Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 16
1.1 Факторные инфекции животных: этиология и патогенез 16
1.2 Факторы персистенции микроорганизмов 23
1.3 Прикладные аспекты использования факторов персистенции микроорганизмов 35
II Собственные исследования 43
2.1 Материалы и методы исследований 43
2.1.1 Характеристика культур микроорганизмов 43
2.1.2 Отбор проб, выделение и идентификация микроорганизмов 46
2.1.3 Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 53
2.1.3.1Определение факторов персистенции микроорганизмов 53
2.1.3.2 Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов 60
2.1.4 Определение генетических детерминант бактериоциногении и вирулентности энтерококков 61
2.1.5 Полногеномное секвенирование фекального изолята Enterococcus faecium ICIS 96 64
2.1.6 Методы изучения регулирующего влияния биологически-активных веществ на персистентный потенциал микроорганизмов 65
2.1.6.1 Оценка антибактериальной активности антимикробных пептидов из тромбоцитов 65
2.1.6.2 Флуоресцентная микроскопия и спектроскопия в оценке биологического действия антимикробных пептидов 66
2.1.6.3 Методика изучения влияния АМП из тромбоцитов кур на перси-стентные свойства микроорганизмов 66
2.1.6.4 Методика изучения влияния синтетического производного индоли-цидина на факторы персистенции микроорганизмов 67
2.1.6.5 Методика изучения влияния фитосубстанций на персистентные свойства микроорганизмов 68
2.1.6.6 Определение антиоксидантной активности фитосубстанций 69
2.1.7 Методы изучения межмикробных взаимодействий 70
2.1.7.1 Методика совместного культивирования грибов рода Malassezia и бактерий рода Staphylococcus 70
2.1.7.2 Методика совместного культивирования грибов рода Candida и бактерий рода Enterococcus 70
2.1.8 Методы статистической обработки полученных результатов 71
2.2 Видовой состав микроорганизмов, выделенных от животных с факторными заболеваниями 72
2.2.1 Видовой состав микроорганизмов, выделенных от собак с наружными отитами 72
2.2.2 Видовое разнообразие микроорганизмов, выделенных при гнойно воспалительных заболеваниях собак (пиометра, конъюнктивит) 80
2.2.3 Видовой состав микроорганизмов, выделенных из секрета молочных желз коров 82
2.2.4 Видовой состав энтерококков, выделенных от здоровых животных и животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями 84
2.2.5 Видовой состав грибов рода Candida, выделенных от цыплят бройлеров 86
2.3 Характеристика биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от животных с факторными заболеваниями 88
2.3.1 Биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от собак с отитами 88
2.3.1.1 Факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от собак с отитами 88
2.3.1.2 Разработка программы для прогнозирования развития хронического наружного отита у собак 100
2.3.1.3 Резистентность условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при отитах, к антибактериальным и антигрибковым препаратам 104
2.3.2 Биологические свойства бактерий, выделенных от собак с пиометрой и конъюнктивитом 112
2.3.3 Биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов, изолированных из молока у здоровых коров и при разных формах мастита 117
2.3.3.1 Характеристика персистентного потенциала бактерий, выделенных из молока здоровых коров и секрета молочной железы при мастите 117
2.3.3.2 Прогнозирование развития субклинического мастита у коров стафилококковой и стрептококковой этиологии 121
2.3.3.3 Штамм бактерий S. aureus, используемый в качестве тест-культуры для отбора антибактериальных средств 124
2.3.4 Биологические свойства энтерококков, выделенных от здоровых животных и животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями 127
2.3.4.1 Персистентный потенциал бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных с факторными инфекциями 127
2.3.4.2 Разработка способа дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных 133
2.3.4.3 Разработка алгоритма для дифференциальной диагностики клинически значимых штаммов энтерококков и представителей нормальной микрофлоры животных 137
2.3.4.4 Анализ полного генома Enterococcus faecium ICIS 96 141
2.3.5 Биологические свойства Candida spp., выделенных из кишечника цыплят-бройлеров 143
2.3.5.1 Факторы патогенности и персистенции Candida spp. 143
2.3.5.2 Антибиотикорезистеность Candida spp., выделенных из помета цыплят-бройлеров 146
2.4 Регуляция персистентного потенциала микроорганизмов факторами различного генеза 150
2.4.1 Выделение антимикробных пептидов, их антимикробная активность и влияние на персистентные свойства 150
2.4.1.1 Способ получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы домашней 150
2.4.1.2 Биологическая активность антимикробных пептидов из тромбоцитов кур 156
2.4.1.3 Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов кур на персистентные свойства микроорганизмов 161
2.4.1.4 Функциональная активность синтетического производного индоли-цидина 164
2.4.2 Взаимодействие симбионтов в микросимбиоценозе при инфекции 167
2.4.2.1 Модификация факторов персистенции стафилококков и M. pachydermatis при межмикробных взаимодействиях 167
2.4.2.2 Модификация факторов персистенции Candida albicans под влиянием энтерококков 170
2.4.2.3 Штамм бактерий Enterococcus faecium 18, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida 173
2.4.3 Регуляция персистентных свойств микроорганизмов фитосубстанция ми 178
2.4.3.1 Влияние на факторы персистенции микроорганизмов эфирных масел лекарственных растений 179
2.4.3.2 Антиперсистентное действие эфирных масел полыни 184
2.4.3.3 Влияние растительных экстрактов хвойных растений на способность микроорганизмов к инактивации лизоцима и формированию биопленок 192
2.4.3.4 Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов 197
