Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Основные эпизоотологические данные по инфекционным болезням респираторного тракта у коз при хроническом течении 12
1.2. Этиология инфекционных болезней респираторного тракта у коз при хроническом течении 19
1.2.1. Биологические свойства микоплазм 32
1.3. Патогенез микоплазменной инфекции при поражении респираторного тракта коз 38
1.4.Клиническое проявление микоплазменной инфекции при поражении респираторного тракта коз 41
1.5. Патологоанатомические признаки микоплазменной инфекции при поражении респираторного тракта у коз 43
1.6.Диагностика микоплазменной инфекции у коз с поражением респираторного тракта 46
1.7. Лечение, профилактика, меры борьбы при микоплазменных инфекциях коз, вызывающих патологию респираторной системы 49
2. Собственные исследования 56
2.1. Материалы и методы исследования 56
2.2. Результаты исследований 61
2.2.1. Характеристика Приозерского района Ленинградской области 61
2.2.2. Технология выращивания и содержания коз в ЗАО ПХ «Красноозерное» 64
2.3. Эпизотическая ситуация в ЗАО ПХ «Красноозерное» 73
2.4. Клиническое исследование коз 81
2.5. Патологоанатомическое и гистологическое исследования 87
2.6. Бактериологическое исследование биологического и патологического материала от коз 96
2.6.1. Изучение культурально-биохимических свойств выделенных микоплазм 99
2.7. Просвечивающая электронная микроскопия выделенных микоплазм 105
2.8. Молекулярно-генетический метод идентификации выделенных микоплазм 115
2.9.Экспресс - метод диагностики атипичной пневмонии коз в реакции агглютинации 120
3. Обсуждение результатов исследований 123
4. Выводы 139
4.1. Практические предложения 140
5. Список использованной литературы 141
Приложение
- Этиология инфекционных болезней респираторного тракта у коз при хроническом течении
- Патологоанатомические признаки микоплазменной инфекции при поражении респираторного тракта у коз
- Характеристика Приозерского района Ленинградской области
- Просвечивающая электронная микроскопия выделенных микоплазм
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Козоводство – отрасль животноводства, дающая ценную и разнообразную продукцию: гипоаллергенное молоко, мясо, пух, шерсть, кожу, мех. До распада Советского Союза в 1991 году поголовье коз составляло 7,3 млн голов. Экономический кризис 90-х г.г. практически разрушил основу для создания крупнотоварного молочного козоводства в нашей стране (М.Ю. Санников , 2005). Тем не менее, переход экономики на рыночные отношения дал импульс развитию молочного козоводства уже на новой основе частного ведения производства. В России исторически молочное козоводство развивалось в мелкотоварных хозяйствах и частных подворьях населения. Племенных хозяйств и ферм-репродукторов по разведению молочных коз в стране до недавнего времени не было. В 2001 году при ГНУ СНИИЖК создан один из первых репродукторов по разведению молочных коз зааненской породы (Халимбеков З.А.,2010).
К 2004 году число коз в России составило 1, 1 млн. голов, или 0,7% от общемирового поголовья (1 FAOSTAT ). Последнее десятилетие козоводство в нашей стране интенсивно развивается, завозятся животные из разных стран для восполнения поголовья, а также для получения максимальной продукции от высокомолочных зарубежных пород коз, в том числе зааненская и альпийская (Халимбеков З.А.,2010).
В некоторых областях и республиках России, особенно в центральных и южных регионах, козоводство в настоящее время является ведущей отраслью. Однако современные технологии выращивания молодняка со значительной концентрацией животных на ограниченных площадях, стойловым содержанием в течение всего года, отсутствием выгулов, содержанием в помещениях, не всегда соответствующим зоогигиеническим нормам, недостаточной инсоляцией повышают функциональную нагрузку на организм животных, что приводит к увеличению числа болезней органов дыхания (Думова В.В., Мищенко В.А., Киселев М.Ю., 2011; Будулов Н.Р.,2009).
Большим тормозом для развития промышленного козоводства являются инфекционные болезни, поражающие респираторный тракт коз, причем чаще встречаются "неспецифические бронхопневмонии", которые занимают доминирующее положение в респираторной патологии (Демидчик, Л.Г.,2005; Аль-Каттани, Л.М. 2003;Соколов М.Н.1961; Балакаев А.Д., 1994; Губьянева Н.С.,1998). Основной причиной возникновения пневмоний у молодняка являются вирусы (аденовирус, герпесвирус ИРТ, вирус синцитиальной инфекции, вирус парагриппа-3, коронавирусы и другие), которые, вызывая инфекционный процесс в макроорганизме, создают оптимальные условия для жизнедеятельности в нем бактерий (пастерелл, микоплазм, хламидий и других), что приводит к осложнению вирусного заболевания (Думова В.В., Мищенко В.А., Киселев М.Ю., 2011; Daniel, J. A., 2006; Pugh D.G.,2002; Woods L.W.,2001; Ackermann, M. R., 2000; Matthews J.,1999; Brogden, K. A, 1998; Baker J.C. 1990; Покатилова, Г.А. 1988; Begrundet von H. Rohrer, 1988). Взаимо-действие микроорганизмов различных классов приводит к значительному усилению тяжести течения респираторных болезней
молодняка. Ассоциативное течение болезней осложняет их диагностику, профилактику и терапию (Думова В.В., Мищенко В.А., Киселев М.Ю., 2011;Будулов Н.Р.,2009).
