Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Вирусный иммунодефицит кошек: состояние изученности вопроса в историческом аспекте и эпизоотическая ситуация 9
2.2 Характеристика возбудителя иммунодефицита кошек и его генетических детерминант, патогенез инфекции 20
2.3 Методы лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек вирусологические, микроскопические, серологические и молекулярно - генетические
2.3.1 Вирусологические методы исследования 28
2.3.2 Микроскопические методы исследования 29
2.3.3 Серологическая диагностика ретровирусных инфекций кошек 31
2.3.4 Полимеразная цепная реакция в диагностике ретровирусных инфекций кошек: преимущества, недостатки, модификации метода 34
3 Собственные исследования 41
3.1 Материал и методы исследования 41
3.2 Результаты исследований
3.2.1 Эпизоотическая обстановка по вирусному иммунодефициту кошек в Саратове и Саратовской области 44
3.2.2 Изучение влияния возбудителя вирусного иммунодефицита кошек на основные клетки - мишени 49
3.2.3 Совершенствование лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек
3.2.3.1 Сравнительный анализ эффективности серологической и молекулярно-генетической диагностики FIV 58
3.2.3.2 Анализ молекулярно-генетической структуры FIV и FeLV 60
3.2.3.3 Разработка способа детекции FIV методом классической ПЦР 65
3.2.3.4 Разработка способа детекции FIV и FeLV методом мультиплексной ПЦР
4 Заключение 78
5 Благодарности 84
6 Список сокращений и условных обозначений 85
7 Список литературы
- Методы лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек вирусологические, микроскопические, серологические и молекулярно - генетические
- Серологическая диагностика ретровирусных инфекций кошек
- Эпизоотическая обстановка по вирусному иммунодефициту кошек в Саратове и Саратовской области
- Разработка способа детекции FIV методом классической ПЦР
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Вирусный иммунодефицит кошек
является тяжелым неизлечимым заболеванием, возбудитель которого, Feline
immunodeficiency virus (FIV), поражает нервную и иммунную системы
животного. Развитие болезни протекает медленно, характеризуясь
полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью. Вирусный
иммунодефицит кошек относятся к инфекциям, не поддающимся
специфической профилактике.
В эндемичных регионах степень инфицирования кошек вирусным иммунодефицитом может составлять 41 % и более, в частности, среди диких представителей семейства кошачьих, таких как горные львы, пумы, гепарды и др., что ставит под угрозу существование популяций редких видов животных (Muchaamba F. et al., 2014).
Возбудитель этого заболевания - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae. В настоящее время антиретровирусная терапия кошек ограничена высокой стоимостью лечения и выраженной токсичностью препаратов. По этой причине диагностика вирусного иммунодефицита является основным способом контроля распространения данной инфекции (Бажибина Е.Б., Бажибина В.А., 2016). При этом большинство исследователей сходятся во мнении, что эффективность молекулярно-генетических методов диагностики в силу уникальной природы ретровирусов намного выше других способов (Hartmann K., 2007; Бажибина Е.Б., 2011; Красникова Е.С., 2014).
Часто вирусный иммунодефицит осложняется другой неизлечимой инфекцией - вирусной лейкемией кошек. Это усугубляет тяжесть течения заболевания и затрудняет диагностику инфекции, так как в случае поражения вирусом лейкемии костного мозга у животного развивается иммунодефицитное состояние. Вирусный иммунодефицит кошек, а также лейкемия являются на сегодняшний день одной из самых частых причин гибели кошек во всем мире, что обусловлено также высокой контагиозностью заболеваний (Hartmann K., 2012; Соломахина Л.А.,2016).
