Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы .12
1.1 Лейкоз крупного рогатого скота (историческая справка) 12
1.2 Характеристика вируса лейкоза КРС .14
1.3 Культивирование вируса лейкоза КРС .20
1.4 Методы диагностики лейкоза КРС .34
1.5 Сравнительная оценка методов устойчивости животных к лейкозу крупного рогатого скота
ГЛАВА 2 Объекты, материалы и методы
2.1 Объекты исследования .55
2.2 Методы подготовки перевиваемых линий клеток
2.2.1 Криоконсервирование клеток .56
2.2.2 Методы индикации микоплазм в клеточных культурах 57
2.2.3 Очистка ПЛК от микоплазменной инфекции .59
2.2.4 Методы аттестации перевиваемых линий клеток FLK
2.3 Контроль активности антигена ВЛКРС 62
2.4 Получение взвеси эритроцитов крови КРС .64
2.5 Биохимические методы исследования крови КРС 65
2.6 Методы статистической обработки результатов .67
ГЛАВА 3 Оптимизация и стандартизация культуральных моделей сублиний клеток flk для производства вируса лейкоза КРС .68
3.1 Сравнительная оценка методов индикации микоплазм-контаминантов
в сублиниях клеток FLK 68
3.2 Деконтаминация сублинии клеток FLK от микоплазм с использованием фторхинолонов 69
3.3 Технологические аспекты стандартизации сублиний клеток FLK 72
3.4 Цитометрический анализ сублиний клеток FLK .74 3.5 Сравнительная оценка репродуктивной активности вируса лейкоза КРС в сублиниях клеток FLK 79
CLASS ГЛАВА 4 Разработка технологии выделения нового антигена и условий постановки диагностической реакции на лейкоз КРС .83
4.1 Разработка технологии выделения нового комплексного антигена из культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D..84 CLASS
4.2 Анализ структурных белков, выделенных из культуральной ждкости тест-культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D .86
4.3 Разработка параметров постановки реакции агглютинации эритроцитов цитратной крови животных с новым комплексным антигеном .88
4.4 Сравнительная оценка эффективности разработанного способа
диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА и ПЦР 97
ГЛАВА 5. Влияние метаболических процессов в организме крупного рогатого скота на устойчивость к лейкозу . 99
Заключение .111
Выводы 120
Список сокращений 121
Список литературы
- Культивирование вируса лейкоза КРС
- Криоконсервирование клеток
- Деконтаминация сублинии клеток FLK от микоплазм с использованием фторхинолонов
- Разработка параметров постановки реакции агглютинации эритроцитов цитратной крови животных с новым комплексным антигеном
Введение к работе
Актуальность. Лейкоз крупного рогатого скота (КРС) – это хроническая инфекционная болезнь, протекающая на первом этапе бессимптомно, затем проявляющаяся лимфоцитозом и злокачественными образованиями в кроветворных и других органах и тканях. Возбудителем заболевания является РНК–содержащий вирус семейства Retroviridae – вирус лейкоза КРС (ВЛКРС) (Бессарабов Б.Ф. и др., 2007; Пономарева И.С., 2012; Гулюкин М.И. и др., 2013; Красникова Е.С. и др., 2014; Aida Y. et al., 2000).
BЛКРС по морфологическим признакам классифицирован как онкорнавирус типа С
млекопитающих. Вирионы ВЛКРС содержат в своем составе 60 % протеинов, 2,2%
нуклеиновых кислот, 0,5% углеводов и 35% липидов. Электрофоретический анализ
очищенных вирионов ВЛКРС показывает наличие в их составе 6 основных белков с
молекулярной массой (М.м.) от 10 до51 кД (p10, p12, p15, p24, gp30 и gp51). (Орлянкин Б.Г. и
др., 2000; Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И., 2005; Козырева Н.Г., 2013;
Верховский О.А., Алипер Т.И., 2013; Eisenman R.N., 1978; Matthews R., 1979).
При использовании серологических методов диагностики лейкоза КРС (РИД, ИФА) наиболее часто выявляются протеины p24 и gp51, которые не имеют общих антигенных детерминант с мажорными внутренними белками других онкорнавирусов животных типа C и D. Известно также, что адгезия этих белковых антигенов с эритроцитами оказывается довольно нестабильной. Именно в этом заключается причина не использования классической РГА для диагностики лейкоза КРС (Прохватилова Л.Б. и др., 1995; Джапаралиев Н.Т. и др., 2000; Пломодьялов Д.А. , 2010; Будчанов Ю.И., 2012; Miller S.M., 1972; Ressang A.A., 1974).