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время диагностика инфекционных болезней коз при промышленном содержании осуществляется в период карантинирования при вводе новых животных в хозяйство/ферму на основные особо опасные болезни (туберкулез, бруцеллез и др.), а также в случае внезапного падежа животных согласно установленного плана в хозяйстве по диагностике и профилактике инфекционных болезней. В случаях массовых хронических болезней, внезапном спорадическом падеже животных не всегда используется комплекс методов для установления точного диагноза, что в свою очередь ведет к неправильному выбору профилактических и лечебных мероприятий для снижения и ликвидации массовых хронических поражений дыхательной системы коз. Общепризнано, что в последние годы заметно возросла роль микоплазм и хламидий в респираторной патологии животных и человека. Данная проблема в определенной степени обусловлена внутриклеточным характером существования этих возбудителей, вследствие чего они кардинально отличаются от остальных бактерий и вызывают много проблем в диагностике и терапии. Стандартные бактериологические исследования патологического материала и серологические исследования сывороток крови, чаще всего не приносят достоверных результатов при диагностике хронических болезней респираторного тракта у коз. Это обстоятельство было принято во внимание при определении выбора темы научных исследований.
Цель работы: установить причины хронической респираторной патологии у коз заанеской породы в условиях промышленного содержания в Ленинградской области и усовершенствовать лабораторную диагностику микоплазменной инфекции. Для достижения цели были определены следующие задачи:
-
Провести эпизоотологическое обследование хозяйства фермы «Светлое», ЗАО ПХ Красноозерное Ленинградской области.
-
Изучить характер течения пневмоний и бронхита у коз зааненской породы и выделить клинические, патологоанатомические особенности респираторного микоплазмоза.
-
Изучить роль микробных ассоциаций, в том числе микоплазм, в развитии инфекционных респираторных болезней у коз зааненской породы.
-
Определить этиологическую значимость микоплазменной инфекции у коз зааненской породы с уточнением роли отдельных видов микоплазм.
-
Разработать научно-обоснованный комплекс диагностических исследований при атипичной пневмонии коз зааненской породы, вызываемой Mycoplasma ovipneumoniae.
Научная новизна исследований. Впервые в Северо-Западном регионе
страны изучены эпизоотологические и клинические особенности
хронической респираторной патологии, протекающей по типу смешанной инфекции, у коз зааненской породы различных возрастных групп при промышленном выращивании в хозяйстве Ленинградской области. Апробирован комплекс современных диагностических исследований для идентификации Mycoplasma ovipneumoniae и Mycoplasma arginini, как основных этиологических агентов хронической респираторной патологии коз (атипичной пневмонии).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Определены критерии для лабораторной диагностики болезни атипич
ной пневмонии коз. Установлена эффективность питательных сред (PPLO)
(производство США, Франция) со специальным индикатором для
обнаружения и определения биохимических свойств микоплазм. Выявлена эффективность применения просвечивающего электронного микроскопа для уточнения чистоты культур микоплазм по их морфологическому строению. Показана информативность ПЦР в диагностике смешанной респираторной инфекции коз с участием микоплазм. Предложена технология изготовления антигена M.ovipneumoniae для экспресс-диагностики атипичной пневмонии коз в реакции агглютинации на стекле.
Методология и методы исследования.
Работа выполнена в период 2011-2014 г.г. на кафедре эпизоотологии
им. В.П.Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная
академия ветеринарной медицины» и на базе козофермы «Светлое» (КС)
ЗАО ПХ «Красноозерное» Приозерского р-на Ленинградской области; в
ФГБУ «Ленинградская Межобластная Ветеринарная Лаборатория»,
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)(г. Владимир); ВНИИВВиМ (г. Покров);
гистологическое исследование органов дыхания (легкие) коз проводили в
патоморфологическом отделе ветеринарной клиники ООО «ВЕГА» (г. СПб);
определение культурально-биохимических свойств микоплазм - в НПП
«Авивак» (г. СПб); детекцию накопленной культуры микоплазм – в
независимой ветеринарной лаборатории «Поиск» (г. СПб); визуальную
оценку микоплазм в культуре проводили путем электронной микроскопии в
клинико-диагностической лаборатории Научно-исследовательского
института Гриппа МЗ РФ (г. СПб).
Метод исследования: эпизоотическую ситуацию козофермы изучали с учетом анализа статистических данных при эпизоотологическом обследовании, ветеринарных отчетных документов хозяйства, материалов собственных наблюдений и исследований.
