Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 24
1.1 Проблема бактериальных болезней в птицеводстве 24
1.2 Зоопатогенная и эпидемически опасная микрофлора, выделяемая от птиц 29
1.3 Проблема сальмонеллеза в птицеводстве, эпидемиологическая опасность продукции птицепереработки 48
1.4 Анаэробная энтеротоксемия птиц 61
1.4.1. Эпизоотология анаэробной энтеротоксемии птиц 61
1.4.2 Характеристика и токсигенность возбудителя анаэробной энтеротоксемии птиц 69
1.4.3 Клинические признаки и патологоанатомическая картина анаэробной энтеротоксемии птиц 70
1.4.4 Диагностика анаэробной энтеротоксемии птиц 72
1.4.5 Профилактика и меры борьбы с анаэробной энтеротоксемией птиц 75
1.4.5.1 Неспецифическая профилактика анаэробной энтеротоксемии птиц 75
1.4.5.2 Специфическая профилактика анаэробной энтеротоксемии птиц 86
1.5 Контроль бактериальных болезней в птицеводстве 89
1.5.1 Неспецифическая профилактика бактериальных болезней птиц 92
1.5.1.1 Препараты на основе органических кислот 105
1.5.2 Специфическая профилактика бактериальных болезней птиц 109
1.6 Современные методы диагностики болезней птиц бактериальной этиологии 118
1.7 Заключение по обзору литературы 123
2. Собственные исследования 125
2.1. Материалы и методы исследований 125
2.1.1 Методики культивирования и идентификации патогенных микроорганизмов, выделяемых от птиц 127
2.1.2 Условия проведения экспериментальных исследований на птице 136
2.1.3 Определение вирулентных свойств культур микроорганизмов, условия постановки биопробы при определении иммуногенной активности вакцин 138
2.1.4 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 140
2.1.5 Генотипирование методом ДРИМ 141
2.2. Результаты исследований 142
2.2.1 Биоразнообразие патогенной микрофлоры, выделяемой от сельскохозяйственной птицы 142
2.2.1.1 Патогенная микрофлора, выделяемая от птиц разных видов в хозяйствах различного технологического направления 142
2.2.1.2 Патогенная микрофлора, выделяемая при респираторном синдроме птиц 154
2.2.1.3 Патогенная микрофлора, выделяемая на птицефабриках по производству яйца 157
2.2.1.4 Патогенная микрофлора, выделяемая в птицехозяйствах по производству мяса бройлеров 159
2.2.1.5 Патогенная микрофлора, выделяемая в индейководческих хозяйствах 163
2.2.1.6 Патогенная микрофлора, выделяемая от перепелов 165
2.2.1.7 Патогенная микрофлора, выделяемая от водоплавающей птицы (гусей и уток) 168
2.2.1.8 Удельный вес сальмонелл и клостридий в спектре микрофлоры, выделяемой от птиц, контроль бактериальных болезней в птицехозяйствах 170
2.2.1.9 Изучение чувствительности сальмонелл к антибактериальным препаратам разных групп 174
2.2.2 Усовершенствование и модификация методики выделения клостридий. Подбор штамма для создания препарата специфической профилактики – вакцины – против анаэробной энтеротоксемии птиц 176
2.2.2.1 Освоение методики выделения Clostridium perfringens согласно ГОСТ 26503-85 176
2.2.2.2 Метод двойной индикации с промежуточным накоплением 179
2.2.2.3 Изучение культуральных, тинкториальных, морфологических, биохимических, токсигенных и биологических свойств Clostridium perfringens, выделенных от птиц 185
2.2.2.4 Разработка методики типирования клостридий на модели развивающихся куриных эмбрионов 189
2.2.2.5 Изучение вирулентных свойств клостридий, выделенных от птиц 193
2.2.2.6 Особенности эпизоотологии анаэробной энтеротоксемии при смешанном течении с другими бактериальными болезнями 196
2.2.2.7 Изучение чувствительности клостридий к антибактериальным препаратам разных групп 199
2.2.3 Разработка унифицированной методики генотипирования патогенных микроорганизмов, циркулирующих у птиц, методом двойного расщепления и избирательного мечения – ДРИМ 200
2.2.3.1 Подбор унифицированной комбинации ферментов рестрикции in-silico для одновременного генотипирования разных видов патогенов 200
2.2.3.2 Генотипирование методом двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) микроорганизмов родов Salmonella и Proteus, выделенных от птиц 205
2.2.3.3 Генотипирование методом ДРИМ микроорганизмов вида Escherichia coli, выделенных от кур яйценоских кроссов 209
2.2.3.4 Генотипирование методом ДРИМ микроорганизмов вида Escherichia coli, выделенных от бройлеров 212
2.2.3.5 Генотипирование методом ДРИМ микроорганизмов вида Escherichia coli, выделенных от индеек 213
2.2.3.6 Генотипирование методом ДРИМ микроорганизмов вида Escherichia coli, выделенных от перепелов и гусей 215
2.2.3.7 Разработка молекулярно-генетического подхода для генотипирования методом ДРИМ микроорганизмов вида Clostridium perfringence, и испытание метода на группе полевых изолятов, выделенных от разных видов птиц 216
