Введение к работе
1.1 Актуальность темы
Респираторные болезни крупного рогатого скота являются одной из основных причин экономического ущерба в индустрии молочного и мясного животноводства всего мира. Тяжесть их проявления варьирует от острых клинических форм, приводящих к летальному исходу, до субклинических или бессимптомных инфекций, сопровождающихся снижением показателей продуктивности у переболевших животных (К.П. Юров, А.Ф. Шуляк, 2001; М.И. Гулюкин и соавт., 2007; О.Г.Петрова, И.А. Рубинский, 2015; W. M. Hilton, 2014).
Как правило, они являются результатом взаимодействия предрасполагающего стресса, снижающего функционирование врожденных механизмов защиты респираторного тракта, а также первичной инфекции одного или нескольких вирусов и бактерий, синергетическое взаимодействие которых приводит к усилению тяжести инфекционного процесса (H.H. Крюков и со-авт., 1984; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; А.Г. Глотов и со-авт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; D.G. Bryson, 2000; К. A. Brogden, J.M. Guthmiller, 2002).
Ведущую роль в возникновении респираторных болезней играют вирусы инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС), вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС), а также бактерии семейства Pasteurellaceae - M. haemolytica и P. multocida (К.П. Юров и соавт., 2003, 2006; А.Г. Глотов с соавт., 2008, 2017; А.К. Схатум с соавт., 2015; D.G. Bryson, 2000; C.L. Kelling, 2000; A. J. Ellis, 2009; G.P. Grisset et al., 2015; B.A. Frana Dias de Oliveira et al., 2016; B. Earley et al., 2017). К настоящему времени у каждого из перечисленных возбудителей выявлено несколько генетических типов, распространение которых на территории нашей страны изучено недостаточно. Особую актуальность эта проблема приобретает в настоящее время в связи с завозом в нашу страну племенных животных из-за рубежа (страны Евросоюза, США, Канада). В данной ситуации существует реальная угроза заноса на территорию страны новых, ранее не встречавшихся, генотипов возбудителей, против которых у животных отсутствует иммунитет и не разработаны отечественные вакцины.
Клиническая картина респираторных болезней, вызванных разными возбудителями, часто очень сходна, особенно при смешанных инфекциях и, в большинстве случаев, не позволяет определить возбудителя (J. D. Taylor et al., 2010 a,b), поэтому при проведении противоэпизоотических мероприятий при смешанных вирусно-бактериальных инфекциях большое значение имеет лабораторная диагностика, основанная на комплексном использовании традиционных и современных молекулярно-генетических методов (А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, 2008; V. L. Cooper, B. W. Brodersen, 2006).
1.2 Степень разработанности проблемы
Работы по разработке молекулярно-генетических методов выявления возбудителей респираторных болезней КРС проводились в нашей стране и за рубежом в различные годы.
При разработке молекулярно-генетических методов для выявления ДНК вируса ИРТ КРС Морозов И.А. (1989), А.Г. Глотов (1999), С.В. Котене-ва (2006), S. Belak (1988), L.H. Wagter (1996), S.E. Ashbaugh (1997), C. Ros (1999), F.S. Kibenge (1994) и другие использовали праймеры и зонды на гены гликопротеинов В и С, a также тимидинкиназы, для повышения чувствительности применяли гнездовую ПЦР и ПЦР в комбинации с блот-гибридизацией.
По данным S. Belak (1991), J.F. Ridpath (1993), D. Deregt (2002) и других, выявление РНК вируса ВД-БС КРС в биологическом материале с помощью ОТ-ПЦР является более чувствительным и быстрым методом по сравнению с выделением вируса в культуре клеток. Из-за высокой чувствительности и специфичности ПЦР считают альтернативой вирусологическим методам, особенно при исследовании объединенных образцов.