Степень разработанности темы. Изучению вирусного иммунодефицита кошек посвящен ряд работ отечественных и зарубежных исследователей. Однако, несмотря на многолетний опыт и многочисленные попытки, до сих пор так и не удалось создать эффективную вакцину, защищающую кошек от заражения вирусным иммунодефицитом. Не получила распространения в силу низкой эффективности и малой доступности терапия этого заболевания у животных. Наиболее распространенные диагностические тесты имеют ряд ограничений. Так, эффективность серологической диагностики снижается в связи с иммунотропностью вируса и склонностью инфекции к длительной латенции. Другие методы (вирусологические, ПЦР в реальном времени) малодоступны из-за сложности выполнения или необходимости наличия специального оборудования (Hartmann K., 2015).
Тем не менее, высокая степень распространения вирусного
иммунодефицита кошек, обусловленная малой эффективностью существующих превентивных мероприятий, учитывая тенденцию к сочетанному протеканию ретровирусных инфекций кошек, свидетельствуют о необходимости изучения данных заболеваний и совершенствования методов их диагностики.
Цель и задачи исследования. В связи с этим целью наших исследований явилась разработка высокочувствительного и специфичного способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек.
В соответствии с целью, нами были определены следующие задачи:
-
Оценить эпизоотическую обстановку по вирусному иммунодефициту кошек в Саратовской области с учетом лейкемии.
-
Охарактеризовать ультрамикроскопические изменения, возникающие в лимфоцитах переферической крови кошек при ретровирусных инфекциях.
-
Сравнить эффективнось серологической и молекулярно-генетической диагностики вирусного иммунодефицита кошек.
-
Провести сравнительный компьютерный анализ полногеномных последовательностей и сиквенсов отдельных генов ретровирусов кошек.
-
Разработать эффективные и доступные способы молекулярно-генетической диагностики и дифференциальной диагностики вирусного иммунодефицита кошек.
Научная новизна. Впервые выявлены эпизоотологические
закономерности распространения вирусного иммунодефицита кошек в г. Саратов и Саратовской области, как среди домашних, так и среди бродячих животных.
Впервые изучены морфометрические и биофизические характеристики лимфоцитов кошек, инфицированных вирусами иммунодефицита и лейкемии в сравнении с лимфоцитами интактных животных.
Разработаны, запатентованы и внедрены в практику два новых способа эффективной детекции вируса иммунодефицита кошек с возможностью дифференциальной диагностики инфекции от иммунодефицитной формы лейкемии кошек.
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных исследований.
Выявленные эпизоотологические закономерности распространения вирусного иммунодефицита кошек в г. Саратов и Саратовской области дают возможность изучить характер развития эпизоотического процесса в зависимости от образа жизни животных и оценить эффективность превентивных мероприятий в условиях отдельно взятого региона. Полученные данные топографических и биофизических изменений в инфицированных лимфоцитах восполняют недостающие сведения и формируют базу для более глубокого понимания патологического процесса в организме инфицированного животного.
Внедрение в ветеринарную практику двух разработанных и
запатентованных способов эффективного выявления кошек, инфицированных
вирусом иммунодефицита, с возможностью дифференцировать данную патологию от иммунодефицитной формы лейкемии кошек, позволит успешно контролировать эпизоотическую ситуацию по данным инфекциям, так как своевременная диагностика в настоящее время является приоритетным способом контроля этих заболеваний.
Методология и методы исследований. Для решения поставленных задач использован комплекс как общенаучных, так и частнонаучных методов исследования.
Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, измерение, анализ, сравнение, эксперимент, моделирование, в том числе компьютерное, статистическая обработка результатов и т.д.
Из частнонаучных использованы эпизоотологические, микроскопические, молекулярно-генетические, серологические, морфометрические, и другие методы исследования, выполненные на высокотехнологичном оборудовании научных подразделений ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ, ФГБОУ ВО Ульяновский ГУ, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
-
Вирусный иммунодефицит кошек широко распространен в г. Саратов и Саратовской области, характеризуется выраженными эпизоотическими закономерностями и часто регистрируется сочетано с лейкемией.