2.2.4 Формирование системы профилактики болезней птиц бактериальной этиологии с использованием препаратов на основе органических кислот 220
2.2.4.1 Изучение эффективности кормовых добавок КЛИМ, КЛИМ Гидро, КЛИМ Термо в отношении клостридий в экспериментальных условиях 220
2.2.4.2 Изучение антибактериальной эффективности подкислителя Сальмоцил FL в отношении основных возбудителей бактериальных болезней птиц 223
2.2.4.3 Изучение антибактериальной эффективности подкислителя Сальмоцил F в отношении основных возбудителей бактериальных болезней птиц 234
2.2.5 Создание и испытание препарата специфической профилактики анаэробной энтеротоксемии птиц – опытного образца вакцины инактивированной сорбированной 241
2.2.5.1 Разработка технологии изготовления вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтеротоксемии птиц 241
2.2.5.2 Контроль стерильности вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтеротоксемии птиц 245
2.2.5.3 Контроль безвредности вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтеротоксемии птиц 245
2.2.5.4 Отработка моделей заражения цыплят культурами Clostridium perfringens для контроля эффективности вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтероксемии птиц 246
2.2.5.5 Контроль иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтеротоксемии на яйценоской птице 246
2.2.5.6 Контроль иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против анаэробной энтеротоксемии птиц на цыплятах-бройлерах 253
2.2.5.7 Разработка проекта нормативной документации на вакцину инактивированную сорбированную против анаэробной энтеротоксемии птиц 256
2.2.6 Создание и испытание препарата специфической профилактики сальмонеллеза птиц – вакцины инактивированной эмульгированной 257
2.2.6.1 Подбор штаммов S.Enteritidis и S.Typhimurium, выбор и отработка метода инактивации их биомассы 257
2.2.6.2 Оценка антигенных свойств S.Enteritidis и S.Typhimurium 259
2.2.6.3 Отработка методов контроля полноты инактивации S.Enteritidis и S.Typhimurium 262
2.2.6.4 Разработка компонентного состава и лекарственной формы вакцины инактивированной эмульгированной против сальмонеллеза птиц 263
2.2.6.5 Изготовление образцов вакцины, отличающихся по компонентному составу 266
2.2.6.6 Изучение иммуногенной активности образцов инактивированных вакцин против сальмонеллеза птиц 267
2.2.6.7 Изучение иммуногенной активности вакцины инактивированной эмульгированной против сальмонеллеза птиц в сравнении с референс препаратами (вакцинами зарубежного производства) 272
2.2.6.8 Разработка технологического процесса изготовления вакцины инактивированной эмульгированной против сальмонеллеза птиц 276
2.2.6.9 Разработка нормативной документации на вакцину инактивированную эмульгированную против сальмонеллеза птиц «Сальмокрон» 281
2.2.6.10 Технико-экономические исследования эффективности внедрения разработки вакцины против сальмонеллеза птиц 284
Обсуждение результатов исследований 286
Заключение 314
Практические рекомендации 316
Перспективы дальнейшей разработки темы 318
Список сокращений 319
Список литературы 321
Приложение 392
- Проблема бактериальных болезней в птицеводстве
- Современные методы диагностики болезней птиц бактериальной этиологии
- Подбор унифицированной комбинации ферментов рестрикции in-silico для одновременного генотипирования разных видов патогенов
- Разработка технологического процесса изготовления вакцины инактивированной эмульгированной против сальмонеллеза птиц
Проблема бактериальных болезней в птицеводстве
Динамичное развитие человеческой популяции (прирост – 219 тыс. в день, или 78 млн. в год) ставит непростые вопросы по важнейшей проблеме – обеспечению населения мира продуктами питания, в т.ч. животного происхождения. Наиболее динамичный прирост животного белка обеспечивает птицеводство, благодаря росту поголовья птицы, более высокому выходу продукции с единицы площади, лучшей конверсии корма, быстрой окупаемости вложенных инвестиций. Биологическая способность птицы конверсировать питательные вещества корма в продукцию значительно выше, чем у других видов животных. Потребность в энергии корма на производство 1 т говядины в 2,3 раза больше, чем на производство 1 т мяса бройлеров, и в 2,1 раза выше, чем на производство 1 т яичной массы. Важная роль птицеводства в решении планетарной проблемы – обеспечение населения мира полноценными продуктами питания животного происхождения, неоспорима (Фисинин В.И., 2016, 2019).