Возможно, что лишь пептиды с М.м. ниже 24 кД, либо выше 51 кД, сорбируются на эритроцитах более стабильно и более интенсивно, и будут наиболее перспективными для диагностики лейкоза КРС в реакции взаимодействия (агглютинации) с эритроцитами крови больного животного.
Степень разработанности проблемы. Индикация антител к рецепторным и структурным белкам (p24 и gp51) ВЛКРС широко востребована практикой. В тоже время серологические методы контроля не обеспечивают в отдельных случаях достоверной постановки диагноза, поэтому параллельно используют молекулярно – генетические методы для индикации специфического антигена, в том числе провируса лейкоза КРС. Данный подход дает возможность в процессе диагностических исследований решить проблемы как ложноположительных, так и ложноотрицательных реакций (Чичинина С.В. и др., 2006; Донник И.М. и др., 2010; Маркарян А.Ю., 2015; Bernoko D. et al., 1991; Blankenstein P. et al., 1998).
Несмотря на разработку и серийное производство достаточно эффективных серологических и молекулярно – генетических препаратов, способных выявить инфицированных животных даже на ранних стадиях инфекционного процесса, до настоящего времени не изучены и не востребованы практикой пептиды с М.м. ниже 24 кД, либо выше 51 кД. Не изучена их роль и значимость для диагностики лейкоза КРС.
Отсутствие апробированных практикой средств специфической профилактики и недостаточная эффективность серологических методов для выявления латентных форм болезни, определяет актуальность и необходимость поиска новых средств и методов борьбы, диагностики и отбора животных, устойчивых к лейкозу КРС (Левашов А.Т. и др., 1991; Незавитин А.Г., 1995; Галеев Р.Ф., 2000; Ласкавый В.Н. и др., 2004; Галеев Р.Ф. и др., 2009; Донник И.М., 2012; Козырева Н.Г. и др., 2014; Daniel R.K. et al., 1993; Ashwell M.S. et al., 2001; Dukkipati V.S. et al., 2006).
Вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.
Цель работы – совершенствование технологии приготовления антигенов для диагностики лейкоза КРС, оптимизация и стандартизация культуральных моделей, разработка новых методов диагностики и оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать сублинии клеток FLK и СПЭВ, условия их оптимизации и
стандартизации для получения антигена ВЛКРС и комплексного антигена из белковых
компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D;
разработать систему получения эталонного и рабочего банков тест – культур.
2. Усовершенствовать технологию производства и методы контроля качества
классического антигена ВЛКРС для диагностики лейкоза.
3. Определить спектр и физико-химические свойства белков, выделенных при культивировании линии клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D, ответственных за морфологические и функциональные изменения популяции клеток тест-культуры.
4. Оценить возможность и перспективность использования комплексного антигена из
белковых компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа
C и D, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
5. Разработать метод диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции
взаимодействия (агглютинации) эритроцитов цитратной крови животных с выделенным
комплексным антигеном, параметры и условия постановки реакции.
6. Обосновать метод оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу по комплексу наиболее информативных биохимических показателей крови, их качественным и количественным характеристикам.
Научная новизна. Впервые разработан и предложен для диагностики лейкоза КРС
комплексный антиген из белковых компонентов культуры клеток СПЭВ,
контаминированной онкорнавирусами типа C и D; определен спектр и физико-химические свойства белков, входящих в состав этого антигена.
Впервые разработан метод определения инфицированности животных вирусом лейкоза КРС по агглютинирующей способности эритроцитов цитратной крови животных с выделенным комплексным антигеном из белковых компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D.
Впервые экспериментально установлены качественные и количественные
характеристики биохимических показателей, определяющих устойчивость и
восприимчивость животных к лейкозу КРС.
Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены патентами РФ № 2452955 «Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу» и № 2560684 «Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения». Подана заявка на выдачу евразийского патента на изобретение №201500615 от 07.07.2015 г. «Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения».
Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментально
обоснованы условия культивирования и деконтаминации, методы контроля и проточной
цитометрии, стандартизации и создание главного (MS) и рабочего (WS) банков
перевиваемых линий клеток FLK и СПЭВ, предназначенных для производства и контроля активности антигенов, соответственно, ВЛКРС и антигена из клеток СПЭВ.
Определены оптимальные параметры производства компонентов и режима постановки реакции агглютинации эритроцитов цитратной крови исследуемых животных с белковым компонентом, выделенным из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами C и D.
Доказано, что отбор животных, устойчивых к заболеванию лейкозом по биохимическим показателям, обеспечивает сохранность, невосприимчивость к болезни и экономичность производства мясной и молочной продукции.
Полученные результаты исследований могут быть использованы при оздоровлении хозяйств от лейкоза. Данные используются в учебном процессе кафедры микробиологии, биотехнологии и химии Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова при чтении лекций и проведении практических занятий для бакалавров и магистров.
Методология и методы исследования. При проведении исследований и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволили обеспечить объективность полученных результатов и выводов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Сублиния клеток FLK-б в процессе серийного пассирования сохраняет
стабильность культуральных и морфологических показателей и обеспечивает максимальное
накопление антигена вируса лейкоза КРС.
2. Технология выделения комплексного антигена из культуры клеток СПЭВ,
контаминированной онкорнавирусами типа C и D, заключается в многократном
замораживании и оттаивании взвеси разрушенных клеток СПЭВ с монослоем из расчта 20
% взвеси и 80% поддерживающей среды с монослоем до появления 90% разрушенных
клеток в одной партии.
3. Из надосадочной жидкости, содержащей взвесь разрушенных клеток СПЭВ,
контаминированных онкорнавирусами типа C и D, выделен комплекс белков с Мм от 75 до
82 кДа, который был использован в качестве антигена для постановки диагностической
реакции.
4. Диагностическая реакция заключается во взаимодействии (агглютинации)
эритроцитов цитратной крови животных с выделенным комплексным антигеном из белковых
фракций с Мм от 75 до 82 кДа.
-
Разработанный метод диагностики позволяет эффективно, быстро и с минимальными затратами выявлять инфицированных животных и совпадает с результатами общепринятых методов диагностики лейкоза КРС: ПЦР, ИФА и РИД.
-
Устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу определяется на основе комплекса наиболее информативных биохимических показателей крови клинически здоровых животных: концентрации и средних значений кислой фосфатазы и продуктов липидного обмена (липазы, триглицеридов, липопротеидов очень низкой плотности).
Степень достоверности и апробация работы.
Высокая степень достоверности результатов проведенных исследований
подтверждается использованием общепринятых и современных вирусологических, микробиологических, биохимических методов исследований и обработки информации. Все исследования проведены с применением аттестованных методик и поверенного оборудования на специализированных лаборатории ФГБНУ «Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт».
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на научных конференциях: Международной научно-практической конференции «От теории к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); Региональной научно-практической межвузовской конференции «Достижения современной науки и практики в области охраны здоровья животных и человека» (Самара, 2011); Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2011-2013); Международных научно-практических конференциях «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 2012, 2014); 19-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука ХХI века» (Пущино, 2015); Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы к решению современных проблем ветеринарной медицины» (Екатеринбург, 2015).
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчетах по темам госзаданий РАСХН на заседаниях ученого совета и методической комиссии Саратовского НИВИ (2011-2015).
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами.
Диссертационная работа выполнена в рамках «Программы фундаментальных и
приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития
агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006 – 2010 годы» по проблеме
08 отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Разработать новые и
усовершенствовать существующие методы, средства, технику и технологии экспресс-
диагностики, лечения и профилактики болезней животных, прогнозирования их
возникновения и распространения, обеспечивающие сохранение ветеринарного
благополучия, получение продуктов и сырья животного происхождения высокого санитарного качества и охрану окружающей среды» и в рамках «Плана фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011 – 2015 годы» при выполнении этапа НИР: «Разработать новые и усовершенствовать существующие средства и методы борьбы с массовыми инфекционными болезнями молодняка животных на основе изучения их этиологической структуры, факторов патогенности возбудителей, закономерностей формирования иммунитета». Результаты исследований были использованы при выполнении НИР «Мониторинг эпизоотической ситуации по заболеванию лейкозом крупного рогатого скота и разработка научно-обоснованной эффективной системы профилактических и оздоровительных мероприятий».
