако, образец, изготовленный на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, показал наибольшую иммуногенную активность, и в дальнейшем может быть использован для изготовления данной вакцины.