В настоящее время российское птицеводство является лидером на рынке животноводческой продукции. В 2019 г. отечественное производство яиц составило 44,9 млрд. штук, что позволяет России сохранить 6-е место в мире по этому показателю; объем производства мяса птицы достиг 5,020 млн т. – 5-е место в мировом рейтинге. В отечественном производстве всех видов мяса доля сельскохозяйственной птицы – 46,4%. Производство мяса птицы на душу населения возросло до 34,2 кг (Бобылева Г.А., 2017; Бобылева Г.А., Гущин В.В., 2020).
Отличием и преимуществом птицеводства является разнообразие выращиваемой птицы, что дает возможность вырабатывать широкий ассортимент продукции. В России интенсивно развиваются такие направления мясного птицеводства, как индейководство, утководство и гусеводство (Бобылева Г.А., 2017).
По данным Машкиной Е.И. (2019) в структуре производства мяса птицы более 93% занимает мясо курицы, а на остальные 7% приходится мясо гусей, уток, индеек. Индейководство – перспективное направление, обеспечивающее прирост объемов производства мяса птицы, расширение его ассортимента. Индеек широко разводят промышленным способом в ряде стран мира, это вторая после производства бройлеров отрасль мясного птицеводства. Лидером в индейководстве являются США. В сравнении с другими видами домашней птицы, индейки имеют самый высокий выход съедобных частей – более 70%. Их мясо отличается высоким содержанием белка и небольшим содержанием жира, что делает мясо индеек ценным диетическим продуктом. Индейки предназначены для глубокой переработки мяса и изготовления всевозможных мясных продуктов (Авраменко И.М., 2004; Фисинин В.И., 2009; Канивец В.А. с соавт., 2010, 2011).
Особым спросом пользуется продукция перепеловодческой отрасли, что вызвано высокими вкусовыми качествами яиц и мяса, быстрой воспроизводимостью продукции и окупаемостью в короткий срок. Скороспелость перепелки в два раза выше, чем у пекинской утки, и в три – чем у кроликов. Полный цикл, от закладки яиц в инкубатор до первого яйца от молодой перепелки, составляет всего 52–66 дней. Перепелиное мясо и яйцо являются диетическими продуктами питания. Около 10% столовых яиц в мире получают от перепелов, а их мясо составляет около 0,2% мирового производства мяса птицы. Китай, Испания, Франция, Италия, Бразилия, США и Япония являются мировыми лидерами в области перепеловодства (Голубов И.И., Красноярцев Г.В., 2012; Харчук Ю., 2014; Lukanov H., 2019). Невосприимчивость перепелов ко многим болезням, которым подвержены другие виды птиц, ряд авторов связывает с одной особенностью – температура их тела на 2С выше, чем у других видов сельскохозяйственной птицы (Ковальчук С.Н., 2010).
Важнейшей задачей птицеводства является увеличение объемов производства, повышение качества и снижение себестоимости яиц и мяса птицы. В настоящее время используются высокопродуктивные кроссы, генетический потенциал которых проявляется лишь при оптимальных условиях содержания и кормления, что выдвигает высокие требования к качеству кормов, обеспечению птицы биологически активными веществами, микроэлементами, позволяющими интенсифицировать обменные процессы в ее организме (Андрианова Е.Н. с соавт., 2017).
Генетический потенциал, которым располагает яичное птицеводство, позволяет получать до 500 яиц от несушки за 100 недель жизни. В мясном птицеводстве сократились сроки выращивания бройлеров до 35–37 дней, средний потенциал роста вырос до 2,4–2,5 кг живой массы (среднесуточный прирост до 65 г и выше) при затратах корма на единицу прироста 1,45–1,60 кг/кг. Масса тушек бройлеров отдельных кроссов достигает 2,8–2,9 кг и более (Околелова Т.М. с со-авт., 2018; Пилюгин Д.Н., 2019; Серегин И.Г. с соавт., 2019).
Высокие уровни производства в птицеводстве, достигнутый прогресс в вопросах сохранности и продуктивности птицепоголовья во многом обусловлен посредством улучшения всех этапов технологического процесса и строгим выполнением «Ветеринарных правил содержания птиц на птицеводческих предприятиях закрытого типа (птицефабриках)» (2006) (Лаптев Г.Ю. с соавт., 2020).