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором в соответствии с планом НИР Саратовского НИВИ и заключается в постановке целей и обосновании путей решения поставленных задач и их реализации на практике. Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно. Автор лично принимал участие в апробации результатов работы, готовила материалы для публикации и патентования полученных данных. Материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 статей в журналах из списка рекомендованных ВАК РФ и 2 патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы из 301 источника, в том числе 124 иностранных авторов; содержит 12 таблиц и 5 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснованы актуальность работы, ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы цель и задачи исследования и пути их реализации.
Культивирование вируса лейкоза КРС
Возбудитель лейкоза КРС принадлежит к РНК-содержащим вирусам, патогенным для человека и различных видов животных. Вирус лейкоза КРС относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncornaviridae роду Deltaretrovirus. По морфологии, структурным, генетическим и функциональным особенностям ВЛКРС подобен вирусу Т-клеточного лейкоза человека HTLV-1 и HTLV-2 и вместе с ним относится к особой группе, обозначенной типа Е, однако в отличие от него поражает B 15 лимфоциты (Лоуи, 1989; Крикун, 2002; Генджиева, 2012; Van den Broeke, 2001; Dube, 2009).
Современная классификация семейства Retroviridae, принятая Международным комитетом по таксономии вирусов в 2005 году, определила 7 родов, в том числе род Deltaretrovirus, в состав которого входит ВЛКРС и Т-лимфотропные вирусы человека, приматов и обезьян (Госманов, 2006; Галеев, 2009; Konnai, 2006; Rodriguez, 2009). Представители семейства ретровирусов обладают онкогенными свойствами, не вызывая гибели клеток, но в то же время стимулируют их пролиферацию. Хроническое инфицирование клеток, в основном лимфоидного ряда, обусловлено сохранением ДНК-копии возбудителя лейкоза в геноме клетки хозяина в форме эндогенного провируса (Прохватилова, 2001; Козырева, 2013; August, 1974; Tajima, 2003; Sommerfelt, 1999). По механизму трансформирующего действия ретровирусы делятся на 3 группы: носителей вирусного онкогена, активирующие клеточные онкогены; вирусы человека, тропные Т-клеткам лимфатической системы и вирус лейкоза КРС (Русинович, 2008; Петропавловский, 2010; Szynal, 200; Lee, 2005).
Основным признаком всех возбудителей семейства Retroviridae является наличие в вирионах ретровирусов фермента – РНК-зависимой-ДНК полимеразы (ревертазы или обратной транскриптазы), с помощью которой происходит синтез вирусспецифической ДНК на матрице вирионной РНК ретровируса. Затем ДНК-копия вирусного генома встраивается в геном клетки хозяина и остаётся там пожизненно. Название фермента и дало название всему семейству – Retroviridae. Показано также, что ретровирусные инфекции характеризуются длительностью инкубационного периода, хроническим и латентным течением заболевания, длительной персистенцией вируса и строго ограниченным кругом восприимчивых животных (Иванова, 2000; Deren, 2003; Harms, 2004). Геном ретровирусов представлен двумя идентичными молекулами РНК, соединенными водородными связями. РНК ретровирусов состоит из 4 основных генов: gag, pro, pol и env. Ген gag кодирует белок, предшественник внутренних структурных белков вириона; ген pro – протеазу, pol - кодирует вирионную РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную траскриптазу); env -кодирует гликопротеид вирусной оболочки (gp51) и трансмембранный белок (gp30). Указанные гены обеспечивают репликацию вируса. Некоторые ретровирусы содержат клеточные гены (онкогены), играющие определяющую роль в индукции неопластической трансформации клеток. Вирионная РНК ретровирусов не обладает инфекционностью (Лоуи, 1989; Орлянкин, 2000; Козырева, 2013; Willems, 1995; Calomme, 2002; Felmer, 2005).