-
Патогенетическая сущность вирусного иммунодефицита кошек выражается комплексом морфологических и биофизических изменений, развивающихся в инфицированных лимфоцитах.
-
Информативность молекулярно - генетической детекции вируса иммунодефицита кошек значительно превосходит таковую серологической, что положено в разработку новых подходов к диагностике и дифференциальной диагностике данной инфекции.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов обусловлена значительным объемом экспериментального
материала, полученного с использованием высокоинформативных методов исследования в лабораторных и производственных условиях с подтверждением данных математической статистикой.
Основные материалы диссертационной работы представлены, обсуждены
и одобрены на межвузовских, Международных, межрегиональных,
Всероссийских научно-практических конференциях: «Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития», г. Саратов, 2014; «Актуальные направления инновационного развития животноводства и ветеринарной медицины», посвященная 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, доктора биологических наук, профессора Петра Трофимовича Тихонова, г. Уфа, 2014; «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России», г. Пенза, 2014; «Молодежь и наука XXI века», г. Ульяновск , 2014; «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», Троицк, 2015; «Актуальные проблемы и
перспективы развития ветеринарной медицины, зоотехнии и аквакультуры», г. Саратов, 2016; "Современные аспекты сельскохозяйственной микробиологии", приуроченная к 120-летию со дня создания кафедры микробиологии и посвященная юбилейной дате - 150-летию со дня рождения основателя кафедры и ее первого заведующего, профессора Н.Н. Худякова, г. Саратов, 2016.
Личный вклад соискателя. Все эпизоотологические, микроскопические, молекулярно-генетические исследования, а также статистическая обработка полученных результатов проведены непосредственно автором. Личный вклад соискателя составляет 90 %.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 12 научных статьях, в том числе в 4 изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. По результатам исследований получены 2 патента РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 109 страницах стандартного компьютерного текста и включает в себя введение, основную часть, заключение и приложения. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 26 рисунками. Список использованной литературы включает в себя 178 источника, в том числе 147 иностранных.
Методы лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек вирусологические, микроскопические, серологические и молекулярно - генетические
Первый случай выделения вируса иммунодефицита кошек (FIV) был зарегистрирован в 1986 году в питомнике северокалифорнийского города Паталума ветеринарным врачом Педерсеном и его коллегами (Pedersen N.C. et al., 1987). После этого вирус был обнаружен в Швейцарии и в других европейских странах таких, как Великобритания, Франция и Голландия. В настоящее время заболевание приобрело эндемичный характер у кошек по всему свету. Оно сопровождается развитием разнообразных клинических симптомов, что влечет за собой нарушение правильного функционирования иммунной системы. При этом в колонии не была выявлена инфекция, вызванная вирусом лейкемии кошек. Секвенирование дало основание отнести вирус к семейству Retroviridae и его назвали Т-лимфотропный лентивирус кошек (ТЛЛК). (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp). Профессор патобиологии в колледже ветеринарной медицины Ямамото посвятил большую часть своей карьеры изучению этого заболевания и способов борьбы с ним. В 1985 году она основала лабораторию сравнительной иммунологии и ретровирологии в университете Дэвис. Вместе с Нильсом Педерсоном они трудились над выделением FIV, а уже в 1987 году обнародовали свои результаты в журнале Наука.