Дальнейшее повышение рентабельности отрасли связано с качественной организацией ветеринарной работы и задачей сделать птицеводство наукоемким. Картина инфекционной патологии птиц кардинально изменилась по сравнению с начальным этапом промышленного птицеводства. В последние годы значительно возросло общее число инфекционных болезней, появились новые нозологические формы и варианты известных болезней вследствие генетической трансформации микроорганизмов как в сторону повышения, так и снижения вирулентности (Борисенкова А.Н., 2007; Дмитриева М.Е., Щепеткина С.В., 2014; Альпейсов Ш.А., Асанов Н.Г., 2015). Безбородова Н.А., Ким Н.А. (2018) также подтверждают, что в последние десятилетия наблюдается непрерывное изменение как клинической картины инфекционных заболеваний, так и особенностей их патогенеза. Например, известные достаточно опасные возбудители могут вызывать стертые формы болезней или наоборот: условно-патогенные или считавшиеся непатогенными микроорганизмы становятся причиной тяжелых форм.
Важнейшим фактором эффективности работы птицеводческих хозяйств, гарантом качества и безопасности производимой продукции является обеспечение эпизоотического благополучия птицы. Большое внимание должно быть уделено контролю сальмонеллезной инфекции опасной как для птицы, так и для человека (Бобылева Г.А., Гущин В.В., 2020). В современных условиях ведения животноводства и осуществления международной торговли животными и животноводческой продукцией определяющей задачей является обеспечение ветеринарного благополучия животноводства и птицеводства, производство полноценных и безопасных в санитарном отношении продуктов и защита населения от болезней, общих для человека и животных (Сб. сан. и вет. правил, 1996; Шеин С.А., 2013). Для обеспечения населения такой продукцией и увеличения спроса необходимо соответствие ее качества запросам потребителей. Конкурентоспособность и рентабельность птицеводства можно повысить за счет выпуска продуктов экологически чистых, безопасных для человека (Садовникова Н., 2016).
Животных и людей постоянно окружает персистирующая патогенная и условно-патогенная микрофлора. Нарушение принципов рационального содержания животных и птиц: скученность посадки, нарушение норм кормления, нерациональная схема вакцинации, профилактические обработки антимикробными препаратами приводят к снижению резистентности макроорганизма, что вызывает усиленное размножение патогенной и условно-патогенной микрофлоры и ведет к развитию инфекционных болезней (Щепеткина С.В., Ришко О.А., 2017).
По данным Канифовой Р.Р. (2003) в условиях промышленного производства выращивание сельскохозяйственной птицы сопряжено с ухудшением зооги-гиенических параметров содержания, с увеличением количества и разнообразия микрофлоры в воздухе, с многократным пассированием и циркуляцией микроорганизмов. Это приводит к увеличению вероятности образования патогенной микрофлоры, представляющей потенциальную опасность для возникновения болезней.
Фисинин В.И. с соавт. (2018) отмечают, что функционирование животноводческих и птицеводческих комплексов сопряжено с угрозой для окружающей среды, поскольку в атмосферу ежедневно выбрасываются вредные газы, пыль и биоаэрозоли с высоким содержанием патогенных бактерий, вирусов, спор грибов, эндотоксинов, что представляет потенциальный риск для здоровья животных, птицы, сотрудников птицефабрик, а также населения близлежащих районов. Высокая плотность размещения животных создает условия для вспышек массовых инфекций, в том числе зоонозов, с быстрым распространением на все поголовье.
Современные методы диагностики болезней птиц бактериальной этиологии
Одним из базовых звеньев в обеспечении биобезопасности птицехозяйств является правильно организованная работа по диагностике инфекционных болезней птиц. При этом весьма важно, чтобы диагностические исследования проводились не по отдельным признакам той или иной вдруг появившейся болезни, а целостно, по программе комплексного диагностического мониторинга. Следует обязательно учитывать эпизоотологические особенности хозяйства, включая природно-климатическую зональность расположения, «пестроту» межхозяйственных и внутрихозяйственных связей, генетические особенности используемых кроссов и линий кур, в том числе их возможную предрасположенность и повышенную чувствительность к возбудителям инфекционных болезней птиц, внесенные изменения в имеющуюся программу лечебно-профилактических обработок птицепоголовья. Исследования, проводимые по программе диагностического мониторинга, весьма эффективны и важны, поскольку способствуют постановке оперативного и достоверного диагноза в отношении различных заразных болезней птиц, позволяют контролировать эпизоотическую обстановку и качество биозащиты не только отдельных птицехозяйств, но и целых регионов (Хохлачев О.Ф., 2014).