В состав подсемейства Oncornaviridae входят три рода, отличающиеся по морфологическим показателям: вирусы типов C, B и D. Вирусы типа C представлены онкорнавирусами типа C млекопитающих и вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Являясь экзогенным возбудителем лейкоза КРС, ВЛКРС отличается от известных ретровирусов по антигенным свойствам, морфогенезу, способности индуцировать образование синцитий в монослойных культурах клеток, по активности фермента ревертазы. И в отличие от большинства других возбудителей, он может присутствовать в лимфоцитах инфицированных животных в форме провируса. Установлено также, что ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей, а максимальная гемагглютинирующая активность (ГА) возбудителя наблюдается при pH-6,0 и температуре 4С. После обработки вируса тритоном Х100 или ультразвуком, ГА вируса повышается в 6-16 раз. Напротив, обработка трипсином или нейраминидазой значительно снижает ГА возбудителя. Обработка мышиных эритроцитов нейраминидазой также в 4 раза повышает их агглютинирующую активность. Гемадсорбирующие свойства вируса лейкоза КРС не установлены (Джапаралиев, 2002; Miller, 1972; Ressang, 1974; Barroso, 1998).
Зрелые вирионы ВЛКРС имеют эллипсовидную, округлую, а в некоторых случаях гантелевидную форму. Вирионы содержат центрально расположенные, электронно-плотные нуклеоиды, размером от 40 до 90 нм, окружённые оболочкой. Диаметр нуклеоида варьирует в зависимости от методов фиксации и обработки препарата. Центральная часть нуклеоида отделена от внешней вирусной оболочки электронопрозрачной зоной. Гексагональное очертание нуклеоида в ультратонких срезах предполагает икосаэдрическую симметрию. В цитоплазматических вакуолях наблюдается выраженная гетерогенность вирионов по форме, размерам и степени зрелости. При соприкосновении вируссодержащих вакуолей с плазмой клеток наблюдается процесс почкования и выход во внеклеточное пространство, в основном зрелых вирионов онкорнавирусов типа С. Оболочка вирионов формируется с участием цитоплазматической мембраны клеток. Внешняя вирусная оболочка представлена 2-х контурной мембраной, которая лабильна, из-за чего диаметр вирионов может сильно варьировать - от 73до 120 нм. На поверхности внешней оболочки вируса выявляют шипики с пуговкообразным утолщением на конце, длиной 8-11нм. Вирионы имеют низкую плавучую плотность в градиенте сахарозы 1,15-1,18г/мл, в градиенте CsCl 1,17-1,33г/мл, и в градиенте плотности метризамида 1,105 – 1,120г/мл. Плотность нуклеокапсидов составляет 1,28 г/мл. Вирионы содержат протеины 60%, нуклеиновые кислоты 2,2%, углеводы 0,5% и большое количество липидов (35%), что обуславливает высокую чувствительность ВЛКРС к эфиру, хлороформу и фосфолипазе (Орлянкин, 2000; Мальцева, 2002; Пломодьялов, 2010; Kettman, 1976; Bull, 1989).
Криоконсервирование клеток
В последние годы определяющая роль иммунной защиты животных отводится главному комплексу гистосовместимости – МНС (Aida, 1994, 2000; Stear, 1998; Teodore, 1988; Trowsdale, 1991). Известно, что гены этого комплекса контролируют иммунный ответ (иммунологическую реактивность), устойчивость или предрасположенность животных к различным заболеваниям, а использование иммунологических методов позволяет выявить и отобрать для селекции животных с высокой иммунологической реактивностью, которые более устойчивы к заболеваниям, что дает возможность формировать высокопродуктивные и высокорезистентные стада животных (Davies, 1994; Johansson, 1992; Lunden, 1990; Ostergard, 1991).
Сравнительно высокая наследуемость (r=0,3-0,7) иммунного ответа на ряд антигенов (ФГА, конканавалин, бычий альбумин, эритроциты барана, Е.coli и др.), позволяет рассматривать их как достаточно объективные показатели и использовать в качестве маркера, для отбора животных с высокой иммунореактивностью. Достоверно показано, что животные с низкой иммунологической реактивностью более подвержены различным заболеваниям, в частности лейкозу и маститу. Они почти в два раза чаще поражаются лейкозом и маститами по сравнению с животными среднего уровня реактивности и в 4-15 раз чаще высокореактивных, что указывает на низкий уровень защитного потенциала у этой популяции особей в процессе развития и течения болезни (Пономарёва, 2012; Hines, 1991; Park, 1991).