Клинические исследования крови коз проводили утром перед дачей корма. Кровь отбирали из яремной вены в вакуумные пробирки для клинического исследования системы VACUTEST с люер-адаптером. Транспортировку проб в лабораторию осуществляли в термоконтейнере ТМ-8. Гематологические исследования у подопытных коз проводили общепринятыми методами.
Гистологические исследования нижних отделов органов дыхания от павших и вынужденно убитых коз проводили по стандартной методике в патоморфологическом отделе ветеринарной клиники ООО «ВЕГА» (г. СПб), в качестве фиксирующей жидкости использовали 10% нейтральный формалин.
Выделение и изучение микоплазм в патологическом материале от коз проводили в НПФ «АВИВАК» (г. СПб) в соответствии с «Методическими рекомендациями по выделению, культивированию, идентификации мико-плазм», Новочеркасск, 1974.
Полученные чистые культуры M. arginini и M. ovipneumoniae микро-скопировали в просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM 1011 для уточнения чистоты культуры по морфологическому строению клеток. Электронные микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Morada (Olympus Inc.).
Выявление ДНК M. arginini и M. ovipneumoniae проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле в независимой ветеринарной лаборатории «Поиск» (г. СПб) по стандартной методике с использованием соответствующих праймеров. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью набора Termo Scientific Fastruler Ultra Low Range DNA Ladder, ready-to-use (USA,Sweden) методом электрофореза в 1,7% агарозном геле в буферном растворе 1Х ТВЕ (Tris/Borate/EDTA) при 180 V в течение 30 мин; краситель - бромистый этидий.
Антигенную массу для постановки РА получали согласно «Инструкции по изготовлению и контролю набора для диагностики микоплазм мелеа-гридис инфекции индеек в РА» , 1980 с адаптацией данной методики к мико-плазмам, полученным от коз. Из чистой культуры Mycoplasma ovipneumoniae был получен антиген для тест-системы – РА на стекле с целью прижизненной экспресс-диагностики микоплазмоза.
Результаты экспериментальных исследований подвергали статистической обработке с использованием программ Microsoft Excel 2007 и BioStat 2007.
В процессе работы был исследован биологический и патологический
материал от коз, в головах: в бактериологических исследованиях - 31; в
ПЦР для обнаружение ДНК микоплазм - 20; в гистологических
исследованиях на микоплазмоз - 16; в твердофазном ELISA, ИФА, ПЦР на блутанг – 238; артрит-энцефалит – 247; методом пальпебрального введения и ПЦР на туберкулез – 225; в РСК на листериоз – 11; в РМА на лептоспироз – 11; в РА, РНГА, РИД на бруцеллез – 236; в РДСК на хламидиоз – 11; в гельминтологическом исследовании - 13% подкарантиного стада – 30.
Внедрение результатов работы в практику.
1.Результаты исследований явились основой при разработке учебно-методического пособия «Эпизоотология, диагностика, профилактика мико-плазмозов коз».-СПб.:Изд-во ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ»,2015.-30с. (Утверж-
дено меодическим советом ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ», прот. №6 от
04.06.2015г.)
2. Материалы научных исследований внедрены в учебный процесс на
кафедре эпизоотологии им. В.П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская
государственная академия ветеринарной медицины», на кафедре внутренних
болезней животных ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная
академия ветеринарной медицины», на кафедре клинической диагностики
ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной
медицины», на кафедре патологической анатомии ФГБОУ ВО «Санкт-
Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», на
кафедре инфекционной и инвазионной патологии Белгородского
государственного аграрного университета имени В.Я.Горина. Полученные данные используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов ветеринарных факультетов высших учебных заведений.
Положения, выносимые на защиту:
-
Эпизоотологические и клинические особенности хронической респираторной патологии коз зааненской породы при промышленном выращивании.
-
Неспецифическая реактивность иммунной системы организма коз в различные периоды года.
-
Комплекс современных диагностических исследований при хронической респираторной патологии у коз, протекающей по типу смешанной инфекции с участием микоплазм.
-
Выявление основных этиологических агентов атипичной пневмонии коз.
-
Способ изготовления антигена M.ovipneumoniae для экспресс-диагностики атипичной пневмонии коз в РА на стекле.
Степень достоверности и апробация результатов. Исследования проводили на достаточном по объему фактическом материале согласно утвержденному плану исследований. В работе использованы современные методы лабораторных исследований, проведен статистический анализ полученных данных. Данные исследования позволили предположить с высокой степенью вероятности, что Mycoplasma ovipneumoniae является одной из основных причин в развитии непрогрессивной (атипичной) пневмонии коз. Результаты исследований не вызывают сомнений по достоверности полученных данных и выводам, сделанным на их основе.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 66-й международной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (СПб, 2012). 68-й международной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (СПб, 2014); международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (СПб, 2014); международном агропромышленном конгрессе «Агрорусь» (СПб,2013); на II международном ветеринарном конгрессе VETistanbul-2015 («СПбГАВМ», 2015 г.); на IV международной
конференции «Инновационные разработки молодых ученых – развитию агропромышленного комплекса» (Ставрополь, 2015 г.)