После открытия в 1990 г. двух генотипов вируса ВД-БС КРС начали активно проводиться исследования по изучению их распространения, а также по разработке методик генетической дифференциации на основе ПЦР. Первые исследования в этом направлении были проведены в 1994-1995 годах J.F. Ridpath и S. Harpin. Позднее D.G. Sullivan и R.K. Akkina (1995), J.F. Ridpath и S.R. Bolin (1998) и другие разработали различные варианты ПЦР для дифференциации пестивирусов, а также субтипов вируса ВД-БС КРС.
В нашей стране исследования по выявлению генома вируса ВД-БС КРС и секвенированию изолятов носят ограниченный характер. В CCCР первая вспышка болезни в форме геморрагического воспаления желудочно-кишечного тракта зарегистрирована в 1970-73 гг. (Крюков Н.Н. с соавт., 1978). Первые исследования по генотипированию проводил М.И. Шульпин в 2003 – 2004 годах. Он показал широкое распространение вируса субтипов 1f, 1b и 1а в Центральном регионе РФ. Г.К. Юров с соавт. в 2013 году нашли в популяции домашнего скота и лесных бизонов два антигенно различающихся штамма вируса 1а и 1 m.
Первую реакцию на основе ПЦР для выявления токсигенных штаммов P. multocida разработали S. Nagai c соавторами в 1994. Разработкой ПЦР для выявления P. multocida в биологическом материале или для типирования чистых и смешанных культур занимались C.W. Lee (2000), K.M. Townsend (1998), D. Liu et al., 2004), а для выявления M. haemolytica - T.W. Alexander (2008), S. Guenther (2008) и другие. В нашей стране разработке ПЦР для выявления P. multocida и M. haemolytica посвящена только работа М.А. Шибаева (2010).
Известно, что во время массовых вспышек респираторных болезней популяция бактерий семейства Pasteurellaceae может представлять смесь патогенных и непатогенных вариантов. Типирование культур бактерии
P. multocida и M. haemolytica по генам патогенности и вирулентности является важным маркером для определения их роли в развитии болезни. До сих пор такие исследования носят ограниченный характер. Типированием культур P. multocida по этим генам занимались С. Ewers (2006), K. Katsuda (2013). На основании статистических расчетов авторы пришли к заключению о важной роли трех генов (tbpa - трансферринсвязывающий протеин, pfha - фила-ментный гемаглютинина, hgbb - гемоглобин связывающий протеин) в пато-генности бактерии для КРС. В нашей стране такие исследования не проводились. Ряд авторов, Э.А. Шегидевич (1993), Ю.М. Ручнова (2006) и другие, проводили серологическое и несерологическое типирование бактерий, а также изучали их патогенность на лабораторных животных.
Таким образом, возникла необходимость разработки новых, более эффективных методов диагностики и генетического типирования основных вирусов и бактерий, вызывающих респираторные болезни, основанных на выявлении возбудителей и их основных генетических типов при помощи ПЦР, рестрикции и секвенирования непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах.
1.3 Цель и задачи исследований
Цель исследований – разработка и изучение эффективности комплексной системы диагностики и генетического типирования ведущих возбудителей респираторных болезней крупного рогатого скота на основе методов молекулярной биологии в современных условиях ведения молочного животноводства.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Теоретически обосновать, определить и отработать оптимальные параметры диагностических ПЦР для выявления вирусов инфекционного ри-нотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС) и вирусной диареи- болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) в лабораторных и производственных условиях, определить их диагностическое значение при расшифровке этиологической структуры респираторных болезней. Провести генетическое типирование и филогенетический анализ изолятов вирусов, циркулирующих в хозяйствах по производству молока.
-
Теоретически обосновать, определить и отработать оптимальные параметры мультиплексной ПЦР в классическом и Real-time-форматах с гибри-дизационно-флюоресцентной детекцией для выявления и генетического ти-пирования бактерий семейства Pasteurellaceae. Провести типирование культур бактерий по генам вирулентности или их аллельным вариантам (omph, tbpa, pfha , hgbb для P. multocida и lkta для M. haemolytica), изучить влияние этих генов на патогенность культур бактерий для белых мышей, а также на некоторые биологические характеристики. Провести филогенетический анализ выделенных культур бактерии P. multocida по гену omph.