2.4.3.5 Разработка алгоритма отбора лекарственных растений для использования в комплексной терапии эндогенных инфекций 202
Заключение 208
Выводы 225
Рекомендации по использованию научных выводов 227
Список сокращений 228
Библиографический список 230
- Факторные инфекции животных: этиология и патогенез
- Видовой состав микроорганизмов, выделенных от собак с наружными отитами
- Персистентный потенциал бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных с факторными инфекциями
- Разработка алгоритма отбора лекарственных растений для использования в комплексной терапии эндогенных инфекций
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Инфекционная патология эндогенной этиологии в настоящее время является одной из наиболее острых проблем ветеринарной науки и практики. Эндогенные инфекции, вызванные микроорганизмами, постоянно и закономерно переживающими на поверхности тела, в открытых полостях или в органах и тканях своих облигатных хозяев, относятся к факторным инфекционным болезням, эпизоотическим процессам которых не свойственна эстафетная передача возбудителя (Джупина С.И., 2001). На фоне относительного благополучия по управляемым инфекциям основной ущерб животноводству наносят именно факторные инфекционные болезни (Ефанова Л.И. и др., 2012), возбудителями которых становятся потенциально патогенные микроорганизмы (Долгополов В.Н. и др., 2012; Федотов С.В., Капитонов Е.А., 2014; Исакова М.Н. и др., 2017; Портянко А.В. и др., 2018; Безбородова Н.А, Ким Н.А., 2018), обладающие факторами персистенции, обеспечивающими «иммунорезистент-ность» и выживание при контакте с гуморальными и клеточными эффекторами антибактериальной защиты макроорганизма (Бухарин О.В., 1999).
К настоящему времени у микроорганизмов различных таксономических групп, представляющих потенциальную опасность развития эндогенного инфекционного процесса, выявлен широкий спектр факторов персистенции, включающий серорезистентность, антилизоцимный, антикомплементарный, антилак-тоферриновый, антииммуноглобулиновый и ряд других признаков (Ivanov I.B., Gritsenko V.A., 2009). В модельных экспериментах и клинических наблюдениях показана связь этих свойств возбудителей с возникновением и особенностями течения инфекционно-воспалительного процесса (Гриценко В.А. и др., 2012). Однако имеющийся пул данных в основном ограничивается сведениями о возбудителях эндогенных инфекций человека, в то время как изучению факторных инфекционных болезней животных и их возбудителей уделяется недостаточно внимания (Джупина С.И., 2015; Макаров В.В., 2017). Так, остается открытым вопрос о распространенности и выраженности факторов персистенции у возбудителей факторных инфекций животных; до настоящего времени отсутствуют данные комплексной оценки биологических свойств потенциально патогенных микроорганизмов, что затрудняет дифференциацию штаммов – представителей симбиотической микробиоты от вирулентных вариантов микроорганизмов – возбудителей эндогенных инфекций. Неизвестно, как модифицируется персистент-ный потенциал условно-патогенных микроорганизмов в условиях микросим-биоценоза. Между тем, установление условий, способствующих формированию патологического микробиоценоза, на фоне которого возникает факторное заболевание и происходит его хронизация, является первостепенной задачей ветеринарной науки и практики.
Кроме того, особый практический интерес представляет задача по поиску путей управления персистентными свойствами патогенов через их регуляцию факторами различного генеза.
Все вышеизложенное актуализирует постановку цели и задач нашей работы.
Цель – установить биологическую и патогенетическую значимость перси-стентных свойств микроорганизмов при факторных инфекциях животных и разработать подходы к дифференциации штаммов, прогнозированию течения и терапии эндогенных инфекций.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи.
-
Изучить видовой состав микроорганизмов, выделенных из разных биотопов здоровых животных и при инфекционно-воспалительных заболеваниях эндогенной природы, составить видовые регистры возбудителей, ранжированных по их этиологической значимости.
-
Охарактеризовать персистентный потенциал доминантных и ассоциативных микроорганизмов, выделенных из разных биотопов тела здоровых животных и при инфекционно-воспалительной патологии.
-
Разработать способы дифференциации микроорганизмов, отобрать штаммы представителей нормальной микрофлоры и оценить их биологическую активность in vitro.
-
Определить биопрофили приоритетных возбудителей и выявить информативные биомаркеры с разработкой на их основе новых технологий прогнозирования развития инфекционно-воспалительных заболеваний.
-
Изучить влияние доминантных бактерий, природных и синтетических веществ на персистентные свойства ассоциативных микроорганизмов для отбора наиболее эффективно подавляющих персистентный потенциал микроорганизмов.
Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки) по: п. 1. «Природа и происхождение, структура, химический состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий, вирусов и токсигенных грибов. Классификация возбудителей и вызываемых ими инфекционных болезней животных»; 4. «Инфекционный процесс. Природа патогенности, явления, процессы и механизмы взаимодействия микро- и макроорганизмов на всех уровнях (молекулярно-генетическом, клеточном, тканевом, организменном, популяционном) в условиях воздействия экзогенных и эндогенных факторов»; 5. «Методы выделения микроорганизмов и вирусов из патологического материала, средства и методы диагностики инфекционных болезней животных, индикация патогенных микроорганизмов»; п. 9. «Активная специфическая профилактика инфекционных болезней животных, вакцины, вак-цинология, способы вакцинации. Средства и методы лечения и лекарственной профилактики инфекционных болезней животных».