Показано также, что из всех РИД+ коров матерей, 85,5% потомства оказались инфицированными вирусом лейкоза и только 15% были здоровыми. Напротив, в группе РИД коров матерей большинство потомства (83,4%) были свободными от вирусоносительства. В этом случае очевидна роль иммунного статуса материнского организма и передача наследственной информации по устойчивости или предрасположенности к лейкозу (Незавитин, 1995; Lewin, 1986).
Огромное значение в развитии лейкозного процесса и возникновении опухолей имеет естественная резистентность организма и иммунологическая реактивность, особенно параметры клеточной системы (T- лимфоциты). Состояние естественной резистентности зависит, в первую очередь, от полноценного кормления с учетом возрастных потребностей, физиологического состояния и продуктивности животных. Нарушение неспецифических защитных механизмов может привести к расстройству клеточного взаимодействия, необходимого для индукции иммунного ответа (Манько, 2011; Svejgaard, 1981). Инфицированию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и развитию болезни способствуют генетическая предрасположенность и дефекты иммунитета, часто развивающиеся в результате нарушения технологии содержания, кормления и воздействия неблагополучных факторов внешней среды. Вероятность инфицирования крупного рогатого скота вирусом лейкоза при снижении естественной резистентности возрастает на 25-30%. У инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота и больных лейкозом коров повышается общее количество лимфоцитов, при этом снижается способность В-клеток продуцировать иммуноглобулин класса М (Фёдоров, 1996; Логинов, 2003; Пономарёва, 2009; патент 2375715; Lundberg, 2000; Meirom, 1997).
Разработана методика определения адаптационных возможностей организма животных, основанная на поиске нейтрофилов с оксифильной реакцией гранул, эозинофилов с частичной дегрануляцией и с последующим подсчётом индекса гетерофилов на 100 – 200 нейтрофилов, по которому оценивают полноценность компенсаторно-приспособительных реакций организма (патент 2133035). Оценить устойчивость КРС к лейкозу можно путём определения соотношения лимфоцитов (ЛФ) и сегментоядерных нейтрофилов (СН). Если значения ЛФ/СН не превышают 5,0, резистентность считается высокой, если же отношение выше 10,0 – низкой (патент РФ № 2285260; Смирнов, 1995). Однако данный способ подразумевает неоднозначное толкование результатов из-за того, что отношение лимфоцитов к сегментоядерным нейтрофилам может характеризовать наличие и других инфекционных заболеваний.
В неблагополучных по лейкозу хозяйствах с высокой заболеваемостью имеются значительные в процентном отношении группы животных так называемого повышенного риска с иммунодифицитом, который проявляется нарушением соотношения T- и В-лимфоцитов. Доказано, что наиболее стабильным признаком в иммунной системе больного и инфицированного скота, свидетельствующим об иммунной недостаточности, является увеличение общего числа лимфоцитов за счет увеличения числа В лимфоцитов, и уменьшение числа Т-лимфоцитов (Семененко, 2012). В связи с этим существует иммунологический метод оценки предрасположенности КРС к заболеванию лейкозом, основанный на определении в крови животных процентного содержания общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования (Е-рок), выведении коэффициента отношения (Ко) количества лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов. При Ко меньше 4,2, - животное здорово; при Ко равном 4,3 и более – животное инфицировано или с повышенным риском к заболеванию лейкозом; при Ко от 4,9-16,4 - животное больно или с повышенным риском к заболеванию лейкозом (Прошин, 2001; патент РФ № 2379683).
Однако генетические маркеры (группы крови, гены главного комплекса гистосовместимости тканей и другие тесты) и другие показатели естественной резистентности (опсонофагоцитарная, лизоцимная, бактерицидная, комплементарная и пропердиновая активность СК) нестабильны и зависят от условий содержания, кормления, возраста и пола животных, поэтому использовать их в селекционной работе в качестве маркера резистентности не представляется возможным.