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 статей, в которых изложены основные положения и выводы по работе, из них 3 – в периодических изданиях, входящих в перечень российских научных рецензируемых журналов для опубликования основных результатов диссертаций, утвержденных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 210 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 52 рисунками, 5 диаграммами. Список литературы включает 195 источника, в том числе 166 работ иностранных авторов.
Этиология инфекционных болезней респираторного тракта у коз при хроническом течении
Заболевания, связанные с поражением респираторного тракта у коз, встречаются и регистрируются повсеместно, в независимости от климатических и географических характеристик, в то время как технология разведения коз зависит от местности, климата. При благоприятных естественных условиях козы меньше страдают болезнями респираторного тракта инфекционной природы. Росту инфекционных болезней способствуют также внешнеэкономические связи при экспорте и импорте животных. Кроме того, акклиматизация с перестройкой организма животного под новые условия обитания всегда является огромным стрессом, что неминуемо приводит к развитию иммунносупрессии, способствующей развитию бронхопневмоний инфекционного характера, чаще протекающих в хронической форме.
В различных частях континентальной Европы, Азии и Африки сталкиваются с рядом серьезных заболеваний коз, наиболее важными из которых являются поражения репродуктивной системы и органов респираторной системы, возбудители которых относятся к роду Mycoplasma. Данные болезни вызывают острое и хроническое течение заболеваний, приводящих к снижению продуктивности животных и эпизотическим падежам (Nicholas R.A.J., 2002).
Микоплазмозные инфекции являются значимыми болезнями коз, которые могут приводить к большим потерям среди поголовья животных, а так же к эпизотическим вспышкам болезни (DaMassa , 1987b). Микоплазмозы представляют собой наиболее важную группу инфекционых атипичных заболеваний в крупных промышленных козоводческих хозяйствах. Основной патологией, связанной с микоплазмами, являются пневмонии, но могут регистрироваться также полиартриты и маститы. Источниками возбудителя инфекции являются клинически больные животные и бактерионосители. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Скученность, общее кормление и водопой, стресс (сильные дожди, холодная погода, недостаточное питание, перевозки и другие факторы могут спровоцировать острое заболевание при латентном течении. (Kusiluka, Kambarage, 1996; Taylor-Robinson D. 1996; Lo S-C., 1992).
Первые изоляции микоплазм из дыхательных путей мелкого рогатого скота были зарегистрированы у овец в 1955 г. (Greig, 1955). Из дыхательных путей овец и коз были выделены следующие виды микоплазм: М. agalactiae от коз Cottew , Lloyd в 1965г. и овец Arisoy в 1967г., М. arginini от коз Arisoy в 1967г. и овец Barile в 1968г., М. mycoides subsp. capri («штамм PG 3 ») от коз Chu и Beveridge в 1949г., М. mycoides subsp. mycoides от коз и овец Al-Aubaidi в 1972г., М. ovipneumoniae от овец и коз Mackay в 1963г.
В период с 1979 по 1987 г.г. на территории Канады от павших, больных и здоровых коз были выделены M. ovipneumoniae, обнаружены антитела к бычьему респираторно-синцитиальному вирусу (Black , 1988).
М. ovipneumoniae была изолирована от здоровых, а также больных коз. Выделение этого вида микоплазм было зарегистрировано во многих странах мира, включая Австралию (Sullivan, 1973; Cottew, 1980), США (St. George, Carmichael,1975г; Livingston, Gauer, 1979), Великобританию (Foggie, 1976), Германию (Stipkovits, Schimmel, 1977), Ирак (Al-Sulta, Zubaidy, 1978г), Судан (Harbi, 1981), Исландию (Friis, 1976г), Венгрию (Stipkovits, 1975; Martin W.B.,1983). Harbi в 1977г. (Martin W.B.,1983) в различных частях Нигерии из легких коз при серологическом исследовании в 92%случаях выделил микроорганизмы из рода Mycoplasmaе: M. ovipneumoniae, M. agalactiae , M. arginini; в Судане - M.arginini, M. mycoides subspecies capri, M. ovipneumoniae и Mycoplasma из штамма F 38; в Кении и Эфиопии - Mycoplasma штамм F 38 и M. mycoides subspecies capri; в Танзании - M. mycoides subspecies mycoides , M. mycoides subspecies capri, M. ovipneumoniae, M. capricolum, M. arginini и M. agalactiae. Первую документально зафиксированную вспышку заболевания респираторного тракта зафиксировали в стаде коз и овец (овцы долли), которые были в ведении зоопарка в г. Торонто. Вспышка началась после того, как двух животных доставили в стадо после пребывания их за пределами зоопарка и контакта их с двумя домашними овцами (Black S. R., I. K. Barker K. G., Mehren G. J., 1988). Спустя 2 месяца у семи из десяти особей наблюдали влажный кашель, а через 10 дней после этого у 40% животных зарегистрировали острый респираторный дистресс-синдром, несмотря на лечение несколькими антибиотиками. Две особи пали. Через год после начала болезни у некоторых зараженных животных обнаружили истощение, кашель. С тех пор после выявления M. ovipneumoniae у коз и горных баранов данный микроорганизм стали считать причиной эпизотических вспышек болезней респираторного тракта.