В 1991 году FIV был отнесен к роду Lentivirus семейства Retroviridae, а в 2002 род Lentivirus включили в подсемейство Orthoretrovirinae. В настоящее время в группе Feline lentivirus выделяют 6 генотипов: A, B, C, D, E и F, вирусное разнообразие среди FIV определяет ген env (Olmsted R.A. et al., 1989). Помимо этого, в природных популяциях выявлены несколько интер подтипов FIV-рекомбинантов: A/B, A/C и B/D (Bachmann M.H. et al., 1997; Hayward J.J., Rodrigo A.G., 2008). Кроме всего прочего изучаемый вирус отличается особым генетическим разнообразием: последовательности нуклеотидов могут изменяться до 15% внутри подтипов и до 38% между подтипами. (Сулимов А.А., 2004). Субтип А распространен в Австралии, Новой Зеландии, Соединенных Штатах, Южной Африке и Северо-Западной Европе (Steinrigl A., Klein D., 2003; Kann R. et al., 2006a; 2006b; 2007a; 2007b). Подтип B был выявлен в Центральной и Восточной части США, Центральной Европе, Бразилии, Восточной Японии (Sodora D.L. et al., 1994; Kakinuma S. et al., 1995; Pistello M. et al., 1997; Nishimura Y. et al., 1998; Steinrigl A. Klein D., 2003; Martins A.N. et al., 2008). Субтип С – в Канаде, Новой Зеландии и юго-Восточной Азии (Uema M. et al., 1999; Nakamura K. et al., 2003; Reggeti F. et al., 2004). Подтипы D и Е встречаются редко, обнаружены на юго-западе Канады, в Японии и в Аргентине (Pecoraro M.R. et al., 1996; Nishimura Y. et al., 1998). Вариант F определен сравнительно недавно и территория его распространения недостаточно изучена (Westman M.E. et al., 2015).
Возбудитель вирусного иммунодефицита кошек, Feline immunodeficiency virus (FIV), включен в род лентивирусов. Лентивирусы не являются онкогенными и способны приводить организм к медленным, хроническим и дегенеративным патологическим изменениям в инфицированном организме, часто их относят к развитию аутоиммунных поражений (Desrosiers R.А., 2001). Все лентивирусы поражают прежде всего моноциты и макрофаги крови. FIV инфицирует Т-клетки и, следовательно, связан в основном с клиническими признаками иммунодефицита в зараженном организме (Turelli P. et al., 1997; Chen H. et al., 1999; Agnarsdttir G. et al., 2000).
Вирус лейкемии кошек (FeLV), являющийся близкородственым FIV, впервые обнаружил у домашних животных доктор Джарнетт в 1964 году в Шотландии в Университете Глазго. FeLV включает в себя пять подгрупп согласно антигенным различиям, детерминированных геномом. Различают A, B, С, Т и D типы вируса. Возбудитель лейкемии кошек существует в двух формах -экзогенной (патогенной) и эндогенной (непатогенной). (Anderson M.M. et al., 2000).
Эпизоотическая ситуация по вирусному иммунодефициту кошек Вирусный иммунодефицит относят к контагиозным инфекциям. Его возбудитель переносятся контактно, аэрогенно, алиментарно, трансмиссивно. Существует как в клетках гемопоэтической системы, так и в слизистых оболочках респираторных путей и желудочно-кишечного тракта. Можно выделить со слюной, мочой и калом животных, которые заболевают.
Вирусом иммунодефицита страдают все без исключения из семейства кошачьих. В их числе и львы, и пумы, и снежные барсы, и леопарды, тигры, пантеры, ягуары, рысь и манула. Данное заболевание признано природно-очаговым. Так в Северной Америке FIV инфекция обнаружена у пум – 41 %, рыси – 22 %, домашней кошки - 10%. Распространение вируса кошачьего иммунодефицита обуславливается прежде всего видом и возрастом животных и на него не влияет географическое местоположение. (Troyer J.L. et al., 2008; VandeWoude S. et al., Poss M., 2010). Филогенетический анализ дает возможность понять, что FIV переносится всеми кошачьими, по причине того, что адаптация вируса к ним была достаточно давно, более 10000 лет назад (Frank L. et al., 2005; Antunes A. et al., 2008; Pecon-Slattery J. et al., 2008). Известно также, что FIV поражает и африканских гиен. (VandeWoude S. et al., 2006).