Научная новизна исследований. Выявлена способность микроорганизмов, выделенных от здоровых и больных животных, к инактивации факторов естественной резистентности хозяина и впервые представлена сравнительная оценка диагностической значимости биологических свойств микроорганизмов с характеристикой их биопрофилей.
Предложены новые подходы к дифференциации микроорганизмов на патогенные штаммы и представителей нормальной микрофлоры (патент РФ № 2612141; свидетельство о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2018617605), основанные на оценке персистентного потенциала бактерий.
Получены данные о перспективности использования факторов персистенции бактерий для прогнозирования течения инфекционно-воспалительных заболеваний у животных (свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2017616114, № 2018616909).
Впервые установлена важная патогенетическая роль персистентных характеристик бактерий и грибов в развитии инфекционно-воспалительных заболеваний у животных: они широко распространены среди штаммов, выделенных при изученных нозологиях, при этом выраженность исследуемых признаков выше при хроническом течении заболевания по сравнению с острым.
Получены данные о повышении экспресии персистентных свойств микросимбионтов (бактерии/грибы) в условиях их межмикробных взаимодействий, что можно рассматривать как один из механизмов, способствующих формированию патобиоценоза, на фоне которого развиваются эндогенные инфекции.
Установлено подавление факторов персистенции грибов рода Candida под действием доминантной микрофлоры (Enterococcus sp.) и отобран штамм Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами (патент РФ № 2576008).
Впервые проведено полногеномное секвенирование и аннотация генома штамма Enterococcus faecium ICIS 96, обладающего высокой антагонистической активностью. Отсутствие у культуры генетических детерминант вирулентности делает штамм перспективным для использования в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности.
Впервые предложен способ получения антимикробных пептидов (АМП) из тромбоцитов курицы домашней (патент РФ № 2645070). Показано однозначное снижение персистентных характеристик микроорганизмов под их влиянием, а также под влиянием синтетического производного индолицидина, что является обоснованием для разработки нового перспективного класса антимикробных препаратов, эффективных в отношении патогенных микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина.
Впервые с использованием персистентных свойств микроорганизмов разработан алгоритм выбора лекарственных растений для терапии животных с эндогенными инфекциями (свидетельство о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2018617097).
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о роли факторов персистенции микроорганизмов в инфекционной патологии и являются основой для разработки новых практических решений по дифференциации штаммов и прогнозированию течения эндогенных инфекций.
Практическое значение работы подтверждено разработкой способов: «Способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных» (патент РФ № 2612141); «Способ получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы домашней» (патент РФ № 2645070) и программ для ЭВМ: «Прогнозирование развития хронического наружного отита у собак», «Прогнозирование развития мастита у коров стафилококковой и стрептококковой этиологии», «Отбор лекарственных растений для терапии эндогенных инфекций», «Дифференциация бактерий рода Enterococcus на патогенные штаммы и представителей нормальной микрофлоры по факторам персистенции» (свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ № 2017616114, № 2018616909, № 2018617097, № 2018617605), которые апробированы и внедрены в работу ветеринарных учреждений области.
При изучении факторов персистенции микроорганизмов отобран штамм Staphylococcus aureus, обладающий высокой антилизоцимной активностью, который целесообразно применять для скрининга антибактериальных средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками (патент РФ № 2568058).
Выявлены штаммы Enterococcus faecium, обладающие уникальными свойствами, которые могут быть использованы при создании новых пробиотиков (патент РФ № 2576008, депонирование в GenBank).
Материалы работы использованы в информационно-методическом письме Управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области «Региональный регистр антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях собак» (Оренбург, 2018).
Методология и методы исследования. Методологической основой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по изучению персистентных свойств микроорганизмов. Основу диссертационного исследования составляют системный подход в изучении рассматриваемой проблемы и комплексный анализ.
При проведении исследований и изложении материала были применены общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, микробиологические, молекулярно-генетические, биохимические, математический анализ. Использование перечисленных методов и статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность полученных результатов и выводов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Способность микроорганизмов к инактивации факторов естественной
резистентности макроорганизма является совокупностью маркеров, информа
тивных при дифференциации микроорганизмов на вирулентные штаммы и пред
ставителей нормальной микрофлоры, а также при прогнозировании развития за
болеваний.
2. Потенцирование персистентных свойств ассоциативной микрофлоры, пред
ставленной бактериями и грибами, является одним из механизмов, способствую
щих формированию патобиоценоза, на фоне которого возникает заболевание.
3. Подавление персистентных свойств микроорганизмов – концепция отбора антимикробных средств для терапии больных факторными инфекциями животных.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами.
Представленные данные – составная часть темы открытого плана НИР ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Роль факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов в инфекционном процессе» (№ государственной регистрации АААА-А17-117092740002-9).
Исследования были проведены при поддержке гранта Ур О РА Н на совместные исследования с СО и ДВО РА Н «Регуляция биологических свойств микроорганизмов растительными экстрактами как основа разработки антибактериальных средств» (№ 12-С-4-1022); гранта РФФИ «Новые антимикробные пептиды, продуцируемые тромбоцитами животных и их биологическая активность в отношении различных групп микроорганизмов» (№ 14-04-97067 р_поволжье_а); гранта Оренбургского ГАУ по результатам конкурса научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2013).
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов определяется высоким методическим уровнем исследования, четким определением его цели и задач, адекватным подбором современных методов исследования, их корректным применением, использованием методов статистической обработки, подтверждающих достоверность полученных выводов, а также апробацией основных результатов работы на научных конференциях.