В системе контроля бактериальных болезней своевременная и качественная диагностика имеет приоритетное значение. Развитие молекулярной биологии, генной инженерии позволило предложить для диагностики бактериальных болезней птиц ряд высокочувствительных методов.
Важнейшим звеном в системе профилактических мероприятий по предупреждению заражения людей через потребляемое мясо, яйца и продукты их переработки, а также распространения инфекционных болезней среди животных является бактериологическое исследование, которое позволяет гарантировать санитарное благополучие продовольственного сырья, вырабатываемой из него продукции, и выявить очаг инфекции (Артемьева С.А. с соавт., 2002).
Доказано, что лишь 1–5% микробов кишечника могут расти на питательных средах. Поэтому зарубежом основным инструментом для исследования микробных сообществ, в том числе микробиома ЖКТ кур, стали молекулярно-генетические методы. Наибольшие успехи в познании природного разнообразия микробов достигнуты с помощью метагеномных методов, основанных на секве-нировании участков генов 16S рРНК, которые должны быть у всех бактерий в сообществе. Одним из таких методов является T-RFLP-анализ – наиболее популярный метагеномный метод первого поколения. В 2012 г. сотрудники молекулярно-генетической лаборатории компании «БИОТРОФ» впервые применили данный метод для исследования бактерий кишечника кур. Это позволило сделать ряд научных открытий мирового уровня. Например, стало известно, что многочисленные вакцинации в птицеводстве приводят к появлению так называемой «секундарной» микрофлоры, которая представляет значительную проблему для здоровья птицы. Показано, что микроорганизмы, отвечающие за адаптацию организма птицы к внешней среде, а также патогенные формы способны колонизировать ЖКТ птиц на стадии эмбрионального развития внутри яйца. Например, в ЖКТ эмбрионов выявляли бактерии Staphylococcus spp., Pseudomonas spp. и E.coli, способные вызывать омфалит. Разработанные нормы содержания микроорганизмов эффективно используются при оценке состояния микробиома ЖКТ кур с целью коррекции дисбиотических нарушений и правильного выбора терапии на ведущих птицефабриках (Лаптев Г.Ю. с соавт., 2018).
Быстрая идентификация патогенных бактериальных штаммов приобретает в настоящее время особую актуальность (Тапальский Д.В. с соавт., 2005; Жеб-рун А.Б. с соавт., 2009). Это связано c циркуляцией возбудителей во внешней среде и периодическими эндемическими вспышками болезней (Добрина М.Н., 2011). В птицеводстве инфекционные болезни, прежде всего сальмонеллез, несут особую угрозу, так как на птицефабриках птица находится в условиях, благоприятствующих передаче микроорганизмов между особями (скученность содержания, запыленность помещений и т.д.). Использование современных методов генотипирования позволяет ответить на вопросы эпизоотологического плана, проследить пути передачи и выявить источники инфекции (Тапальский Д.В. с соавт., 2005; Van Belkum A. et al., 2007). В случае если два изолята, выделенные из разных мест, будут иметь идентичный генотип, можно с высокой степенью уверенности говорить об эпизоотическом контакте. Эти сведения необходимы для предотвращения новых вспышек болезней. Выявление путей передачи возбудителя и определение источников инфекции позволят более эффективно планировать ветеринарно-профилактические мероприятия, направленные против распространения патогена во внешней среде. Сравнение изолятов дает возможность отличить эндемические случаи, часто имеющие эндогенную природу, от эпизоотических вспышек, при которых происходит перезаражение кур друг от друга одним и тем же штаммом. Генотипирование используется также для определения эффективности вакцинопрофилактики при использовании живых вакцин (сравниваются генотипы выделенных изолятов бактерий у птицы с клиническими признаками с генотипом вакцинного штамма).
Сколотнева Е.С. с соавт. (2014) считают, что типирование бактериальных линий и идентификация микроорганизмов чрезвычайно важно для диагностики, лечения, исследования популяционной динамики, прогноза распространения бактериальных инфекций. Молекулярные подходы к типированию бактериальных линий за последние два десятилетия потеснили традиционные методы, основанные на анализе фенотипа, биохимических и культуральных свойствах микроорганизмов.
Rumore J.L. et al. (2016); Lartigue M.-F. (2013) также подтверждают, что в последние годы молекулярно-генетические способы в значительной мере вытеснили традиционные подходы, основанные на биохимических и культуральных свойствах микроорганизмов. Волкова Р.А. с соавт. (2016) также сообщают, что успехи генотипирования бактериальных штаммов позволяют исследовать взаимосвязь между генотипом и фенотипом путем филогенетического анализа генетических дистанций между штаммами в нескольких поколениях, что важно для таких значимых характеристик как вирулентность, устойчивость к антибиотикам и другие.