В Новой Зеландии в 1974 г. Mycoplasma ovipneumoniae была выделена от коз при непрогрессивной (атипичной) пневмонии и данная болезнь эксперементально воспроизведена с участием микоплазм, что стало поводом считать указанный микроорганизм причиной пневмонии у коз (Gilmour , 1979).
Патологоанатомические признаки микоплазменной инфекции при поражении респираторного тракта у коз
Методы исследования: изучение эпизоотической ситуации козофермы «Светлое» ЗАО ПХ «Красноозерное» проводили с учетом анализа статистических данных при эпизоотологическом обследовании с использованием отчетных документов козоводческого хозяйства, материалов собственных наблюдений и исследований (приложение № 32). Клинические исследования крови проводили во всех группах коз утром в период с 8.00 часов до 10.00 часов перед дачей корма. Кровь для клинического исследования отбирали из яремной вены в вакуумные пробирки (системы VACUTEST с люер адаптером, пробирки объемом 9 мл с K-2-ЭДТА / K-3-ЭДТА для клинического исследования). Транспортировку проб крови осуществляли в термоконтейнере ТМ-8 при температуре 8…10 C, хранение проб крови проводили при температуре 8…10 C.
Гематологические исследования у подопытных животных проводили общепринятыми методами (Кондрахин И.П., 2004). Гематологические показатели включали в себя определение количества лейкоцитов. Количество лейкоцитов подсчитывали камерным методом, с использованием счётной камеры и сетки Горяева. Мазки крови готовили на предварительно обезжиренных сухих предметных стёклах и окрашивали по методу Филипсона.
Определение фагоцитоза проводили с применением культуры Streptococcus albus (Скопичев В.Г., 2008).
Усредненное значение количества лейкоцитов и фагоцитоза получали с помощью программы BioStat 2007. Достоверность различий между группами коз по количественным признакам оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия двух сравнимых величин считали статистически значимыми при р 0,05.
Регулярно осуществляли клиническое обследование с целью изучения особенностей течения и клинического проявления респираторных болезней. Проводили вскрытие павших и вынужденно убитых коз на временно выделенной площадке на территории хозяйства по методу Шора с частичной эвисцерацией внутренних органов.
Патологический материал отбирали после гибели животного и доставляли в лабораторию в течение нескольких часов в охлажденном виде. При невозможности доставить в лабораторию патологический материал в течение суток, его отправляли в консервированном виде (глубокая заморозка сухим льдом , t сухого льда = - 78,45 C) в термоконтейнере ТМ-8 (Бурлаков В.А., 2004).
Гистологические исследования нижних отделов органов дыхания от павших и вынужденно убитых животных в различных стадиях болезни проводили по стандартной методике. В качестве фиксирующей жидкости использовали 10% нейтральный формалин (Коржевский Д.Э., 2010; Меркулов Г.А, 1961).
Выделение и изучение биохимических свойств микоплазм проводили НПФ «АВИВАК» (г. СПб) в соответствии с «Методическими рекомендациями по выделению, культивированию, идентификации микоплазм», Новочеркасск, 1974., адаптированными к биологическому и патологическому материалу, полученному от объекта исследования.
При разработке метода получения антигенной массы для постановки РА использовали «Инструкцию по изготовлению и контролю набора для диагностики микоплазм мелеагридис инфекции индеек в РА» , 1980 с адаптацией данной методики к микоплазмам, полученных от объекта исследования.
Для выделения микоплазм использовали среды компании BD (Becton, Dickinson and Company. 2014 BD) с обогащением ингибиторами роста сторонней микрофлоры (уксуснокислый таллий 1:2500 и пенициллин 200ЕД/мл среды). В качестве индикатора изменения рН среды под влиянием роста микоплазм использовали фенолрот в концентрации 0, 0001%. Ферментную активность (способность ферментировать глюкозу) и способность изменять рН среды изучали в процессе выращивания микоплазм.
Из выдеденной чистой культуры микоплазм был получен антиген Mycoplasma ovipneumoniae для тест-системы - РА. Данная тест-система (диагностикум для РА) была опробована на 5-месячных козах данного хозяйства для быстрой прижизненной экспресс-диагностики микоплазмоза.
Полученные чистые культуры микоплазм микроскопировали в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) JEOL JEM 1011 для уточнения чистоты культуры и дополнительного подтверждения нахождения в суспензии интересующих микроорганизмов по их морфологическому строению.