Вирус иммунодефицита кошек нашел наибольшее распространение среди бездомных животных и в семьях, где одновременно проживают нескольких питомцев. Скорость распространения вируса напрямую зависит от числа бродячих кошек, при этом даже в развитых странах патология существует у 20 % всей популяции кошачьих. Данной инфекции свойственны два пути передачи возбудителя. Горизонтальная передача наблюдается при непосредственном близком контакте. Зачастую заражение производится через слюну при драках кошек. Это послужило причиной половой детерминации вируса и объясняется тем, что среди самцов ВИК встречается в три раза чаще. Вертикальный способ передачи возбудителя инфекции фиксируется намного реже и на сегодня его механизм детально не изучен. При этом до сих пор нет достоверных данных о половом способе заражения кошек.
Серологическая диагностика ретровирусных инфекций кошек
Обязательным считается использование высококипящего масла, это защитит от испарения реакционную смесь, в случае, если в приборе для проведения ПЦР не предусмотрена крышка с подогревом.
Специфичность ПЦР характеризуется образованием комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.
ПЦР проводят в амплификаторе, который способен с заданным интервалом времени охлаждать и нагревать пробирки со смесью. Современные амплификаторы используют сложные программы, дают много возможностей для проведения исследований. Выпускаются приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, это помогает встраивать их в автоматизированные системы. (Глик Б., Пастернак Дж., 2002)
Если в исследуемом образце имеется искомая ДНК, то происходит ее амплификация, каждый цикл которой проходит в определенном температурном интервале. Любой вид амплификации проходит в три стадии:
1. Денатурация - это процесс разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур, в результате которого происходит пространственное изменение белка, ДНК преобразуется из двухнитевой формы в однонитевую.
2. Отжиг подразумевает собой присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали необходимый участок и были комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, что является важным условием, поскольку без его выполнения проведение ПЦР невозможно. Для того чтобы сделать видимым заданный фрагмент ДНК часто используют гель-электрофорез.
3. Элонгация (синтез). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 -конца праймера.
Для того чтобы Taq-полимераза наиболее эффективно начала синтез второй цепи ДНК от 3 -конца праймера, который связан с матрицей, и двигалась в направлении от 3 к 5 , в системе необходимо создать оптимальную температуру.
Температурный цикл амплификации повторяется 30 и более раз. На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Впервые специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, можно наблюдать в конце второго цикла, они увеличиваются в геометрической прогрессии и очень скоро преобладают по числу среди продуктов амплификации (В.В. Зорина, 2012).
В настоящее время ПЦР-диагностика стремительно развивается. Совершенствуется сам метод, появляются новые разновидности ПЦР, на медицинском рынке появляются новые тест-системы для данной реакции. В простых случаях принципы, которые основаны на протоколах классической ПЦР, которые были разработаны К.Б. Мюллисом и др., показывают отличные результаты. При этом метод является оптимальным для амплификации коротких последовательностей, любых последовательностей в составе гомогенных векторных молекул на основе плазмид и хромосом бактериофагов. Если в реакционной смеси содержится несколько пар праймеров, которые будут специфичны разным генетическим локусам, это позволяет одновременно амплифицировать соответствующие участки ДНК-матрицы. Этот вид системы ПЦР носит название множественной ПЦР или мультиплексной. Этот способ используется, если условия проведения реакции будут оптимальны для всех пар праймеров. (Л.И. Патрушев, 2004).
В настоящее время метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real Time) является очень популярным и в клинической генодиагностике, и в научных исследованиях (T.Godfrey, D.Norwood, N Shaad, 2002)
Данный способ проведения реакции характеризуется изменением флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала напрямую зависит от концентрации конечного продукта ПЦР. Одно из главных преимуществ - синхронизация регистрации и амплификации. Благодаря этому определяется кинетика процесса, она зачастую прямо пропорциональна исходному количеству изучаемой ДНК. Прилагаемое программное обеспечение позволяет определять концентрацию исследуемого возбудителя автоматически, что сокращает трудо и энергозатраты в несколько раз, а также является самым эффективным в сравнении с другими количественными методами ПЦР-диагностики в реальном времени (Bustin S. A., 2000). При этом оборудование, на котором можно провести данный вид диагностики, стоит порядка 2 млн рублей, что может стать существенным фактором при отказе от него ветеринарных лабораторий и лечебниц.