Генотипирование микроорганизмов проводится и с целью выявить свойства изолята, которые бы отличали его от других изолятов того же вида. Такая работа проводится при выявлении путей распространения инфекции и паспортизации коммерческих штаммов, доказывая их идентичность депонированным патентованным штаммам. Генотипирование позволяет присвоить молекулярно-генетический «штрих-код» каждому штамму, что важно при их использовании на практике (Ботина С.Г., 2009; Жебрун А.Б. с соавт., 2011), при решении спорных вопросов и при хранении коллекций штаммов (в том числе вакцинных) в лабораторных условиях. Также есть вероятность того, что определенный фрагмент ДНК может быть сцеплен с важной биологической или хозяйственно-полезной особенностью штамма, что позволит использовать его в качестве маркера данного свойства при изучении других линий потенциально полезных штаммов.
В настоящее время существует большое число методов генотипирования микроорганизмов, позволяющих определить генетические варианты (штаммы), каждый из которых имеет преимущества, недостатки и ограничения (Lukinmaa S. et al., 2004; Van Belkum A. et al., 2007; Бондарева О.С. с соавт., 2014; Пикина А.П. с соавт., 2016; Терлецкий В.П. с соавт., 2016). Некоторые отличаются высокой разрешающей способностью (секвенирование) и, одновременно, дороговизной. Другие дают низкое разрешение и могут использоваться лишь для предварительного анализа эпизоотической ситуации. Методы идентификации бактериальных штаммов с использованием секвенирования специфических участков ДНК, такие как мультилокусное типирование (MLST) зачастую не дают достаточно высокого разрешения, так как основано на секвенировании нескольких консервативных генов «домашнего хозяйства» (Fakhr M.K. et al., 2005). До сих пор секвенирование остается процедурой, требующей дорогостоящего оборудования и материалов (Schrch A.C. et al., 2018).
Многие исследователи (Walters S.P. et al., 2013) отдают предпочтение методу генотипирования, основанному на разделении фрагментов ДНК патогена в пульс-гель электрофорезе (ПГЭ). Метод ПГЭ обладает высокой дискриминационной способностью, но чувствителен к наличию эндогенных нуклеаз, ограничивающих получение четкого распределения фрагментов ДНК в геле, является трудоемким и длительным в выполнении всех этапов, требует специализированного оборудования (Mitani et al., 2005; Шпилевая М.В. с соавт., 2015). В последние годы стали использовать высокотехнологичные подходы к генотипирова-нию, использующие рамановскую (Wang K. et al., 2018) и масс-спектроскопию (Lartigue M.-F., 2013; Останкова Ю.И. с соавт., 2017).
Подбор унифицированной комбинации ферментов рестрикции in-silico для одновременного генотипирования разных видов патогенов
Результаты данного этапа исследований опубликованы в статьях «Геноти-пирование как метод в превентивной ветеринарии» [351], «Генотипирование микроорганизмов - инструмент контроля эпизоотической ситуации, путей распространения и источников возбудителя инфекции» [352], «Двойное расщепление и избирательное мечение фрагментов ДНК (ДРИМ) как метод быстрой идентификации штаммов патогенных микроорганизмов, актуальных в промышленном птицеводстве» [353], «Молекулярно-генетической анализ микроорганизмов как инструмент в системе профилактики инфекционных заболеваний животных» [354], «Универсальный метод генотипирования патогенных микроорганизмов птиц» [356], «Экспресс-метод генотипирования бактериальных штаммов» [357].
Существует множество методов генотипирования микроорганизмов. Их многообразие свидетельствует об ограниченности в использовании каждого из них. Целью нашей работы стала разработка эффективного и быстрого способа идентификации штаммов патогенных микроорганизмов, выделенных из различных органов домашней птицы, с целью выявления путей распространения патогена в условиях птицефабрик - генотипирование полевых бактериальных изоля-тов методом двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ).