Суспензию микоплазм наносили на медные сетки для электронной микроскопии, покрытые коллодиевой подложкой. После адсорбции микоплазм к подложке в течение 1 мин сетки дважды промывали дистиллированной водой. Далее выполняли негативное контрастирование микоплазм на сеточках 2%-м раствором натриевой соли фосфорновольфрамовой кислоты в течение 1 мин. После контрастирования сеточки высушивали и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM 1011. Электронные микрофотографии получили с использованием цифровой фотокамеры Morada (Olympus Inc.). Типизацию полученной чистой культуры микроорганизмов, относящихся к семейству Mycoplasmataceae, проводили с помощью молекулярно-генетического метода. Полимеразно-цепную реакцию проводили в независимой ветеринарной лаборатории «Поиск» (г. СПб) по стандартной методике с применением соответствующих праймеров:
Характеристика Приозерского района Ленинградской области
Показатели частоты дыхания у коз зааненской породы в различные сезоны года. Из данных, приведенных на рис.8 и рис.9 видно, что показатели температуры у коз зааненской породы опытной группы в сравнении с показателями температуры у коз контрольной группы в период июля 2011 г. превышают в 1, 02 раза; в период ноября 2011 г. – в 1,03 раза; в период марта 2012 г. – в 1,03 раза соответственно. Показатели частоты дыхания в минуту опытной группы в сравнении с контрольной группой, в первый период ( июль 2011 г.) : превысили в 1,3 раза ; во второй период (ноябрь 2011 г.) – в 1, 38 раза; в третий период ( март 2012 г.) – в 1,3 раза соответственно. Полученные данные указывают на постоянное повышение показателей температуры и частоты дыхания у коз зааненской породы в опытной группе в сравнении с аналогичными показателями контрольной группы животных, что свидетельствует о воспалительном процессе в органах дыхания.
Отбирали венозную кровь для клинического исследования из яремной вены от коз в вакуумные пробирки (см. приложение № 1).
В результате исследований состояния картины белой крови у коз зааненской породы в возрасте 5 месяцев при их промышленном содержании выявлено следующее (рис. 10 и рис. 11): в первый период исследований (июль 2011г.) общее содержание клеток белой крови (лейкоцитов), в среднем, составило 19,7 ±2,2х109 /л у клинически больных животных, у клинически здоровых – 10,9±2,5х109 /л; фагоцитарная активность - 83,4%±2,6 у клинически больных животных, у клинически здоровых – 57,2%±5,5. Во второй период исследований (ноябрь 2011г.), соответственно: лейкоциты: 10,9±1,2х109/л у клинически больных , у клинически здоровых - 8,5±0,5х109/л; фагоцитарная активность – 59,0%±4,5 у клинически больных животных, у клинически здоровых – 41,7%±1,7. В третий период исследований (март 2012г), соответственно: лейкоциты: 9,8±1,5х109/л у клинически больных животных, у клинически здоровых – 6,4±0,4х109/л; фагоцитарная активность у клинически больных животных – 52,1%±4,8 , у клинически здоровых – 34,1%±1,7 .
В результате морфологических исследований крови установлено, что количество лейкоцитов у клинически больных животных колебалось от 9,8±1,5х109/л до 19,7 ±2,2х109 /л. Самый высокий показатель количества лейкоцитов приходится на летний период, также как и фагоцитарная активность, что свидетельствует о хроническом течение инфекционного процесса в организме коз. Проведенные исследования указывают на активное сопротивление их организма в летний период года, по-видимому, за счет улучшения условий содержания, повышенной температуры окружающей среды и в помещениях и за счет кормления животных в основном зеленой подвяленной травой, сенажом, и силосом. Фагоцитарная активность у коз зааненской породы при промышленном содержании в различные сезоны года. Известно, что основное назначение лейкоцитов — участие в защитных реакциях организма, а фагоцитарная активность является физиологическим критерием функционального состояния лейкоцитов. Фагоцитарная активность, определенный нами у коз зааненской породы при промышленном содержании в возрасте 5 мес. (июль), 9 мес. (ноябрь), в возрасте 1 год (март) в летний период года указывает на то, что у клинически больных животных количество лейкоцитов было в 1,8 раза выше по сравнению с клинически здоровыми (Р0,0008), в весенний период – в 1,3 раза (P0,0215) соответственно, в зимний период – в 1,5раза (P0,0373) соответственно.