Результаты научных исследований доложены, обсуждены и одобрены на I и III Всероссийской молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011, 2017); III междисциплинарной конференции молодых ученых Ур О РА Н (Оренбург – Бу-зулукский бор, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); I и II Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодых ученых «Эндогенные бактериальные инфекции: микробиологические и иммунологические аспекты» (Оренбург, 2013; 2016); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии «XVII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2014); Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки» (Ульяновск, 2015); VIII Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург, 2015); II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2015); Международном молодежном образовательном форуме «Евразия» (Оренбург, 2016); Международном Евразийском экономическом форуме «Оренбуржье – сердце Евразии» (Оренбург, 2016); III научно-практической школе-конференции «Аллергология и клиническая иммунология (иммунодиагностика, иммунопрофилактика и иммунотерапия)» (Сочи, 2017); XVIII международной научно-практической кон-
ференции аспирантов и молодых ученых «Знания молодых, наука, инновации, практика» (Киров, 2018); Международной научно-практической конференции «Достижения науки – агропромышленному комплексу» (Челябинск, 2018).
Фрагменты работы были представлены на областных конкурсах научно-исследовательских работ и отмечены персональной премией (2014) и стипендией (2012, 2016) правительства Оренбургской области для молодых ученых.
Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ и лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Ур О РА Н (протокол № 20 от 22.06.2018).
Публикации. Основные научные результаты диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из них 16 – в изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ, получено 4 патента РФ на изобретения и 4 свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 276 страницах компьютерной верстки, содержит 24 таблицы и 37 рисунков. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов и рекомендаций по их использованию, списка сокращений, библиографического списка, который включает 411 наименований, в том числе 175 работ иностранных авторов.
Ряд фрагментов работы выполнен совместно с сотрудниками ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Ур О РА Н (д.т.н. Ю.А. Хлопко), ФГАОУ ВО «Тюменский государственный университет» (к.б.н. А.С. Васильчен-ко), ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РА Н (к.х.н. Е.А. Рогожин), АНО «ЦИНТ» Южноуральский медицинский центр (к.б.н. А.С. Акжигитов), ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова» СО РА Н (д.х.н. А.В. Ткачев).
Факторные инфекции животных: этиология и патогенез
Живущие на планете организмы никогда не развивались в условиях бактериальной стерильности, поскольку мир микроорганизмов сформировался существенно раньше. В результате функционирование практически всех органов и систем организма человека и животных неразрывно связано с микроорганизмами (Суворов А.Н., 2015). Симбиотическая (комменсальная) микробиота рассматривается как интегральная часть макроорганизма, его своеобразный «экстракорпоральный орган», выполняющий как регуляторную функцию, так и вносящий заметный вклад в физиологию макроорганизма (Шендеров Б.А., 1998).
Однако, при определнных условиях комменсальная микрофлора может проявлять свой патогенный потенциал либо в местах своего естественного обитания (урогенитальный тракт), либо в других органах при инфицировании внутренней среды макроорганизма, что сопровождается нарушением его гомеостаза с развитием воспалительной реакции локального и/или системного характера (Гриценко В.А., Иванов Ю.Б., 2009). Неспецифические инфекционно-воспалительные заболевания, вызываемые комменсальной аутофлорой, получили название эндогенных бактериальных инфекций (ЭБИ).
Согласно рациональной эпизоотологической классификации С.И. Джупина (2004) ЭБИ (эндогенные бактериальные инфекции) животных относятся к факторным инфекционным болезням, эпизоотическим процессам которых не свойственна эстафетная передача возбудителя инфекции. Основным критерием, по которому болезни относят в эту группу, является постоянное и закономерное переживание их возбудителей на поверхности тела, в открытых полостях или в органах и тканях своих облигатных хозяев. Наиболее распространнными заболеваниями этой группы являются колибактериоз, стрептококкозы, стафилококкозы, пастереллз, сальмонеллз и т.д. Наиболее широкое распространение факторные инфекции получили при переводе животноводства на промышленную основу, особенностями которой являются новые методы содержания, характеризующиеся длительным пребыванием животных в закрытых помещениях, высокой концентрацией их на производственных площадях, воздействием на организм различных техногенных стрессов. Вс это приводит к резкому снижению естественной резистентности и делает организм животных чувствительным к возбудителям эндогенных инфекций. В таких условиях возбудитель (ассоциации возбудителей) выступает (выступают) как заключительный «эффектор» целой системы факторов (Евглевский А.А. и др., 2014).
Анализ заболеваемости животных на крупных животноводческих комплексах Российской Федерации показывает, что на фоне относительного благополучия по классическим инфекциям основной ущерб животноводству наносят именно факторные инфекционные болезни (Волкова С.В., 2007; Брусенцев И.А., Наумов Н.М., 2015; Ленченко Е.М. и др., 2017).
Так, по данным Ю.А. Костыркина с соавт. (2005), на долю факторных респираторных болезней приходится свыше 60 % от всех случаев заболевания телят. Факторные болезни органов пищеварения являются постоянными спутниками но-ворожднных в первые дни их жизни. Удельный вес факторных инфекций, проявляющихся диареей и респираторным синдромом, в общей патологии поросят составляет 52-82 % (Прудников С.И. и др., 2011) с охватом на крупных свиноводческих комплексах до 100 % поголовья (Паршин П.А. и др., 2009).