Возможные пути использования генотипирования методом ДРИМ:
- генетическая идентификация/паспортизация штаммов различных видов микроорганизмов, используемых в практике и научной деятельности
- мониторинг способов распространения патогенов бактериальной природы (пути передачи, источники патогена)
- возможно выявление маркерных фрагментов ДНК, сцепленных с фенотипическими признаками микроорганизма
На сегодня самым точным методом генотипирования является метод ДРИМ, который впервые был разработан для клинических изолятов патогенных микроорганизмов - P. aeruginosa, St aureus и Salmonella spp. Метод генотипирования ДРИМ основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндонуклеазами и избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК с последующей их визуализацией. Для каждого вида микроорганизма подбирается пара эндонуклеаз, дающих оптимальное число и распределение фрагментов ДНК, и способных расщеплять ДНК в одном буфере (двойное расщепление) для количественного учета. Результатом генотипирования методом ДРИМ является группа фрагментов ДНК в виде полос на фильтре, распределение которых специфично для каждого штамма (рисунок 31).
Методология основана на использовании компьютерной программы «in-silico» на сайте http://insilico.ehu.es/DDSL для подбора пары ферментов рестрикции, дающих оптимальный размер фрагментов ДНК при генотипировании каждого вида патогена. Оптимизация метода заключается в подборе пар эндонукле-аз рестрикции, дающих четко различимые фрагменты ДНК, распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. Были испытаны десятки различных комбинаций ферментов у трех родов микроорганизмов (E.coli, Salmonella spp., Proteus spp.). После испытания различных рестриктаз была определена оптимальная комбинация для последующего использования в генетической паспортизации штаммов вида E.coli – XbaI и PstI. Рестриктаза XbaI имеет 39 сайтов расщепления в геноме кишечной палочки. Рестриктаза PstI имеет около 1000 сайтов расщепления, что дает средний размер фрагмента ДНК 2000 пар оснований, это является оптимальным с точки зрения разделения ДНК в 0,8% ага-розном геле. Указанные рестриктазы хорошо совместимы в одном буфере – буфер О (Сибэнзим), не проявляют «звездной» активности, стабильны, достаточно специфичны и недороги. В результате определены ферменты, которые можно использовать для генотипирования сразу нескольких видов патогенов. Впервые предложены два фермента рестрикции: крупнощепящая рестриктаза XbaI и мел-кощепящая рестриктаза PstI, которые являются совместимыми в одном буфере, дают оптимальный размер фрагментов ДНК при генотипировании одновременно двух родов микроорганизмов – E.coli и Salmonella spp.
В отношении Proteus spp. данная комбинация не подходит, поэтому была отобрана другая пара ферментов – SgsI/Eco32I. Поиск in-silico выявил, что лучшей крупнощепящей рестриктазой для протеев является SgsI, имеющая сайт узнавания и расщепления GGCGCGCC. Данный фермент имеет несколько десятков сайтов расщепления в геноме протея и производит так называемые «липкие» концы, которые метятся биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом (Bio-dCTP) с помощью Taq-полимеразы. Получаемые фрагменты ДНК не могут быть разделены в обычном агарозном геле, так как являются слишком крупными. Поэтому, в реакцию вводили мелкощепящую рестриктазу Eco32I, имеющую около тысячи сайтов расщепления и узнающую последовательность GATATC. Особенностью мелкощепящих рестриктаз является то, что получаемые многочисленные фрагменты ДНК имеют либо тупые, либо 3 -выступающие концы, которые не могут включить метку Bio-dCTP. В результате такого двойного расщепления размер фрагментов ДНК является оптимальным для разделения в агароз-ном геле. Такая избирательность мечения в реакции позволяет уменьшить число фрагментов ДНК с нескольких тысяч до нескольких десятков (обычно 30-40), и выявить это ограниченное число фрагментов на фильтре после их разделения по размеру в обычном агарозном геле.
Реакцию ДРИМ проводили в одной микропробирке, куда последовательно вносили 15 мкл воды, 2 мкл 10-кратного буфера R (Fermentas), 2 мкл выделенной исследуемой геномной ДНК и 1 мкл ферментной смеси (две эндонуклеазы рестрикции, Taq-полимераза и метка биотинилированный дезоксицитозинтри-фосфат - Bio-dCTP). Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при t 37,0±0,5С. После окончания реакции ДРИМ продукты двойного расщепления и мечения вносили в лунки стандартного 0,8% агарозного геля. Электрофорез проводили в течение 16 часов (ставили на ночь) при напряжении 60 вольт, длина геля равна 25 см. По окончании электрофореза фрагменты ДНК переносили на нейлоновый фильтр. Для этого использовали аппарат вакуумного переноса. Процесс длится 30-60 минут и проводится в дистиллированной воде на вакуумном приборе (денатурация и нейтрализация ДНК не требуется).
После этого фрагменты ДНК визуализировали в обычной цветной химической реакции с применением конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза по выявлению активности щелочной фосфатазы. Заключительный этап работы -анализ распределения фрагментов ДНК и выявление идентичных генотипов в группе, близкородственных штаммов и генетически далеких друг от друга бактерий.