Все модификации ПЦР направлены на обнаружение ДНК. Однако бывает так, что иммунная система кошек преодолела виремию, но, тем не менее, они будут положительными на наличие провируса. При этом в крови, слюне и фекалиях таких животных, вирус не будет присутствовать, соответственно, их эпизоотическая роль и прогноз в лечении будут иными, нежели у кошек с виремией (Gomes-Keller M.A. et al., 2006a). Возможность выявления вирусной РНК стала значимым аспектом в диагностике ретровирусов кошек (Gomes-Keller M.A. et al., 2006b). RT-PCR или ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) заключается в предварительной обработке пробы ревертазой, что приводит к переходу всех РНК в кДНК, которые и выявляют затем методом ПЦР в любой ее модификации. С помощью этого теста можно обнаружить и провести количественный анализ вирусной РНК в цельной крови, сыворотке, плазме, слюне или фекалиях. При этом чувствительность анализа настолько высока, что позволяет выявить одну инфицированную кошку в 30-ти объединенных пробах (Najafi H. et al., 2014).
Между тем, ПЦР обладает большим набором преимуществ, которые позволяют ему быть более конкурентоспособным в сравнении с традиционными микробиологическими методами: Скорость и высокая производительность. На весь процесс ПЦР - анализа от момента поступления образца до получения уже окончательного результата требуется обычно не более одного рабочего дня (Boyer М., Laterre P.F., Vannufel P., et al, 1998). Высокая специфичность.
Она исчисляется уникальностью генетического материала каждого вида микроорганизмов. При использовании праймеров, которые комплементарны определенной последовательности ДНК и соблюдении определенного режима, только ДНК искомого вида подвергается амплификации, даже если в пробе присутствуют другие ДНК, например, ДНК других микроорганизмов.
Эпизоотическая обстановка по вирусному иммунодефициту кошек в Саратове и Саратовской области
Материалом для исследований явились пробы цельной крови и слюны, полученные от кошек с различными клиническими осложнениями, поступившими в УНТЦ «Ветеринарный госпиталь» ФГБОУ ВО Саратовского ГАУ (n=93), пробы цельной крови от клинически здоровых кошек (n=265) и от бродячих кошек (n=30).
При работе с клиническим материалом применяли следующие методы исследования: микроскопический (атомно-силовая микроскопия (АСМ)), серологический (иммунная хроматография (ИХА)) и молекулярно-генетический (полимеразная цепная реакция - ПЦР). Для серологической диагностики FIV - инфекции определяли антитела к р24 антигену вируса в сыворотке или плазме крови инфицированных животных методом ИХА, с использованием набора Rapid FIV Ab производства Animal Genetics, inc. (Корея) или с помощью набора ВИД-Тест, выпускаемый НПО «Нарвак» (Россия).
Выделение и очистку нуклеиновых кислот для последующего опроведения ПЦР осуществляли с применением набора ДНК-сорб-В (ИнтерЛабСервис, Россия). Определение провирусов FIV и FeLV осуществляли с использованием наборов «ВИК» и «Лейкис» (ИнтерЛабСервис, Россия) методом Realime PCR на приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия).