Помимо диареи и респираторной патологии у молодняка (Ефанова Л.И. и др., 2012), факторные инфекционные болезни характеризуются возникновением гнойно-воспалительных процессов (бурситы), сопровождаются нарушением воспроизводительной функции у животных в результате развития эндометритов, метрит-мастит-агалактии (Шахов А.Г., 2005; Макаров В.В., 2008; Bacha B., Regassa F.G., 2010). Бактериологические исследования биоматериала от павших и вынужденно убитых животных, проведнные Л.И. Ефановой с соавт. (2012), показывают, что основными возбудителями эндогенных инфекций у крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Центрально-Черноземной зоны страны являются энтеропато-генные E. coli и E. faecalis. Авторы отмечают, что часто от павших телят и поросят первых дней жизни энтеропатогенные E. coli и энтерококки выделяли из трубчатых костей и всех паренхиматозных органов, что свидетельствует о преобладании септического течения инфекций у животных в этот период.
В условиях промышленного птицеводства и неблагополучной экологической обстановки у молодняка и взрослой птицы широко распространен дисбакте-риоз, характеризующийся элиминацией лакто- и бифидобактерий при одновременном увеличении численности патогенных и условно-патогенных бактерий, плесневых и дрожжеподобных грибов, что является причиной вспышек моно- и ассоциированных инфекций (Феоктистова Н.В. и др., 2017).
По данным В.Н. Долгополова с соавт. (2012), при проведении мониторинга смешанных кишечных инфекций у птиц в птицеводческих хозяйствах Липецкой и Воронежской областей было выявлено латентное носительство Escherichia coli, Enterococcus faecium, E. faecalis и Proteus vulgaris. Указанные микроорганизмы высевались из внутренних органов (сердце, печень, головной мозг) цыплят-бройлеров различных кроссов и возрастных групп. На основании полученных результатов авторы сделали вывод о том, что у цыплят в период заполнения птичников наблюдается бактериальная персистенция – первичное носительство без клинического проявления.
В.А. Гриценко и Ю.Б. Иванов (2009) характеризуют эндогенные бактериальные инфекции как многоэтапный процесс, выделяя следующие взаимосвязанные стадии развития ЭБИ:
1. Преморбидный этап, во время которого в макроорганизме формируются эндогенные источники возбудителей инфекций. В роли таких резервуаров могут выступать различные биотопы тела животных (кишечник, верхние дыхательные пути и кожа), способные аккумулировать в свом составе не только представителей нормальной микрофлоры, но и потенциально патогенные микроорганизмы.
Наряду со стафилококками (van den Berg S. et al., 2015), стрептококками (Dutkiewicz J. et al., 2018) и энтерококками (Manfredo V. et al., 2018), большое значение в этиологии эндогенного инфицирования придается именно кишечной флоре, особенно грамотрицательным факультативно-аэробным палочкам: кишечной палочке (Черных М.Н., Федотов С.В., 2009; Horii S. et al., 2018; Altan S. et al., 2018), клебсиеллам (Леванова Л.А., Захарова Ю.В., 2016), протею, синегнойной палочке (Hatano K. et al., 1996; Dzvova N. et al., 2018).
2. Этап транслокации, когда потенциальные патогены покидают исходный микробиоценоз и мигрируют во внутреннюю среду макроорганизма, инфицируя его органы и ткани.
Инфицирование внутренних органов за счет транслокации бактерий из кишечника или ротовой полости известно давно и признается большинством клиницистов. По мнению ряда авторов микроорганизмы кишечника составляют пул потенциально патогенных возбудителей, от которых в наибольшей мере зависит возникновение эндогенных инфекций (Tabaqchali S., Booth C., 1985; Sjostedt S., 1989). Эти состояния развиваются в результате контаминации тонкого отдела кишечника преимущественно условно-патогенными бактериями, благодаря высокой проницаемости слизистой которого, происходит транслокация микроорганизмов и поступление токсинов во внутреннюю среду организма.
Поскольку в настоящее время основным механизмом эндогенного инфицирования считается транслокация кишечной микробиоты (Осипов Г.А., 2011), крайне важным остается вопрос регуляции этого процесса (Волков В.И., 2010), что подтверждается результатами многочисленных исследований (Chen D.C. et al., 2009).
Данные, полученные Y. Dnder et al. (2018), показывают, что введение в рацион крыс кверцитрина – флавонойда, обладающего противовоспалительными свойствами, в дозе 1 и 5 мг/кг в сутки значимо (p 0,05) уменьшает транслокацию E. coli, Enterococcus spp., Proteus spp. и Klebsiella pneumoniae из кишечного биотопа в печень, селезнку, мезентериальные лимфоузлы.
В настоящее время появились работы, в которых описана способность про-биотических штаммов бактерий снижать транслокацию потенциально патогенных микроорганизмов из кишечника.
Так, в эксперименте W. Panpetch et al. (2017) удалось установить, что штамм Lactobacillus rhamnosus L34 препятствует развитию транслокации потенциально патогенных бактерий. Авторы предполагают, что выявленный факт связан со способностью пробиотической культуры ослаблять местные и системные воспалительные реакции, что подтверждается экспериментами, демонстрирующими снижение продукции цитокинов энтероцитами in vitro под действием L. rhamnosus L34. Уменьшение проницаемости кишечной слизистой за счт усиления секреции интерлейкина-8 было продемонстрировано после экспозиции монослоя кишечных клеток Caco-2 с L. rhamnosus OLL2838 (Miyauchi E. et al., 2009).
Аналогичные результаты по влиянию на транслокацию микроорганизмов из кишечного биотопа были получены N. Osman et al. (2006) при изучении культур бифидобактерий.