В результате работы оптимизирована также процедура выделения геномной ДНК из этих микроорганизмов без использования лизоцима. Новизна метода заключается в том, что впервые одновременно используются два фермента рестрикции, проводится мечение и детекция небольшой части получаемых фрагментов ДНК (30–50) с помощью Taq-полимеразы и метки Bio-dCTP.
Разработанный нами метод ДРИМ позволяет идентифицировать одновременно около 35 фрагментов ДНК, что является рекордным показателем для мультилокусных методов генотипирования (RAPD – 5–10 фрагментов, ПГЭ – 15–20 фрагментов). Чем большее число фрагментов ДНК учитывается в анализе, тем более чувствительным становится данный метод.
Разработка технологического процесса изготовления вакцины инактивированной эмульгированной против сальмонеллеза птиц
Нами были разработаны этапы технологического процесса изготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза птиц (рисунок 54).
Технические требования
I. Состав вакцины
Инактивированная вакцина против сальмонеллеза птиц (S.Enteritidis + S.Typhimurium + Иммуномодулятор), представляет собой эмульсию, дисперсная фаза которой содержит в своем составе антигены S.Enteritidis, S.Typhimurium или (S.Enteritidis + 5.Typhimurium) в количестве не менее 10,08 КОЕ каждого в одной дозе и иммуномодулятор, а дисперсионная среда - масляный адъювант «Монтанид ISA-70».
Инактивированная вакцина комплектуется вышеуказанными антигенами в различных вариантах в зависимости от эпизоотической обстановки в птицехо-зяйстве.
II. Технологические операции
В состав разрабатываемого технологического процесса входят следующие технологические операции:
Стадия 1. Получение и контроль матричных расплодок S.Enteritidis и 5.Tvphimurium
Расплодка исходного материала S.Enteritidis и S.Typhimurium для на работки производственных расплодок
Контроль матричного материала:
S на отсутствие контаминации
S определение концентрации расплодки (в КОЕ/см3)
S закладка на хранение
Стадия 2. Получение и контроль производственных расплодок S.Enteritidis и S.Typhimurium
Накопление производственных расплодок S.Enteritidis и S.Typhimurium в количестве достаточном для производства одной опытной серии вакцины
Контроль производственного материала:
S на отсутствие контаминации
S определение концентрации расплодки (в КОЕ/см3)
Стадия 3. Инактивация и контроль инактивированных антигенов
S.Enteritidis и S.Typhimurium
Внесение в производственные расплодки S.Enteritidis и
S.Typhimurium инактиванта
Проведение процесса термостатирования производственных расплодок
Контроль стерильности (полноты инактивации) полученных антигенов S.Enteritidis и S.Typhimurium
Стадия 4. Получение инактивированной вакцины
? Подготовка адъюванта
? Смешивание антигенов и других ингредиентов в количествах, достаточных для изготовления одной опытной серии вакцины
? Получение предэмульсии
? Получение эмульсии (вакцины)
Стадия 5. Расфасовка инактивированной вакцины, этикетирование, упаковка
Флаконы по 50, 100, 200, 250 и 450 см3
Стадия 6. Контроль вакцины
S Внешний вид, стерильность, стабильность эмульсии, вязкость
S Безвредность
S Иммуногенная активность
Стадия 7. Хранение и транспортирование вакцины
III. Требования по назначению
Требования к материалам, производимым с помощью разрабатываемого технологического процесса (ТП)
Вакцина должна отвечать следующим критериям:
? внешний вид - однородная эмульсия белого цвета (допускаются оттенки сероватого, розоватого или желтоватого)
? наличие посторонних примесей, плесени, трещин упаковки - не допускается
? стерильность (полнота инактивации) - контаминация бактериальной и грибной микрофлорой не допускается
стабильность эмульсии - не должна расслаиваться при термостати-ровании при t 37,0±0,5оС в течение 30 суток
? безвредность - 100%
? иммуногенная активность - не ниже 80%.
Область применения
Инактивированная вакцина против сальмонеллеза птиц применяется в промышленном птицеводстве для профилактики сальмонеллеза кур птицехозяй-ствах различного технологического направления.
Инактивированная вакцина против сальмонеллеза птиц предназначена для создания активного продолжительного иммунитета у взрослого поголовья птиц.
IV. Требования к технологической документации
Технологическая документация должна разрабатываться в соответствии с требованиями стандартов ЕСТД или отраслевыми.
V. Требования к качеству производственного процесса
Допустимый процент выхода годной продукции на стадии 6 - контроль вакцины - должен быть не ниже 90%