Деконтаминация сублинии клеток FLK от микоплазм с использованием фторхинолонов
Изменения показателя гранулярности для сублиний клеток FLK-a и FLK-б отражает параметр MEAN, свидетельствующий о средне статистическом положении максимума пика рассеивания света клетками под углом 90о, т.е. о распределении клеток по показателю гранулярности (рис. 3). Анализу подвергались не обработанные красителями клетки. Параметр характеризует состояние структуры клеток, соотношение ядра и цитоплазмы, а также свидетельствует о наличии в популяции аномальных и апоптотических клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что по гранулярности и коэффициенту вариации показателя (CV) клетки сублиний FLK-a и FLK-б отличались незначительно. Это заключение отражают показатели MEAN, равные соответственно 503 (CV 25,77) и 465 (CV 26,58).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что среднестатистические размеры клеток и показатель гранулярности клеток сублиний FLK-a и FLK-б отличаются незначительно. Эти факты указывают на различную предысторию культивирования и хранения тест-культур во ВНИИЗЖ и ВНИИВВиМ. Это позволяет сделать заключение, что условия хранения оказывают существенное влияние на свойства сублиний клеток почки эмбриона овцы. Рисунок 3 – Распределение клеток сублиний FLK-а, FLK-б и микросфер диаметром 10 мм ( С-контроль) по показателю гранулярности цитоплазмы
В наших экспериментах уровень апоптотических клеток обеих сублиний клеток FLK был в пределах нормы. В тоже время, в сублинии клеток FLK-б показатель апоптоза был практически в 2 раза ниже, чем в сублинии клеток FLK-a и не превышал 8,6%. Отмеченный факт, а также минимальное количество апоптотических телец в ростовой питательной среде, свидетельствуют о том, что клетки FLK-б находятся в удовлетворительном состоянии и более пригодны для производства антигена вируса лейкоза КРС.
В то же время в сублинии FLK-а было выявлено 17,5% апоптотических клеток и визуально большое количество апоптотических телец в ростовой питательной среде, что, по-видимому, связано с неблагоприятной предысторией и, возможно, неадекватными условиями поддержания и хранения тест-культуры. Поэтому с целью сохранения ростовых свойств и поддержания спонтанного апоптоза сублинии FLK-б на оптимальном уровне нами был создан эталонный и рабочий криобанки клеток с перспективой применения тест-культуры и практических целях в течение не более 30 пассажей от исходного уровня.
Таким образом, в результате проведенных исследований для получения антигена ВЛКРС нами предложена сублиния клеток FLK-б, характеризующаяся удовлетворительными ростовыми свойствами, оптимальными показателями ПЦ, нормальной морфологией и высокой репродуктивной активностью. Выявлена прямая зависимость величины апоптоза и качества тест-культуры.
Этот факт подтверждает возможность и перспективность использования метода ПЦ для экспресс-оценки биологических и вируспродуцирующих свойств сублиний клеток гомологичного вида, поддерживаемых в отечественных и международных коллекциях. Также он позволяет рассматривать апоптоз в качестве объективного, практически значимого показателя при выборе наиболее перспективного клеточного субстрата, отвечающего международным требованиям, как для целей диагностики, так и производства антигенов. Прежде всего, это относится к проценту клеток, находящихся в состоянии спонтанного апоптоза. Однозначная интерпретация полученных данных затруднена, однако, учитывая результаты, полученные в опытах с 2 сублиниями клеток, можно достоверно говорить о корреляции величины апоптоза и культуральных свойств. Для повышения качества тест-культур ин-витро необходим поиск средств и методов профилактики апоптоза и оптимизации условий поддержания клеток в культуре (Маянский, 1997; Gorman, 1997).
Разработка параметров постановки реакции агглютинации эритроцитов цитратной крови животных с новым комплексным антигеном
Лейкозы, в том числе лейкоз КРС, представляют собой системные заболевания и, следовательно, их возникновение, течение и исход должны отражаться на биохимическом статусе организма, причем зависимость может быть как прямой (изменение значений биохимических параметров под влиянием заболевания), так и обратной (роль биохимического статуса в возникновении заболевания и его влияние на динамику лейкоза). Поэтому наряду с разработкой новых и совершенствованием существующих методов диагностики и профилактики лейкоза научный и практический интерес представляют исследования по поиску биохимических тестов, определяющих устойчивость популяции животных к лейкозу КРС.
В связи с этим, представляло интерес определить спектр значимых для развития лейкоза биохимических показателей у КРС и оценить их участие в патогенезе болезни и в формировании устойчивости животных к заболеванию лейкозом. Для решения указанных задач определяли широкий спектр биохимических показателей, отражающих состояние белкового, липидного, углеводного, минерального обмена, а также энергетического и пластического обменов. В сравнительном аспекте оценивали устойчивость клинически здоровых животных к лейкозу КРС в зависимости от уровня кислой фосфотазы (КФ) и продуктов липидного обмена.