Видовой состав микроорганизмов, выделенных от собак с наружными отитами
В последнее время отмечается тенденция к увеличению количества собак, страдающих отитами. Воспаление слухового прохода может развиться в любом возрасте, для него свойственно длительное, затяжное течение, приводящее к необратимым изменениям, кроме того, отит причиняет существенный вред собаководству (Бурцева Т.В., 2014; Плешакова В.И. и др., 2014). В возникновении заболевания наименее изученной является роль несовершенных дрожжеподобных грибов рода Malassezia. Указанный факт позволяет считать актуальным изучение видового состава возбудителей малассезиозного отита у собак, в том числе с целью разработки этиопатогенетической терапии (Фриго Н.В. и др., 2005).
При изучении этиологии наружного отита у собак был проведен анализ видового разнообразия микроорганизмов, выделенных из наружного слухового прохода больных животных. Оценка удельного веса грибов и бактерий в этиологической структуре отитов собак показала, что микроорганизмы выделялись как в монокультуре, так и в бактериальных, и в грибково-бактериальных ассоциациях. Так, Malassezia spp. были изолированы в монокультуре в 14 % случаев, грибково-бактериальные ассоциации выделялись в 40 % случаев, бактерии выступали в роли этиологического фактора отитов в 28 % случаев. В 18 % случаев роста микроорганизмов обнаружено не было.
Изучение видового разнообразия изолированных грибов рода Malassezia показало доминирование вида M. pachydermatis (87,5 %). Другие виды малассезий выделялись значительно реже: M. furfur – в 8,3 %, M. obtusa – в 4,2 % случаев (в соответствии с рисунком 3).
Далее было проанализировано родовое и видовое разнообразие бактерий, изолированных из наружного слухового прохода собак с отитом.
Показано, что лидерами по частоте выделения из наружного слухового прохода собак с отитами были микроорганизмы рода Staphylococcus (65,2 %). Видовое разнообразие выделенных стафилококков было следующим: S. hyicus (43,5 %), S. xylosus (17,3 %), S. intermedius (2,2 %) и S. gallinarum (2,2 %).
Значимо реже изолировали микроорганизмы рода Corynebacterium (8,6 %). В 6,4 % случаев из наружного слухового прохода собак были выделены культуры Proteus vulgaris.
Бактерии Klebsiella spp. выделяли в 4,4 % случаев. Микроорганизмы этого рода были представлены культурами K. oxytoca (2,2 %) и K. terrigena (2,2 %). Штаммы P. aeruginosa и E. coli были идентифицированы в 4,4 % случаев. Реже (2,2 %) высевали микроорганизмы родов Bacillus, Streptococcus и Enterococcus (в соответствии с рисунком 4).
В монокультуре доминировали микроорганизмы следующих видов: S. hyicus (25,7 %), P. aeruginosa (5,7 %), S. xylosus (2,86 %), Enterococcus sp. (2,86 %).
Бактериальные и бактериально-грибковые ассоциации микроорганизмов, выделенных из наружного слухового прохода собак при отитах, имели следующие особенности (в соответствии с рисунком 5).
В бактериальных ассоциациях преобладали стафилококки: S. xylosus (60 %) и S. hyicus (40 %). S. xylosus преимущественно выделяли с Bacillus sp., Corynebacterium sp., а также с K. terrigena (по 2,86 %). S. hyicus изолировали с бактериями видов E. coli и P. vulgaris (по 2,86 %).
В двухкомпонентных бактериально-грибковых ассоциациях совместно с M. pachydermatis изолировали бактерии следующих видов: P. vulgaris (2,86 %), S. xylosus (8,6 %), S. hyicus (17,1 %), S. intermedius (2,86 %). Сочленами трехком-понентных бактериально-грибковых ассоциаций помимо грибов M. pachydermatis являлись S. xylosus и K. oxytoca (2,86 %); S. hyicus и бактерии рода Corynebacte-rium (2,86 %); S. hyicus и P. vulgaris (2,86 %); S. gallinarum и E. coli (по 2,86 %).
Были обнаружены трехкомпонентные бактериально-грибковые ассоциации, состоящие из M. obtusa и бактерий рода Corynebacterium и S. hyicus (2,86 %), а также M. furfur, Corynebacterium sp. и Streptococcus sp. (2,86 %).
На следующем этапе работы был исследован микробиоценоз слухового прохода собак с клиническими проявлениями острого наружного отита и с обострением хронического наружного отита.
Отмечено, что при хронической форме течения отита грибы рода Malassezia высевались в 1,6 раз чаще, чем при остром процессе: в 76,9±14,90 % и 47,2±12,48 % случаев, соответственно (р 0,05). При анализе видового состава изолированных Malassezia spp. показано, что как при остром, так и при хроническом течении инфекционного процесса доминировал вид M. pachydermatis (87,5 %). При этом отмечено, что при хроническом наружном отите, наряду с указанными культурами дрожжеподобных грибов, в 12,5 % случаев были изолированы штаммы M. obtusa, а при остром течении инфекционного процесса в 12,5 % случаев выделяли изоляты M. furfur (в соответствии с рисунком 6).
Показано, что при хроническом течении наружного отита M. pachydermatis выделялись как в монокультуре (в 10 % случаев), так и в ассоциациях с бактериями, преимущественно стафилококками: со S. intermedius и со S. hyicus в 10 % случаев, со S. xylosus – в 20 %.