Фагоцитарная активность в летний период у клинически больных животных превышала таковую у клинически здоровых в тот же период в 1,48 раза (P0,0001), в ноябре – в 1,4 раза (P0,0011) соответственно, в марте – в 1,5 раза (P0,0012) соответственно. Полученные данные указывают на то, что у клинически больных коз с хронической респираторной патологией во все периоды исследования повышены показатели температуры тела, частоты дыхания, неспецифической резистентности организма, по сравнению с аналогичными показателями у клинически здоровых животных. Предполагаем, что в связи с постоянной повышенной температурой тела и частотой дыхания, а также продолжительной напряженностью иммунной системы возможно снижение иммунологических показателей, что в свою очередь ведет к обострению инфекционного процесса, поражению легочной ткани, региональны лимфатических узлов, проявляющиеся пневмониями, плевритами с наслоением секундарной микрофлоры. 2.5. Патологоанатомическое и гистологическое исследования Для изучения характера поражения и локализации патологоанатомических изменений нами были проведены патологоанатомические и гистологические исследования легочной ткани от клинически больных коз, павших животных, опытной группы и клинически здоровых коз контрольной группы. При проведении патологоанатомического исследования нами были отобраны пробы для бактериологического исследования. Из легочной ткани павших и вынуждено убитых животных во всех случаях нами были выделены микроорганизмы, относящиеся к роду Mycoplasma, тогда как из легочной ткани от клинически здоровых коз микоплазмы не выделены.
Патологоанатомическим исследованием органов грудной полости от 16 коз зааненской породы в возрасте 3…6 мес (органы респираторной системы) выявлено: отечность слизистых оболочек трахеи и бронхов, фибринозные и крупозные наложения на слизистой оболочке крупных, средних и малых бронхов, увеличение бронхиальных и средостенных лимфатических узлов. Признаки лобулярной или лобарной серозно катаральной и катарально-гнойной пневмонии имели локализацию в краниальных, средних (сердечных) и каудальных (диафрагмальных) долях. Наблюдали студенисто-желтое содержимое в грудной полости при поражении практически всех долей легких с синюшным оттенком. Примененная нами гистологическая методика при приготовлении микропрепаратов из тканей легких коз зааненской породы подтвердила данные патологоанатомического осмотра туш животных. При патологоанатомическом исследовании легочной ткани от 5 клинически здоровых коз, убитых с диагностической целью установлено: легкие воздушные, светло-розового цвета. При гистологическом исследовании легочная ткань воздушная без признаков воспаления, со слегка гиперемированными участками межальвеолярной ткани. Ниже представлены иллюстрации легочной ткани при патологоанатомическом и гистологическом исследовании в сравнении нормальной легочной тканью от клинически здорового животного и лёгких, полученных от павших коз зааненской породы (рис. 12…28).
Просвечивающая электронная микроскопия выделенных микоплазм
Ввиду того, что козоводство в России является новой отраслью животноводства, ввиду того, что животных ввозят с территорий других стран, что, несомненно, приводит к появлению болезней ранее не встречавшихся на территории нашей страны, заболевания, связанные с поражением респираторного тракта у коз, встречаются и регистрируются повсеместно, в независимости от климатических и географических зон. Технология разведения коз зависит от местности, климата. Чем более благоприятны естественные условия для коз, тем меньше животные страдают болезнями респираторного тракта инфекционного генеза. Росту инфекционных болезней способствуют также внешнеэкономические связи при экспорте и импорте животных. Кроме того, акклиматизация, перестройка организма животного под новые условия обитания всегда является огромным стрессом, что неминуемо приводит к развитию иммунносупрессии, способствующей снижению резистентности, что является одной из причин появления болезней респираторного тракта с хроническим течением. Заболевания респираторного тракта у коз превалируют над другими заболеваниями этих животных. Поражение респираторного тракта обычно связано с инфекционными болезнями, с неудовлетворительными условиями содержания и кормления. Скученное содержание животных, нарушение кормления и стресс-факторы способствуют активизации микроорганизмов, находящихся в латентном состоянии, способствуя развитию инфекционного процесса (Msami H.I., 1991; Blood D.C., 1989; Jones G.E., 1989; Losos G.J., 1986).
При постановке диагноза необходимо учитывать тот факт, что хронические заболевания респираторного тракта коз являются полиэтиологичными. Это подтверждают многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов (M. Rifatbegovi, Z. Maksimovi, B. Hulaj, 2011 ; Rifatbegovis , 2011; Falong Yang, Cheng Tang, Yong Wang, 2011; Dassanayake, R. P., 2010; Daniel, J. A.,2006; Ackermann, M. R. , 2000; Семенихин А.Л. ,1999; Kusiluka, Kambarage, 1996; Brogden, K. A, 1998; Taylor-Robinson D. 1996; Lo S-C., 1992; Begrundet von H. Rohrer, 1988; Покатилова, Г.А. 1988; Aytu 1987; Martin 1983, 1996; Леви, М.Ф, 1947).