-
С использованием комплекса разработанных молекулярных методов изучить частоту выявления и распространение вирусов ИРТ КРС, ВД-БС
КРС и бактерий семейства Pasteurellaceae, а также характер и состав ассоциаций этих возбудителей при смешанных респираторных болезнях крупного рогатого скота среди животных раз личного возраста, происхождения и продуктивности.
1.4 Научная новизна
При выполнении данной работы разработаны и использованы основанные на ПЦР методы выявления и генетического типирования вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС, бактерий P. multocida и M. haemolytica в биологических образцах, определена их диагностическая эффективность. При помощи разработанных методов изучена частота выявления отдельных возбудителей, а также их ассоциаций при смешанных респираторных болезнях крупного рогатого скота среди животных различного возраста, происхождения и молочной продуктивности.
Проведено генетическое типирование респираторных изолятов вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС. По результатам ПЦР-ПДРФ-анализа изоляты вируса ИРТ КРС преимущественно относились к генетической группе «Cooper-подобные», в четырех случаях выявлены изоляты вируса, которые были отнесены к группе «ТКА-подобные». При генетическом типировании и секве-нировании впервые в России выявлена циркуляция 9 субтипов (1a, 1b, 1c, 1d, 1i, 1f, 1p, 2b и 2c) вируса ВД-БС КРС при респираторной патологии животных, с преобладанием двух – 1b и 1а, а также субтипа 2а при генитальной патологии.
Впервые выявлено одновременное участие в респираторной патологии изолятов P. multocida капсульных групп А и D и отсутствие изолятов кап-сульной группы В и Е.
Впервые в России проведено секвенирование и нуклеотидный анализ гена omph референтных штаммов и изолятов бактерии P. multocida, определены аминокислотные последовательности антигенных детерминант протеина OmpH и осуществлена дифференциация изолятов бактерии на omph-типы. Проведено типирование культур бактерий по маркерным генам (tbpa, pfha , hgbb), ассоциированным с вирулентностью для крупного рогатого скота, и определена взаимосвязь их выявления с omph-типом, капсульной группой, патогенностью для беспородных белых мышей.
Впервые проведено типирование изолятов бактерии M. haemolytica по гену lkta и определена связь выявления аллельного варианта гена с патоген-ностью изолята для беспородных белых мышей и резистентностью к антибиотикам.
1.5 Практическая значимость и внедрение
Материалы диссертации использованы при составлении 10 методических рекомендаций:
- «Выявление вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции с последующей дифференциацией вакцинного штамма и эпизоотических изолятов», утвержденных Уче-6
ным советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 6 от 06 ноября 2004 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 11 от 10 ноября 2004 г.);
«Вирусные и ассоциативные вирусно-бактериальные респираторные болезни крупного рогатого скота (Особенности эпизоотологии, патогенеза, клинического проявления, патологоанатомических изменений)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 6 от 09 ноября 2004 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхо-закадемии (протокол № 23 от 09 ноября 2004 г.);
«Молекулярные методы диагностики: принципы и практическое применение при инфекционных болезнях животных», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 2 от 03 мая 2005 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 4 от 03 мая 2005 г.);
«Планирование программ вакцинации при вирусных респираторных болезнях крупного рогатого скота», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 1 от 17 января 2006 г.) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Рос-сельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (протокол № 1 от 17 января 2006 г.);
«Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (историческая справка, характеристика возбудителя, особенности эпизоотологии, клиническое проявление и экономическое значение)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 1 от 17 января 2006 г.) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (протокол № 1 от 17 января 2006 г.).
«Стратегия и принципы применения противовирусных препаратов при вирусных болезнях продуктивных и мелких домашних животных», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30 октября 2007 г.);
«Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Рос-сельхозакадемии (протокол № 1 от 30 октября 2007 г.) и подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 30 октября 2007 г.).
«Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике вирусных болезней крупного рогатого скота», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.) и подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.);
«Профилактика и лечение вирусных респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота», рассмотренных и рекомендованных к изданию научно-техническим советом Красноярского государственного университета (протокол №2 от 20.04.2011 г.);
«Применение иммуномод уляторов для повышения иммуногенности вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота», рассмотренных и утвержденных Ученым советом ИЭВСиДВ СФНЦА РАН (протокол №1от 20.10.2016).
Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на:
-
Тест-систему для выявления и типирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-2.6/01845);
-
Тест-систему для выявления и генотипирования вируса вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота методом по-лимеразной цепной реакции (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02498);
-
Тест-систему для выявления и генотипирования бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica методом ПЦР (прошла испытания в ФГБУ ВГНКИ, протокол испытания от 16.06.2015 г.).
1.6 Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002); 2-й международной научно-практической конфер енции Ставропольского ГАУ (Ставрополь, 2003); Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» (Петропавловск, 2003); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004); Сибирском международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); 3-ей Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Международной научно- практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ (РАСХН) Я.Р. Коваленко «Актуальные проблемы патологии и иммунологии животных» (Москва, 2006); Научно-практической конференции «Роль аграрной науки в развитии сельскохозяйственного производства Крайнего Севера» (Якутск, 2006); 3-й международ-
ной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии и сельскохозяйственной биотехнологии» (Павлодар, 2007); Научно-практической конференции, посвященной 50-летию Якутского НИИСХ СО РАСХН «Роль аграрной науки в развитии сельскохозяйственного производства Якутии» (Новосибирск, 2007); Международной конференции «Состояние и перспективы диагностики инфекционных болезней животных» (Алма-ты, 2008); Международной научно-практической конференции «Развитие АПК азиатских территорий» (Новосибирск, 2008); Международной научно-практической конференции «Научные основы производст ва биологических препаратов» (Щелково, 2009); 7-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию ветеринар ной науки Кубани «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); ХIV Международной конференции «Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Красноярск, 2011); ХI Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2012); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012); Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ. (г. Покров, Владимирской области, 2014); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2017» (Москва, 2017).
1.7 Публикация результатов исследований. По теме диссертации
опубликована 41 печатная работа в научных журналах и материалах научно-
практических конференций, из них 16 публикаций в изданиях из Перечня
ведущих рецензируемых научных журналов ВАК РФ, 3 публикации в рос
сийских и иностранных журналах, индексируемых в базе данных Scopus, а
также получено 8 патентов РФ.
-
Структура и объем работы. Работа изложена на 434 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Диссертация проиллюстрирована 48 таблицами и 24 рисунками. Список литературы включает 597 источник, в том числе 467 зарубежных авторов.
-
Методология и методы исследований. Методология исследований включает стандартные процедуры с использованием методов молекулярной биологии (ПЦР, рестрикционный анализ, секвенирование), вирусологии (культивирование и выделение вирусов ИРТ и ВД-БС КРС), бактериологии
(выделение и типирование бактерий P. multocida и M. haemolytica), серологических методов исследования (реакция микронейтрализации в культуре клеток), методов исследования проб биологического материала от крупного рогатого скота и лабораторных животных, изолятов вирусов и бактерий со статистической обработкой полученных данных.
1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Результаты разработки и применения диагностических тест-систем на основе ПЦР для выявления вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС в экспериментальных и производственных условиях, а также теоретическое обоснование, разработка и изучение эффективности мультиплексной ПЦР в классическом и Real-time-форматах с гибридизационно-флюоресцентной детекцией для выявления и генетической типизации бактерий семейства Pasteurellaceae.
-
Результаты изучения генетического полиморфизма вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, распространение и частота выявления отдельных генетических типов и их роль в этиологии респираторных болезней в различных категориях молочных хозяйств Сибири.
-
Результаты типирования культур бактерии семейства Pasteurellaceae по генам, ассоциированным с патогенностью для крупного рогатого скота (omph, tbpa, pfha, hgbb для P. multocida и lkta для M. haemolytica), частота выявления этих генов или их аллельных вариантов, связь с капсульной группой, патогенностью для белых мышей, теоретическое обоснование влияния на антигенные свойства культуры и взаимосвязь с резистентностью к антибиотикам.