Трехкомпонентные бактериально-грибковые ассоциации были представлены М. pachydermatis со S. xylosus и К. oxytoca в 10 % случаев, с микроорганизмами рода Corynebacterium и S. hyicus - в 20 % случаев. М. obtusa высевали в ассоциации с бактериями рода Corynebacterium и S. hyicus.
Бактерии (P. aeruginosa) в 10 % случаев были изолированы в монокультуре и в 10 % случаев в ассоциации (К. terrigena и S. xylosus) (в соответствии с рисунком 7).
Далее было установлено, что при остром наружном отите собак грибы рода Malassezia в монокультуре были изолированы в 17,6 % случаев и в 29,4 % - в ассоциациях с бактериями (в соответствии с рисунком 8).
Двухкомпонентные бактериально-грибковые ассоциации зарегистрированы в 23,5 % случаев и были представлены: М. pachydermatis со S. xylosus (3 %), М. pachydermatis со S. hyicus (14,7 %), М. pachydermatis с P. vulgaris (6 %).
Трехкомпонентные - в 5,9 % случаев и были представлены: М. pachydermatis со S. gallinarum и Е. coli, а также М. furfur с микроорганизмами родов Streptococcus и Corynebacterium.
Персистентный потенциал бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных с факторными инфекциями
Энтерококки, являясь представителями симбиотической микробиоты, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности биотопов (Бондаренко В.М., Суворов А.Н., 2007; Karimaei S. et al., 2016). В то же время, обладая широким набором факторов вирулентности и персистенции (Poulsen L.L. et al., 2012; Бухарин О.В. и др., 2013; Сычева М.В., Карташова О.Л., 2015; Kafil H.S. Mobarez A.M., 2015), микроорганизмы этого рода способны вызывать развитие факторных инфекционно-воспалительных заболеваний животных (Черных О.Ю., 2009; Pomba C. et al., 2010; Кунилова Е.С. и др., 2012; Larsson J. et al., 2014; Wu X. et al., 2016).
В связи с этим нами были выделены энтерококки от здоровых животных и животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями для изучения их пер-систентного потенциала (в соответствии с рисунком 27).
Показано, что 90,0±4,24 % фекальных изолятов и 82,1±7,37 % этиологически значимых культур энтерококков обладали способностью разрушать ИЛ-4. Выраженность антицитокинового признака в отношении ИЛ-4 у бактерий рода Enterococcus, выделенных от здоровых животных, варьировала от 3,6±0,50 % до 48,3±2,90 %. У энтерококков, изолированных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, диапазон экспрессии признака составил от 18,1±3,00 % до 71,1±3,20 %. Средние показатели антицитокиновой активности в отношении ИЛ-4 у кишечных энтерококков (24,0±12,00 %) были значимо ниже, чем у клинических изолятов (42,3±19,02 %) (p 0,05).
Среди клинических изолятов наиболее высоким уровнем антицитокинового признака характеризовались штаммы E. durans – 65,6±5,20 %, E. flavescens – 62,0±9,00 %; среди фекальных культур - Е. faecium - 28,5±4,41% и Е. hirae 27,1±5,02 %. (в соответствии с рисунком 28).
Изучение АЦА Enterococcus spp. в отношении ИЛ-8 показало, что данный признак встречался у 92,0±3,83 % фекальных изолятов и у всех культур энтерококков, выделенных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, за исключением E. hirae (85,2±6,83 %). Средние значения признака составили 38,5±6,05 % и 57,3±9,02 %, соответственно (p 0,05).
Уровень выраженности антицитокинового признака в отношении ИЛ-8 характеризовался межвидовой вариабельностью (в соответствии с рисунком 29).
Средние значения АЦА кишечных штаммов Е. hirae составили 38,7±6,00 %, изолятов E. faecium - 37,2±3,40 %, культур Е. durans - 40,8±6,20 %, Е. faecalis -31,6±4,21 %, E. flavescens - 38,8±6,60 % и Е. casseliflavus - 22,8±9,01 %.
По сравнению с фекальными культурами видов Е. durans и Е. faecalis достоверно большим уровнем АЦА в отношении ИЛ-8 обладали штаммы Е. durans (76,2±7,20 %) (р 0,01) и E. faecalis (66,3±8,00 %) (р 0,001), выделенные из клинического материала.
Экспрессия антицитокиновой активности клинических изолятов Е. flaves-cens составила в среднем 32,9±4,20 %, Е. casseliflavus - 30,5±7,02 %. E. faecium -44,3±5,40 %.
Клинический штамм E. hirae не обладал антицитокиновой активностью в отношении изученных интерлейкинов.
Изучение распространнности антигемоглобиновой активности среди энтерококков, выделенных от животных, показало, что 38,0±6,86 % фекальных изоля-тов и 88,9±6,04 % клинических штаммов обладали данным свойством (р 0,05).
Средние значения АнтиHbA у большинства фекальных культур были ниже, чем у клинических изолятов и составили для E. hirae 14,0±6,38 против 46,7±6,21 г/л (р 0,01); для E. durans – 11,2±0,85 против 22,1±9,82 г/л; для Е. flavescens – 19,4±5,81 против 39,9±29,3 г/л; для Е. casseliflavus – 44,4±1,38 против 54,1±41,5 г/л (в соответствии с рисунком 30).
Выраженность антигемоглобинового признака у клинических изолятов и фекальных культур E. faecium, E. durans, E. faecalis, E. flavescens и E. casseliflavus достоверно не отличалась.