В экспериментах участвовали 14 голов крупного рогатого скота в 36-месячном возрасте. Все они на момент забора крови были клинически здоровы, что подтверждается общим анализом крови и реакцией иммунодиффузии. Исследуемая группа находилась в стаде КРС, содержащем 10 % инфицированных вирусом лейкоза животных.
Повторные иммунологические пробы, проведённые через год, выявили наличие антител к вирусу лейкоза КРС у части экспериментальных животных. Результаты биохимического анализа были проанализированы на предмет поиска значимых различий у заболевших и не заболевших животных (табл. 11).
Показатели Животные 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Кислаяфосфатаза,мккат Липаза, мккат Триглице-риды, ммоль/л ЛПОНП,ммоль/л Лейкоциты, г/л Из таблицы следует, что значения активности кислой фосфатазы имеют значения ниже среднего у 7 животных (с №8 по №14), у животного №4 этот показатель сравним со средним значением, у остальных 6 животных он выше среднего значения.
Поскольку у животного №4 значение кислой фосфатазы было сравнимо со средним значением, провели дополнительные исследования липидных показателей, также определяя их средние значения по данной группе. Установлено, что у животного № 4 значения липазы, триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности ниже среднего значения.
Таким образом, по дополнительному критерию отбора животное № 4 оказалось восприимчивым к лейкозу. Проведённые диагностические исследования (РИД и ПЦР) подтвердили, что животные № 8-14 устойчивы к лейкозу, а другие (№ 1-7) – восприимчивы. Высокая активность кислой фосфатазы у клинически здоровых животных № 1-7 и выявленная у них положительная реакция в тесте РИД и ПЦР может свидетельствовать об увеличении у них количества и/или физиологической активности белых клеток крови. Раздражение лейкоцитарного ростка кроветворения, в свою очередь, является фактором, предрасполагающим к заболеваниям крови. У коров № 8-14 активность кислой фосфатазы была ниже средней по группе в 2,3-2,9 раза. При последующем наблюдении в течение 6 месяцев и проведении диагностических исследований (РИД и ПЦР) эти животные лейкозом не заболели.
Проведённые гематологические исследования подтвердили, что все животные, использованные в эксперименте, были здоровы.
Таким образом, для решения поставленной задачи был разработан способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу, заключающийся в заборе крови и исследовании индивидуальных физиологических показателей в группе клинически здоровых животных, при котором оценивают активность кислой фосфатазы, определяют её среднее значение для этой группы животных, сравнивают значение кислой фосфатазы каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных; при понижении активности кислой фосфатазы относительно её среднего значения судят об устойчивости организма животного к лейкозу.
В случае активности кислой фосфатазы, сравнимой со средними значениями для данной группы животных, дополнительно исследуют показатели липидного обмена: активность липазы, концентрацию триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности. При этом определяют их средние значения для этой же группы животных, сравнивают значения липазы, триглицеридов и липопротеидов очень низкой плотности со средней величиной каждого из показателей и при одновременном понижении всех этих параметров относительно средних значений судят о восприимчивости организма животного к лейкозу, а при значениях не ниже средних – об устойчивости.
В доступных источниках патентной и научно-технической информации не описано эффективного способа оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу на основе анализа значений кислой фосфатазы в крови здорового животного.
Кислая фосфатаза относится к классу гидролаз, подклассу гидролаз фосфорных моноэфиров. Как и другие фосфатазы, катализирует гидролиз ортофосфорных сложных моноэфиров с отщеплением фосфат-иона. Активность кислой фосфатазы обнаруживается в клетках различных тканей и органов, как в лизосомах, так и вне их. Фермент присутствует в клетках печени, селезенки, почек, в эритроцитах, тромбоцитах, в костном мозге, а также в нейтрофилах и лимфоцитах крови. Довольно высока активность кислой фосфатазы в остеокластах, а также в макрофагах. Активность кислой фосфатазы в макрофагах служит показателем кислороднезависимого киллинга. В частности, повышение активности кислой фосфатазы наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах, при туберкулезе, злокачественных опухолях, при иммунизации, при различных аллергических заболеваниях.