Показано, что у клинически здоровых животных из органов респираторной системы выделяют различные микроорганизмы: пастереллы, микоплазмы, хламидии, вирусы. Их жизнедеятельность оказывает негативное влияние на органы респираторного тракта коз, а при определенных условиях приводит к прогрессированию и клиническому проявлению болезней органов дыхания. Нередки случаи хронического течения бронхопневмоний коз в условиях промышленного козоводства (Daniel, J. A.,2006; Aсkermann, M. R. , 2000; Brogden, K. A, 1998; Покатилова, Г.А. 1988; Begrundet von H. Rohrer, 1988; Леви, М.Ф, 1947). В различных частях континентальной Европы, Америки, Азии и Африки вееринарные специалисты сталкиваются с рядом серьезных заболеваний коз, наиболее важными из которых являются поражения респираторной и репродуктивной системы (кроме того у коз могут регистрироваться также полиартриты и маститы), возбудители которых относятся к роду Mycoplasma: инфекционная плевропневмония коз обусловлена M. capricolum subsp. capripneumoniae; острая плевропневмония - М. mycoides subsp. mycoides LC, М. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp capricolum; атипичная пневмония - М. ovipneumoniae; кератоконъюктивиты - M. conjunctivae; маститы - М. agalactiae. Микоплазмозные инфекции являются значимыми болезнями коз, которые могут приводить к значительным потерям среди поголовья животных, а также к эпизотическим вспышкам (Nicholas R.A.J., 2002; Kusiluka, Kambarage, 1996; DaMassa , 1987b).
В настоящее время открыты и описаны многие виды микоплазм, которые могут вызывать заболевания различной степени тяжести от острого до бессимптомного течения. Микоплазмозы часто ассоциируются с бактериальными и вирусными болезнями, предрасполагая к развитию вторичных пневмоний (M. Rifatbegovi, Z. Maksimovi, B. Hulaj, 2011 ; Rifatbegovis , 2011; Falong Yang, Cheng Tang, Yong Wang, 2011;; Dassanayake, R. P., 2010; Семенихин А.Л. ,1999). Усугубление течения заболеваний респираторного тракта у коз также может быть связано с различными вирусными агентами, относящимися к короновирусам, герпесвирусам, аденовирусам, лентивирусам, парамиксовирусам и другими (Jacobsen B, Thies K, von Altrock A., 2007; Timothy M Rose , 2005; Tempesta M. , Camero M. , Sciorsci R.L.,2004; Pugh, 2002; Li H, Keller J, Knowles D.P., 2001; Zarnke , 2000; Frederick A., Murphy E., Paul J., 1999; Matthews, 1999; Matthews, 1999; Krausman, 1996; Baker, 1990; Rodger, 1989; Kimberling, 1988; Dunbar, 1986; Trigo,1984a; Parks J.B., Post G., Thorne T., 1972).
При патологоанатомическом исследовании легочной ткани у больных животных при инфицировании M. ovipneumoniae обнаруживали чаще всего фибринозную генерализованную бронхопневмонию, фибринозный плеврит. При гистологическом исследовании выявляли гиперплазию бронхиол, скопление белых кровяных телец, фиброз и некроз, гиперплазию альвеолярных перегородок, перибронхиолярные манжеты из лимфоцитов, которые в дальнейшем приводят к обструкции и констрикции воздухоносных путей (Besser , 2008; Rudolph , 2007; Alley , 1999; Niang , 1998; Black , 1988).
Идентификация микоплазм, в частности M.ovipneumoniae, как возбудителя атипичной пневмонии, сложна. Изначально причину вспышек заболевания респираторного тракта у коз связывали только с микроорганизмами Pasteurella spp. и Mannheimia haemolytica. (R. A. Mohamed, E. B. Abdelsalam, 2008; Garde E., Kutz S., Schwantje H. Veitch, 2005; Boudreaux, 2004; Schommer , Woolever, 2001; Foreyt , 1996; Martin, 1996).
Трудность в выделении культуры M. ovipneumoniae, как и других микоплазм, осложняет постановку диагноза. В связи с тем, что микоплазмы являются весьма требовательными микроорганизмами из-за их специфического строения и метаболизма, сформированных в период эволюции, их чрезвычайно сложно культивировать (Razin., 1998), что подтверждается нашими многоплановыми бактериологическими исследованиями. Микроорганизмы из рода Mycoplasma могут быть выделены из пораженных легких, лимфатических узлов средостенья, плевральной жидкости на специфических средах (PPLO-средах [pleuropneumonia-like organisms] ) (Ongor H, Kalin R , Acik N. M., 2011), что также подтверждается нашими исследованиями.
В настоящее время разработан иммуноферментный анализ (ИФА) и РИФ для выявления антител к микоплазмам в биологическом материале от больных коз (бронхиальная слизь, носоглоточные смывы) и в патологическом материале (бронхи, легкие, плевральная жидкость) от павших животных. Серологические исследования (различные варианты РСК, РИФ, РДП, РНГА, РА, ИФА) проводятся с целью выявления в сыворотках крови коз специфических антител к антигенам микоплазм, вызвавших заболевание, сохраняющихся в течение года после переболевания (Бессарабов Б. Ф.,. Вашутин А. А, Воронин Е. С., 2007; Ефанова Л. И. , Сайдулдин Е.Т. , 2004).