На следующем этапе исследований изучена антикарнозиновая активность клинических и фекальных штаммов энтерококков. Показано, что все энтерококки, выделенные от здоровых животных и животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, характеризовались наличием антикарнозинового признака.
Установлено, что выраженность АКрА у энтерококков, выделенных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, была значимо выше, чем у культур Enterococcus spp., изолированных из кишечника здоровых животных (p 0,05) (в соответствии с рисунком 31).
Наиболее высокими значениями антикарнозинового признака обладали кишечные культуры E. durans и Е. faecalis – 1,8±0,15 и 1,7±0,23 мг/мл, соответственно. Выраженность АКрА у фекальных изолятов других видов была следующей: у E. faecium, E. hirae – 1,5±0,31 и 1,5±0,10 мг/мл, соответственно; у Е. flavescens – 1,4±0,28 мг/мл. Минимальными показателями антикарнозинового признака характеризовались культуры E. casseliflavus (1,0±0,45 мг/мл).
У клинических изолятов энтерококков также обнаружена межвидовая вариабельность признака. Наиболее высокие значения АКрА (2,7±0,18 мг/мл) были отмечены у культур E. faecium; низкие (2,3±0,001 мг/мл) – у E. hirae.
Средние значения антикарнозинового признака у штаммов E. flavescens и E. faecalis составили 2,5±0,35 и 2,5±0,25 мг/мл, соответственно; E. durans и E. casseliflavus – 2,4±0,51 и 2,4±0,12 мг/мл, соответственно.
В среднем, культуры энтерококков, выделенные из клинического материала, значимо превосходили фекальных изолятов по уровню экспрессии изученного секретируемого фактора персистенции (2,45±0,21 и 1,85±0,06 мг/мл (p 0,01), соответственно).
Широкая распространнность устойчивости к антимикробным препаратам среди Enterococcus spp. (Heuer O.E. et al., 2006; Бухарин О.В., Валышев А.В., 2012; Пошвина Д.В., Сычева М.В., 2014) продиктовала необходимость количественной оценки антибиотикорезистентности фекальных и клинических штаммов энтерококков. Маркер резистентности фекальных штаммов энтерококков был меньше, чем у клинических изолятов, составив 0,28±0,031 и 0,36±0,101, соответственно.
Полученные данные по распространнности и выраженности факторов пер-систенции энтерококков, выделенных от здоровых животных и животных с ин-фекционно-воспалительными заболеваниями, были положены в основу разработанного нами способа дифференциации культур Enterococcus spp. кишечной микрофлоры животных и алгоритма для дифференциации энтерококков.
Разработка алгоритма отбора лекарственных растений для использования в комплексной терапии эндогенных инфекций
В настоящее время известным является бактерицидное, бактериостатиче-ское, а также антиперсистентное действие лекарственных растений (Карташова О.Л. и др., 2009; Водолазова С.В. и др., 2011). Поэтому на следующем этапе исследования мы предприняли попытку с помощью современных методов математического анализа разработать алгоритм, который бы оптимизировал отбор лекарственных растений, пригодных для терапии эндогенных инфекций животных.
Показано, что антилизоцимная активность и способность микроорганизмов формировать биоплнки являются системообразующими факторами и играют роль в возникновении, а также осложнении эндогенных бактериальных инфекций (Бухарин О.В., 2006). Поэтому мы рассчитали алгоритм отбора лекарственных растений, включающий в качестве информативных признаков степень подавления ими факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов (АЛА и БПО), а также наличие или отсутствие потенциально патогенных микроорганизмов в микробиоценозе.
Для решения поставленной задачи были использованы данные сравнительного анализа степени подавления факторов персистенции (АЛА и БПО) микроорганизмов (K. pneumoniae, E. coli. C. albicans, S. aureus, B. subtilis) лекарственными растениями (таблица 22).
Лекарственные растения, использованные для разработки алгоритма, характеризуются наличием антимикробной (Milos M., Makota D., 2012), антиперси-стентной (Уткина Т.М. и др., 2012), антиоксидантной (Мишарина Т.А. и др., 2009) и противовоспалительной (Ефремов В.А., Ефремов А.А., 2010) активностями.
Для иллюстрации расчтов приводим следующие примеры.
Пример 1. Из испражнений кота с диареей были выделены K. pneumoniae, S. aureus и B. subtilis, которые обладали АЛА.
С целью подбора лекарственного растения для использования в комплексной терапии заболевания было изучено влияние ряда лекарственных растений на антилизоцимную активность выделенных микроорганизмов. Применн разработанный алгоритм и лекарственные растения ранжированы по сумме индексов (таблица 23).
Отобраны три наиболее эффективных лекарственных растения: циперус, китагавия байкальская, володушка.
Пример 2. Из мочи кота с мочекаменной болезнью выделены E. coli, C. albicans и S. aureus, характеризующиеся наличием АЛА и БПО.
С целью подбора лекарственного растения для использования в комплексной терапии заболевания было изучено влияние ряда лекарственных растений на антилизоцимную активность и биоплнкообразование выделенных микроорганизмов. Применен разработанный алгоритм, результаты которого представлены в таблице 24, и лекарственные растения ранжированы по сумме индексов.
Отобраны три наиболее эффективных лекарственных растения: котовник, мелколепестник канадский, володушка.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан алгоритм, позволяющий проводить в 87 % случаев эффективный отбор лекарственных растений для использования в комплексной терапии эндогенных инфекций.
На основе рассчитанного алгоритма была разработана программа ЭВМ «Отбор лекарственных растений для терапии эндогенных инфекций человека и животных» (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2018617097).