Исследование вязко-эластических свойств мембран лимфоцитов кошек, инфицированных ретровирусами, осуществляли методом атомносиловой микроскопии (АСМ). Для АСМ-сканирования лимфоциты выделяли из периферической крови в градиенте плотности фиколл-урографина (плотность 1,077 г/мл) по стандартной методике. Адгезию осуществляли при 37 С 60 минут. Фиксировали адгезированные лимфоциты безводным метиловым спиртом 5 минут. Для оценки локализации клеток на препарате образцы окрашивали по Романовскому-Гимза. Для исследования поверхности клеток использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (НИТИ УлГУ, лаборатория сканирующей и зондовой микроскопии). Сканирование поверхности фиксированных препаратов проводили в полуконтактном режиме на воздухе. Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5-22,5 Н/м, резонансной частотой 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм. Для характеристики шероховатости поверхности образцов использовали среднюю арифметическую шероховатость (Ra), измеряемую в нанометрах (nm). Все полученные изображения сканированных поверхностей клеточных мембран обрабатывали в программе Nova 1.0.26.1443.
При разработке новых способов диагностики и дифференциальной диагностики FIV – инфекции сравнительный анализ структуры полногеномных сиквенсов и сиквенсов фрагментов геномов FIV и FeLV, размещенных на web ресурсе NCBI, и конструирование праймеров осуществляли методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ: «Нуклеотидные последовательности и характеристики геномов, вариабельных тандемных повторов, олигонуклеотидных праймеров и зондов штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций I–II групп патогенности» (Свидетельство о госрегистрации базы данных №2011620585 (авторы - Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Щербакова С.А.)) и «Программа расчета олигонуклеотидных праймеров на гомологичных геномах РНК-содержащих вирусов для их выявления в ПЦР и формирования базы данных» (Свидетельство о госрегистрации программ для ЭВМ №2013613699 (авторы - Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Щербакова С.А.)), а также с компьютерной программы GENERUNR (Hastings software, UK). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clusta W, кластерное дерево моделировали методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST (USA). Все показатели, полученные в результате проведения научно исследовательской деятельности, вычислялись как среднестатистические в повторных экспериментах. Статистическую обработку производили с помощью программы «Statistica 8.0, StatSoft Inc. (USA). Статистическую значимость различий оценивали на основе U-критерия Манна-Уитни, за значимые принимали различия на уровне значимости 95 % (p 0,05).
Разработка способа детекции FIV методом классической ПЦР
Согласно литературным данным и результатам собственных исследований ретровирусы широко распространены в популяции кошек. Чтобы эффективно контролировать распространение ретровирусов, необходимо учитывать специфичность биологии возбудителей: особенности их взаимодействия с макроорганизмом, механизм патогенетического воздействия и развития инфекционного процесса, особенности эпизоотических проявлений и много других факторов. Благодаря высокому адаптивному потенциалу ретровирусы распространились повсеместно. В эндемичных регионах степень инфицирования среди восприимчивых организмов стремиться к 100 % (Suh G.H. et al., 2005).
Иммунная система - одна из важнейших гомеостатических систем организма, которая во многом определяет степень здоровья, как людей, так и животных, и их адаптивные возможности (Федоров Ю.Н., 2006). Ретровирусы избрали ее местом своего паразитирования. Они медленно, но верно выводят ее из равновесия, уничтожают, а вместе с ней и зараженный организм, делая его уязвимым для любых агрессивных факторов внешней и внутренней среды (Corredor A.G et all, 2009).
Диагностика, в том числе дифференциальная, в ретровирусной патологии, несомненно, играет огромную роль. Важно вовремя выявлять инфицированных животных, чтобы защитить от заражения здоровых. В случае лейкемии кошек поможет вакцинирование, а при иммунодефиците – только изоляция. Защитить необходимо не только животных, но и человека. Животные, инфицированные вирусом лейкоза, представляют собой опасность и для определенных категорий людей, так как FeLV потенциально опасен для человека (Hartmann К., 2015).
Прогноз при заражении животных вирусами иммунодефицита и лейкемии неблагоприятный. Однако в последнее время ведутся активные поиски как протективных средств, так и препаратов специфической терапии, вызываемых данными вирусами заболеваний. Лечение заболеваний, вызываемых ретровирусами у животных, представляет большую трудность. Так как специфические антиретровирусные препараты не только токсичны, они также дорогостоящие и достаточно редкие. А поддерживающая терапия не дает ожидаемых владельцами животных результатов.
Поэтому владельцы животных должны ответственно подходить к своему выбору: брать кошек у проверенных заводчиков, а подобранных на улице животных обязательно подвергать исследованиям на носительство инфекции.
В общей сложности, серологическими и молекулярно-генетическими методами нами было исследовано 388 кошек. По нашим данным, из числа обследованных бродячих животных FIV-позитивными оказались 50 % кошек, а FeLV- положительными – 43 %. При этом сочетанное инфицирование обоими вирусами было выявлено у 33 % обследованных животных. Среди обследованных нами клинически здоровых животных лишь 9 % показывали наличие в крови провируса иммунодефицита кошек. Возбудитель FeLV у них обнаружен не был. Тогда как среди животных со стоматологическими проблемами, другими воспалительными поражениями слизистых оболочек и кожи FIV- носительство было установлено у 60 % кошек. У 37 % животных констатировали наличие FeLV. При этом в 23 % случаев у кошек регистрировали одновременно FIV-FeLV-микстинфекцию. Полученные нами результаты показывают довольно высокий уровень инфицирования животных, что коррелирует с данными мировой литературы (Sherry K. et al., 2011; Uhart M.M. et al., 2012).
При определении эпизоотологических закономерностей было установлено, что более половины инфицированных животных являлись самцами, треть – самками и лишь 16 % из них были вазэктомированными самцами. Согласно полученным данным наиболее часто вирусный иммунодефицит выявляется у котов, что можно объяснить их высокой агрессивностью и большей контактностью. Степень FIV-инфицирования у кошек с возрастом прогрессирует. Однако во взрослом состоянии организм способен более или менее эффективно сдерживать инфекцию. Поэтому некоторые исследователи констатируют, что FIV-инфекция, по большому счету, не сказывается на продолжительности жизни кошек (Orosz C.G. et al., 1985; Jenkins K.S. et al., 2013;Соломахина Л.А.,2016). По нашим данным среди FIV-инфицированых животных почти 90 % являлись представителями беспородных домашних кошек, не ограниченных в передвижении. Выявленные закономерности свидетельствуют о том, что для заражения вирусом иммунодефицита кошки должны регулярно контактировать с носителями инфекции. Единичные контакты, вероятнее всего, не приведут к заражению.
Результаты клинических исследований животных показали, латентное течение FIV-инфекции регистрируется в 4 раза чаще, чем острое, а наиболее частыми осложнениями FIV-инфекции являются: хронические рецидивирующие стоматиты, признаки поражения печени и почек, диарея, отиты, конъюнктивиты, риниты, поражения кожи, бронхиты и пневмония. Следует отметить, что в большинстве случаев наблюдалось сочетанное развитие симптомов, а клинические проявления носили рецидивирующий характер.
При АСМ-сканировании нами были установлены достоверные различия лимфоцитов крови здоровых и инфицированных ретровирусами кошек: инфицированные лимфоциты имели меньший диаметр и объем клеток, поверхность их была менее шероховатой, и при этом наблюдалось уменьшение величины модуля Юнга по сравнению с показателями лимфоцитов здоровых кошек.
Сравнительный анализ результатов серологических и молекулярно-генетических исследований показал, что диагностическая ценность ПЦР превышает эффективность ИХА при диагностике FIV-инфекции в 2,58 раз. Наши данные подтверждают результаты бразильских исследователей, показавших превосходство ПЦР по сравнению с ИХА в 2,65 раз (Furtado M.M. et al, 2013).
Результаты наших исследований подтверждают мнение ряда авторов, что с помощью ПЦР можно исследовать широкий диапазон биологического материала с высокой вероятностью обнаружения инфицирующих агентов (Pacitti A.M. et al, 1986; Gomes-Keller M.A. et al, 2006, 2009; Cattori V. et al, 2009;).